溴苯腈还原脱卤酶基因簇bhbA2B2 及其应用

摘要

本发明公开了溴苯腈还原脱卤酶基因簇bhbA2B2及其应用，属于应用环境微生物学领域。本发明提供了除草剂溴苯腈及其腈水解产物3,5‐二溴4‐羟基苯甲酸还原脱卤酶基因簇，核苷酸序列为SEQ ID NO.5，主要由细胞膜结合受体蛋白基因bhbB2和溴苯腈还原脱卤酶基因bhbA2构成，其中含有序列为SEQ ID NO.1所示的溴苯腈还原脱卤酶基因，为新的还原脱卤酶基因资源。利用该基因簇构建的功能互补菌株Comamonas sp.2B‐bhbA2B2能表达还原脱卤酶，可用于土壤、水体和农作物上的溴苯腈及其腈水解产物的还原脱卤。

说明书

技术领域

本发明属于应用环境微生物领域，涉及溴苯腈还原脱卤酶基因簇bhbA2B2及其应用。 

背景技术

农药的使用虽然提高了农业的生产效率及作物产量，但同时带来严重的环境问题，造成生态失衡农产品品质下降，并直接影响人民的身体健康。溴苯腈(Bromoxynil)，化学名称为3,5-二溴-4-羟基苯甲腈，属有机氰化物，是一种具有传导活性的选择性苗后茎叶处理触杀型除草剂。根据最新《农药化学品》杂志通过对20世纪全球农药市场情况的调查总结表明，在20世纪农药革命的高潮中，应用最广和对全球农业影响最大的二十二种农药中，其中除草剂8种，而溴苯腈类就是这8种除草剂之一。溴苯腈于1963年被研究开发，1994年后逐步在我国推广应用。目前我国已成为全球溴苯腈主要的生产国，年产大约8000-10000吨。由于溴苯腈使用量大、范围广泛，在作物、地下水和土壤中残留，造成了严重的环境污染问题。随着人类环保意识的增强，溴苯腈及其代谢产物污染的修复引起了人们的广泛关注。微生物修复农药污染的方法一种简单、高效、廉价和无二次污染的方法，比化学方法、物理方法修复农药污染具有很多优势。微生物在农药残留的生物学解决途径中有着独特的作用。微生物降解修复农药的本质是微生物产生的酶对农药的降解作用，从微生物中提取的降解酶系来消除农药残留在国外已有成功的先例，降解酶的来源可以通过从降解菌中提取，也可以采用基因工程手段构建高效表达菌株来获得。溴苯腈脱卤酶基因的获得在溴苯腈及其代谢产物污染的修复领域有巨大的应用潜力。同时可通过基因改造扩大脱卤酶的作用底物范围，广泛应用于环境中卤代芳香烃类污染物的脱卤降解，保护环境。 

发明内容

本发明的目的是提供除草剂溴苯腈及其腈水解产物的还原脱卤酶基因簇bhbA2B2。 

本发明的另一目的是提供除草剂溴苯腈及其腈水解产物的还原脱卤酶基因簇编码的蛋白质BhbA2B2。 

本发明的又一目的是提供该基因簇bhbA2B2的应用。 

本发明的目的可通过如下技术方案实现： 

溴苯腈还原脱卤酶基因簇bhbA2B2，其核苷酸序列为SEQ ID NO.5，主要由细胞膜结合受体蛋白基因bhbB2和溴苯腈还原脱卤酶基因bhbA2构成。 

一种溴苯腈还原脱卤酶基因bhbA2，核苷酸序列为SEQ ID NO.1。该基因全长（从起始密码子到终止密码子）为3216bp，G+C含量为57.93%，编码1071个氨基酸；其氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。 

一种细胞膜结合受体蛋白基因bhbB2，核苷酸序列为SEQ ID NO.3。该基因全长（从起始密码子到终止密码子）为993bp，G+C含量为60.53%，编码330个氨基酸，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.4。 

含有本发明所述溴苯腈还原脱卤酶基因簇的重组质粒pBBR1MCS2-bhbA2B2。 

溴苯腈还原脱卤酶基因簇片段与BamHI和XbaI酶切好的pBBR1MCS2进行酶连获得溴苯腈还原脱卤酶基因簇的重组质粒pBBR1MCS2-bhbA2B2。 

含有本发明所述的重组质粒的重组微生物Comamonas sp.2B-bhbA2B2。 

将酶连好的重组质粒pBBR1MCS2-bhbA2B2，通过三亲接合转化到受体菌株Comamonas sp.2B中，获得重组微生物Comamonas sp.2B-bhbA2B2。 

