用于检测玉米不透明表型突变体5512G的分子标记及其应用

摘要

本发明涉及玉米中一个新高赖氨酸基因的分子标记及其应用，该分子标记是InDel分子标记——4.9和5.7，均可通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，见SEQ ID NO：1所示的碱基序列。利用这个与5512G基因完全连锁的分子标记能对玉米任何时期和任何组织的DNA进行基因型鉴定，检测杂交育种子代各单株中5512G基因的存在与否以及杂合或纯合状态。同时，利用这个分子标记能区分突变体与22种国内主要育种亲本，能够在任何育种背景群体中准确检测到5512G基因的存在。这种检测方法的准确性高，操作简单，为利用5512G基因的DNA分子标记辅助育种提供重要的技术手段。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测玉米不透明表型突变体5512G的分子标记及其应用。 

技术背景

玉米（Zea mays  L.）是三大主要的粮食和饲料作物之一。据FAO统计，2001到2010年十年间，世界玉米的总产量稳居谷类作物之首，与其他两大主要谷类作物总产量差距逐年拉大；2010年，世界玉米总产量占所有谷类作物总产量的34%，而小麦和水稻分别占27%和28%。作为“饲料之王”，玉米对畜牧业和养殖业的发展具有举足轻重的作用，这就对玉米的营养成份和蛋白品质的改良提出了更高的要求。 

然而普通玉米籽粒缺乏必需氨基酸，如赖氨酸和色氨酸等，蛋白品质较差，长期单一食用会造成严重营养不良。因此，全世界科学家和育种专家对玉米蛋白品质改良进行了大量研究。其中最著名的玉米高赖氨酸突变体是opaque2（o2），研究表明，opaque2基因突变对赖氨酸增幅可达普通玉米的2倍以上。但是o2突变体也产生了一些不良的农艺性状，如胚乳粉质、籽粒容易感染病虫害等等，不利于直接用于农业生产。而且，由于o2是隐性基因，加大了育种和制种的难度。因此，以o2为基础进行改良的高赖氨酸玉米至今所显示出来的市场竞争力还很弱。 

要获得高性价比的优质蛋白玉米，需要在从基因根本入手，去寻找其他不同的高赖氨酸突变体。经过多年研究，科学家们也陆续发现了多个高赖氨酸的突变体。opaque7是另一种高赖氨酸突变体，它与o2一样是纯合隐性突变体，对赖氨酸的增幅也不如o2明显，但由于机制上和o2不同，可以通过叠加获得更好的效果，因此在育种上也有一定的前景。Floury2是一种半显性高赖氨酸突变体，它也能显著提高赖氨酸含量，与o2、o7不同的是，其半显性遗传的特性也降低了育种难度。 

显性或半显性基因突变体所携带的优良性状在F1代就能够显现出来，并不要求遗传上的稳定性，杂交一代就可直接用于生产，有着隐性突变无法企及的育种优势，不仅育种时间上大大缩短了，而且F1带具有杂种优势，杂种玉米在长势、生活力、繁殖力、抗逆性和产量等方面都优于亲本。因此在实际的生产育种上有更强的优势。目前的高赖氨酸玉米突变体，从其表型上来看具有不透明或粉质的特性，称为opaque或Floury突变体。 

来源于美国玉米遗传种质中心中仅有表型信息的不透明表型（opaque）突变体，编号5512G-o*-fox-12。5512G突变体玉米籽粒大小和野生表型没有显著性差异，在灯下观察是不透明的，籽粒横切可看到内部粉质。5512G基因遗传上是半显性的，纯合隐性突变体（5512G/5512G）完全不透光，内部也是完全的粉质，而杂合子（5512G/+）则在边缘处呈现出一定的透光部分，籽粒横切之后可看到边缘有少部分和野生型（+/+）一样的玻璃状透明胚乳，籽粒的中间仍有大部分的粉质（见图1）。 

用纯合5512G和玉米常用自交系W22进行杂交，获得的F1种子进行自交得到F2棒子（见图2，图中用+表示w22，+也可以代表任何5512G基因正常的玉米品系），其突变体不透明表型、杂合表型和野生表型的分离比是1:2:1。通过对F2群体中突变表型群体进行基因定位，并和已知opaque和floury突变体进行等位测试，证明它并不是任何一种已知的opaque或者floury突变体，是一个新的不透明突变体。 

对同一个F2棒子上的不透明突变表型和野生型表型籽粒进行研究，表明在蛋白水平上，5512G突变体、杂合子与其相应的野生型相比，籽粒总蛋白含量没有显著性变化，醇溶蛋白含量有所下降（见图3）；在氨基酸水平上，突变体纯合子每毫克粉末的赖氨酸(lysine)含量和野生型比较升高了45.70%，杂合子每毫克粉末的赖氨酸(lysine)含量和野生型比较升高了28.61%（见图4）。也就是说，如果用5512G作为其中一个亲本，无论另一个亲本是什么，F1代种子都具有高赖氨酸的优良性状。目前为止，没有观察到5512G突变体有o2突变体常见的诸如抗虫抗病能力下降等不良农业性状。如能通过杂交选育克服5512G突变体胚乳粉质和柔软的弱点。和其它高赖氨酸突变体之间互相杂交选育，更有望能获得高赖氨酸的叠加性状，进一步提高籽粒的赖氨酸含量。5512G突变体的有效利用有助于培育出高赖氨酸含量的优质蛋白玉米新品种，有十分广阔的应用前景。 