上述溴苯腈还原脱卤酶基因簇、含有该基因簇的重组质粒及重组微生物可以在农作物、土壤、水体的溴苯腈及其腈水解产物残留去除方面得到应用。 

其所涉及的溴苯腈还原脱卤酶蛋白和细胞膜结合受体蛋白可以在农作物、土壤、水体的溴苯腈及其腈水解产物残留去除方面应用。 

有益效果 

1.从丛毛单胞菌菌株Comamonas sp.7D-2（从溴苯腈污染土壤中分离筛选获得的溴苯腈降解菌株，其16S rRNA基因序列的GenBank登录号为JX455142，专利菌种保藏编号为CGMCC No.6931）中提取出溴苯腈降解野生型大质粒，并通过454高通量测序获得溴苯腈还原脱卤酶基因簇bhbA2B2。 

2.将溴苯腈还原脱卤酶基因簇(bhbA2B2)插入到广宿主载体pBBR1MCS2（购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，货号Biovector-102762）获得重组质粒pBBR1MCS2-bhbA2B2，通过三亲接合的方法将重组质粒pBBR1MCS2-bhbA2B2转化到野生型大质粒丢失的无还原脱卤能力的突变株Comamonas sp.2B中，获得功能互补菌株Comamonas sp.2B-bhbA2B2。 

3.功能互补菌株Comamonas sp.2B-bhbA2B2具有溴苯腈及其腈水解产物的还原脱卤功能，在60h内对0.2mM的溴苯腈的还原脱卤效率为86.4%，对0.2mM溴苯腈腈水解产物3,5-二溴4-羟基苯甲酸在18h内的还原脱卤效率为100%。 

4.利用该基因簇构建的功能互补菌株能表达溴苯腈及其代谢产物的还原脱卤酶，生产的酶制 剂可用于土壤、水体和农作物残留的溴苯腈及其代谢产物的去除。 

附图说明

图1溴苯腈还原脱卤酶基因簇bhbA2B2所在的基因位置 

图2溴苯腈还原脱卤酶基因簇在突变株Comamonas sp.2B中功能表达实验方案图 

图3野生菌株Comamonas sp.7D-2和突变株Comamonas sp.2B中的质粒电泳图谱 

图4功能互补株Comamonas sp.2B-bhbA2B2和突变株Comamonas sp.2B对溴苯腈的脱卤效果 

图5功能互补株Comamonas sp.2B-bhbA2B2和突变株2B对3,5-二溴4-羟基苯甲酸的脱卤效果 

生物样品保藏信息 

7D-2，分类命名为丛毛单胞菌菌株Comamonas sp.，2012年12月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.6931。 

具体实施方式

实施例1溴苯腈还原脱卤酶基因簇的克隆 

1.1Comamonas sp.7D-2中野生型大质粒的提取 

丛毛单胞菌Comamonas sp.7D-2（从溴苯腈污染土壤中分离筛选获得的溴苯腈降解菌株，其16S rRNA基因序列的GenBank登录号为JX455142，专利菌种保藏编号为CGMCC No.6931）大量培养后，采用碱裂解法提取较高纯度的丛毛单胞菌7D-2的野生型大质粒pBHB的DNA，溶于TE(pH8.0)缓冲液中，置于-20℃保藏，具体方法参考F·奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》。 

1.2通过454高通量测序方法对野生型大质粒进行测序，获得119kb的核苷酸序列，获得溴苯腈还原脱卤酶基因簇bhbA2B2，序列为SEQ ID NO.5，其中包含序列如SEQ ID NO.1所示的还原脱卤酶基因bhbA2及其上游的序列如SEQ ID NO.2所示的细胞膜结合受体蛋白基因bhbB2。1.3广宿主载体质粒pBBR1MCS2（购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，货号Biovector-102762）。 