DNA分子标记辅助育种是一项新的育种技术，该技术是通过利用与目标性状基因紧密连锁的DNA分子标记对控制目标性状的基因进行间接选择的现代育种技术。该技术能在分子水平跟踪目标基因的转移，与常规育种相比，该技术可提高育种效率2-3倍。 

为了尽快展开相关的育种研究，加速育种进程，提高育种效率，需要获取能用于检测玉米不透明表型突变体5512G基因的分子标记。 

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种用于检测玉米不透明表型5512G突变体的分子标记。 

本发明的目的之二在于提供在检测和区分玉米育种过程中杂交亲本以及它们杂交子代类型中的应用。 

为达到上述目的，本发明采用如下技术方按： 

一种用于检测玉米不透明表型突变体5512G的分子标记，其特征在于该分子标记是通过PCR扩增特异性引物，得到的一对与该突变基因紧密连锁的共显性DNA分子标记，扩增第一个分子标记DNA片断的特异性引物的碱基序列为：

正向引物从5′端至3′端为：GCTCTTGTCGTCGAAGGAGAT；

反向引物从5′端至3′端为：CGTGGTTGACCTTGATTGCC；

扩增第二个分子标记DNA片断的特异性引物的碱基序列为：

正向引物从5′端至3′端为：CCGCTCTACCCTACGCTTTT；

反向引物从5′端至3′端为：ATTGGGAAGCCACAAGTCCA。

   一种上述的分子标记在检测和区分玉米育种过程中杂交亲本以及它们杂交子代类型中的应用。 

本发明的分子标记是对控制玉米籽粒高赖氨酸含量农艺性状的5512G基因进行DNA分子标记辅助育种的基础。本发明利用半显性高赖氨酸玉米（5512G/5512G）与其他具优良性状的玉米杂交获得F1代，F1代自交后筛选具有目的性状的半显性高赖氨酸玉米F2，F2代多次自交，最终获得稳定的纯合体（参见图2）。 

本发明提供一对与其紧密连锁的共显性DNA分子标记，以及利用这对共显性DNA分子标记对5512G基因进行分子标记辅助选择的方法。利用这对分子标记能对玉米任何时期和任何组织的DNA进行基因型鉴定，检测杂交育种子代各单株中5512G突变体基因是否存在，及其杂合或纯合状态。利用这个分子标记能区分突变体与多种主要育种亲本，能够在多个育种背景群体中准确检测到5512G突变体基因的存在。这种检测方法的准确性高，操作简单，为利用5512G基因的DNA分子标记辅助育种提供重要的技术手段。 

附图说明

图1玉米籽粒突变体纯合子（5512G/5512G）、杂合子（5512G/+）和野生型（+/+）表型图； 

图2进行5512G基因定位的F2群体构建技术路线； 

图3 5512G突变体的F2棒子中野生型（+/+）、杂合子（o/+）和突变体纯合子（o/o）籽粒中，每毫克籽粒粉末的总蛋白和醇溶蛋白的含量变化图；

图4 5512G突变体的F2棒子中野生型（+/+）、杂合子（o/+）和突变体纯合子（o/o）籽粒中，每毫克籽粒粉末的赖氨酸含量变化图；

图5第一个分子标记在F2群体中的opaque表型籽粒中的连锁情况，其中15号为交换单株；

图6第二个分子标记在和前面对应的opaque表型籽粒中的连锁情况，其中11号为交换单株；

图7本发明中分子标记在玉米四号染色体短臂上的示意位置，其中CEN4代表第四号染色体着丝粒，TEL代表端粒； 

图8第一个分子标记在22种国内不同育种自交系间的多态情况；+是野生型对照，o是5512G突变体对照；

图9第二个分子标记在22种国内不同育种自交系间的多态情况；+是野生型对照，o为5512G突变体对照。

具体实施方式

下面结合具体实施事例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆（Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.）或植物分子生物学－实验手册（Plant Molecular Biology－A Laboratory Manual, Melody S. Clark编， Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997）中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