1.4溴苯腈还原脱卤酶基因簇bhbA2B2的扩增 

扩增体系： 

引物1的序列为5’-gcaggatccacagcaagctaatgcaacac-3’（SEQ ID NO.6）； 

引物2的序列为5’-gcatctagattagaggttgagaacgatct-3’（SEQ ID NO.7）。 

PCR扩增程序： 

98℃变性2min；98℃变性10sec，57℃退火15sec，68℃延伸3.5min，进行30 

个循环；68℃延伸10min，冷却到室温。 

1.5PCR产物纯化回收 

采用捷瑞生物公司提供的PCR产物纯化试剂盒回收PCR产物。 

1.6酶切 

PCR产物分别用TaKaRa公司的限制性内切酶BamHI和XbaI酶切。酶切产物纯化回收（方法如1.5）。 

1.7酶连 

建立如下反应体系: 

16℃温育12h。 

1.8制备大肠杆菌DH5α高效感受态细胞 

具体方法参照F.奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》P22-23。 

1.9转化 

取10μl酶连产物转化200μl大肠杆菌DH5α感受态细胞，具体方法参照F.奥斯伯等编 的《精编分子生物学实验指南》P23。涂布含有50mg/kg的卡那霉素的LB平板，培养24h候挑取克隆子，提取质粒验证，获取阳性克隆子。 

1.10野生菌株Comamonas sp.7D-2中大质粒的消除获得突变株Comamonas sp.2B 

将野生菌株Comamonas sp.7D‐2在不含有溴苯腈农药的LB平板上连续划线传代培养10次，挑取第10代平板上的单菌落至LB试管培养，然后收集菌体，按照上述1.1的方法提取质粒，电泳观察质粒的有无，从中挑取野生型大质粒丢失的菌株（图3），再次验证其有无降解溴苯腈的能力，如果溴苯腈降解能力丢失则确定为获得的质粒丢失的突变株，命名为Comamonas sp.2B，送交CGMCC保藏，保藏编号为CGMCC No.7100）。 

1.10三亲接合 

分别培养受体菌株Comamonas sp.2B(CGMCC No.7100，庆大霉素抗性Gmr，菌株Comamonas sp.7D-2的大质粒丢失的菌株)，辅助菌株E.coli HB101（购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，含pRK2013质粒,卡那霉素抗性Km^r），供体菌株E.coli DH5α（含pBBR1MCS2-bhbA2B2），至OD_600nm为0.8。分别各取1ml菌液离心，收集并且洗涤菌体2次。将不含抗生素的3种菌体混合后点在硝酸纤维素半透膜上30℃过夜培养，将半透膜上的菌体洗下来涂布至含有卡那霉素和庆大霉素的双抗平板上30℃培养，挑取阳性转化子，检测还原脱卤能力。 

1.11功能互补株Comamonas sp.2B-bhbA2B2的对溴苯腈及其腈水解产物的还原脱卤效率 

将功能互补株Comamonas sp.2B-bhbA2B2接种至200ml LB培养基中（含80mg kg^-1庆大霉素抗性和50mg kg^-1卡那霉素），30℃摇床培养至对数后期（OD_600nm约为0.8），离心收集菌体，用去离子水洗涤菌体2次，然后加入20ml去离子水重悬菌体。将重悬后的菌体按5%的接种量分别接到100ml含有0.2mM的溴苯腈和溴苯腈腈水解产物3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的三角瓶中，30℃静止培养，间隔取样，分别用液相法测定底物浓度（溴苯腈和3,5-二溴-4-羟基苯甲酸）和滴定法测定溴离子的浓度。实验重复3次。突变株Comamonas sp.2B作为对照，除培养过程中不含卡那霉素外，其余操作步骤和功能互补株Comamonas sp.2B-bhbA2B2一致。 

结果表明功能互补株Comamonas sp.2B-bhbA2B2对溴苯腈及其腈水解产物3,5-二溴4-羟基苯甲酸具有显著的还原脱卤效果，而对照菌株Comamonas sp.2B未见还原脱卤能力（见图4和图5）。在60h内，功能互补株Comamonas sp.2B-bhbA2B2将0.2mM的溴苯腈降解为0.027mM，其脱卤效率为86.4%，释放出约0.31mM溴离子；功能互补株Comamonas sp. 2B-bhbA2B2在18h能将0.2mM的3,5-二溴4-羟基苯甲酸完全降解，脱卤效率为100%，释放出约2倍3,5-二溴4-羟基苯甲酸当量的溴离子（0.39mM），表明功能互补株Comamonas sp.2B-bhbA2B2对3,5-二溴4-羟基苯甲酸的还原脱卤效率明显高于溴苯腈，3,5-二溴4-羟基苯甲酸是还原脱卤酶的更好底物。