实施例一：利用5512G突变体（5512G/5512G）培育显性高赖氨酸玉米 

由于5512G突变体与其相应的野生型相比赖氨酸(lys)含量升高了45.70％，参见图4，因此利用该基因与其他优良品种的杂交可以培育出高赖氨酸玉米。把5512G突变纯合体（5512G/5512G）与其他具有优良生产性状的玉米杂交，即可获得半显性的高赖氨酸杂合子，可直接获得高赖氨酸商品玉米。也可在F2代中分离出显性高赖氨酸玉米籽粒的隐性纯合体。隐性纯合体经多代自交，轮回选择，逐代选择籽粒发育好，赖氨酸含量高的种子，最终获得稳定的隐性纯合体，高赖氨酸自交系或群体，即获得高赖氨酸玉米品种。

实施例二： 共显性分子标记的获得及与5512G基因连锁关系的确定 

玉米籽粒纯合突变体（5512G/5512G）、杂合子（5512G/+）和野生型（+/+）表型图参见图1。通过纯合突变体（5512G/5512G）与纯合野生型（+/+）杂交获得F1（5512G/+），然后自交获得F2群体，参见图2。 F2群体中出现了基因型分离，包含+/+、5512G/+与5512G/5512G三种基因型，具有+/+基因型的籽粒均为非Opaque的野生型类型籽粒，具有5512G/+基因型的籽粒均为半Opaque的杂合类型籽粒，具有5512G/5512G基因型的籽粒为Opaque的突变体类型。

本发明通过构建的F2群体，提取纯合突变体、野生型以及F2群体各单株的基因组DNA，利用图位克隆的方法，通过筛选已有的SSR分子标记，获取有多态性并与表型进行连锁分析，首先将5512G基因定位在了玉米四号染色体短臂上，接下来进一步筛选SSR分子标记，将5512G基因定位在了经典遗传标记umc1758与 umc1288之间，然而这两个标记和5512G基因的连锁性并不十分紧密，在实际使用上仍有一定的问题。因此，我们根据umc1758与 umc1288之间已知的B73基因组序列（http://www.maizesequence.org/），自行开发InDel分子标记，同样进行多态分析和连锁分析，获得一个玉米新高赖氨酸基因的分子标记及其应用，扩增第一个分子标记4.9的DNA片断的特异性引物及碱基序列为： 

正向引物从5′端至3′端为：GCTCTTGTCGTCGAAGGAGAT；

反向引物从5′端至3′端为：CGTGGTTGACCTTGATTGCC；

扩增第二个分子标记5.7的DNA片断的特异性引物及碱基序列为：

正向引物从5′端至3′端为：CCGCTCTACCCTACGCTTTT；

反向引物从5′端至3′端为：ATTGGGAAGCCACAAGTCCA。

这两个分子标记经过聚合酶链式反应进行扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，获得了纯合突变体与纯合野生型亲本间的差异条带。分子育种中能够通过条带差异区分育种过程中杂交亲本（纯合5512G类型和纯合野生型类型）以及它们杂交子代（F1代）。 

以遗传学中两点与三点测验对这2个共显性分子标记与5512G基因的遗传连锁关系进行分析表明，5512G突变体基因位于这两个分子标记在玉米染色体上所确定的区间范围之内，并且两标记与突变基因紧密连锁（见图5和图6）。使用这对标记进行辅助选择准确度很高，在背景W22 和5512G产生的F2群体中，标记4.9的交换率为2.0×10^-2，标记5.7的交换率为2.0×10^-2，使用这两个标记确定5512G基因的错选率为0。 

实施例三：分子标记在不同亲本间的多态性鉴定 

提取5512G/5512G突变体，野生型和多种育种中广泛使用的自交系的基因组DNA，通过PCR反应分析在不同品种间的多态性。结果表明，4.9在5512G与CIMBL62、CIMBL146、By807、Ry732、P178、B73、SC55、JY01、Liao5263、TY5、7327、GEMS14都具有多态性（见附图8），5.7在5512G与CIMBL1、CIMBL62、CIMBL146、Zi330、S22、chuan48-2、CA47、Z2018F、05WN230、JY01、XZ698、Liao5263、TY5、Zheng28、DH29、B77、GEMS53都具有多态性（见附图9）。此结果证明，分子标记4.9和5.7能够在常见的多种育种背景群体中准确检测到5512G基因的存在。

实施例四：标记4.9和5.7对5512G基因分子标记辅助选择的方法 

在5512G单基因突变体中，通过表型能够很好地判断其基因型，但是在杂交育种中，如果和其他同样造成opaque表型的突变体进行杂交，其表型并不能完全代表5512G基因的基因型。因此，利用这两个共显性分子标记4.9和5.7可以鉴定5512G基因的基因型。分子标记4.9和5.7对某一杂交组合中的子代进行分析，两侧标记同为野生型（Mo17）类型条带植株的基因型即为野生型，两侧的分子标记同为杂合体（如F1）类型条带植株的基因型即为杂合体，两侧的分子标记同为5512G/5512G纯和突变体类型条带植株的基因型即为突变体。通过这两个分子标记对杂交育种时子代各个单株进行基因型鉴定的准确性很高，错选概率为0，所以这两种分子标记对利用5512G基因进行育种时具有重要的辅助作用。