DNA-PKcs在制备改变肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用

摘要

本发明涉及DNA-PKcs在制备影响DHFR基因扩增改变肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用，属于生物医药。本发明通过建立MTX耐药细胞进化模型，选取低浓度耐药（HSRs）和高浓度耐药（DMs）细胞为研究对象,检测亲本细胞及耐药细胞中的基因扩增程度和形式、DNA损伤情况及DNA-PKcs的表达情况，进而针对NHEJ途径的核心蛋白DNA-PKcs，在MTX耐药细胞中建立稳定干扰DNA-PKcs的克隆，检测稳定干扰克隆之中DHFR基因的扩增程度和扩增形式、细胞的生长、凋亡和耐药性的变化。

说明书

技术领域

本发明涉及DNA-PKcs在制备改变肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用， 具体涉及DNA-PKcs在制备影响DHFR基因扩增进而改变肿瘤细胞对MTX耐药性 的药物中的应用，属于生物医药领域。

背景技术

氨甲蝶呤（Methotrexate,MTX）是恶性肿瘤治疗中的第一个有效的抗代谢药， 是目前肿瘤治疗中应用最广泛的叶酸拮抗剂，能竞争性地结合二氢叶酸还原酶 (Dihydrofolatereductase,DHFR)，抑制核苷酸代谢，从而阻断DNA的合成、特异性 地杀伤增殖期细胞。虽然MTX已成为肿瘤治疗的常用药物，但是，由于长时间的 用药会导致耐药性的产生，从而严重影响药物的疗效，所以如何克服MTX耐药是 提高其肿瘤治疗效率的主要问题。

MTX耐药分为先天耐药和获得性耐药。其中MTX获得性耐药的机制可以概 括为以下三类：第一、还原性叶酸载体（Reduced folate carrier,RFC）的缺失或功能 缺陷致使MTX的摄入量减少；第二、胞内多聚谷氨酸合成酶（Folylpolyglutamate  synthetase,FPGS）活性下降或表达降低导致氨甲蝶呤多聚谷氨酸化水平下降，产生 耐药；第三、MTX的靶酶DHFR水平升高也会导致耐药，通常这种情况的出现有 以下几个原因，其一是DHFR基因突变从而使DHFR对MTX的亲和力降低，其 二是DHFR表达增强，通常是由DHFR基因扩增引起的。

基因扩增是指细胞内部某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象，是基因组不 稳定性的一种主要形式。扩增的基因通常存在于两种遗传结构上，即染色体外元件 双微体（Double minutes,DMs）及染色体上的异常结构均质染色区（Homogeneous  staining regions,HSRs）。双微体是染色体外成对环状，能自主复制的染色小体。1962 年，人们首次在结肠癌细胞中发现双微体。双微体没有着丝粒，在细胞分裂中随机 分布，正因为如此，双微体随时面临着丢失的风险。但是，如果双微体本身带有的 扩增基因或者与耐药相关的基因能为细胞本身提供生长优势，则会出现双微体在群 体中逐渐增多的现象。人们最早发现均质染色区是在人神经母细胞瘤细胞系及耐 MTX的中国仓鼠细胞系中。人们应用G显带技术发现一段缺乏典型带纹的染色体 片段，并称其为均质染色区或异常显带区域。

过去的研究发现，无论是哪种基因扩增机制，都与DSBs有关。DSBs修复途 径在调节基因扩增的量中起到不可忽视的作用。在哺乳动物中，非同源末端连接修 复途径（NHEJ）在DSBs的修复过程中占据主导地位。

NHEJ途径的成员包括：DNA末端Ku结合复合物、DNA依赖的蛋白激酶 DNA-PKcs、DNA末端处理酶（例如：Artemis）和XRCC4-Lig4复合物等，当细 胞面临药物选择压力时，NHEJ途径促使细胞耐受压力继续存活，而通路中最主要 的分子DNA-PK发挥着核心作用。

文献报道：在肿瘤耐受放、化疗的过程中，DNA-PKcs可以通过诱导基因组不 稳定促进细胞生存，产生耐受表型。虽然目前尚没有DNA-PKcs导致基因扩增的 报道，但是，基因扩增是基因组不稳定的主要形式（包括HSRs和DMs）。因此， 发明人猜想，在MTX耐药过程中DNA-PKcs可能通过修复MTX压力引起的DSB， 引起DHFR基因的大量扩增，进而使细胞获得耐药表型。因此，本发明针对 DNA-PKcs进行靶向性抑制，结果观察到抑制DNA-PKcs可以去除扩增的DHFR 基因，逆转肿瘤耐药表型，为肿瘤治疗提供新的靶点，为有效地对抗MTX耐药提 供科学依据。

发明内容

针对肿瘤治疗药物MTX在治疗过程中常常产生耐药而导致化疗失败甚至疾病 复发的现象，本发明提供了一种DNA-PKcs在制备影响DHFR基因扩增改变肿瘤 细胞对MTX耐药性的药物中的应用。

本发明的技术方案是构建人结肠癌细胞系HT29耐MTX的进化模型，检测 DNA-PKcs在肿瘤细胞耐药过程中是否发挥作用。然后，将DNA-PKcs shRNA和 Control shRNA分别转入低度耐药细胞（基因扩增以HSRs形式存在）和高度耐药 细胞（基因扩增以DMs形式存在）中，获得稳定转染克隆。应用MTT、IC₅₀分析、 流式细胞术、Realtime PCR、FISH等方法，检测转染前后的各个细胞生长、耐药、 凋亡、基因扩增程度及形式的变化情况。明确DNA-PKcs介导的DNA损伤修复过 程是否通过促进基因扩增参与肿瘤耐药过程，抑制DNA-PKcs是否可以去除扩增 的基因，达到逆转耐药的作用。最后，DNA-PK抑制剂NU7026短期作用于耐药细 胞，并进行FISH微核分析，明确扩增的基因是否以微核外排的形式去除。

发明人通过稳定干扰NHEJ通路的核心蛋白DNA-PKcs，以阻断NHEJ修复途 径的作用，探讨NHEJ修复途径与基因扩增的关系，从而为揭示新的治疗靶点、更 加有效对抗MTX耐药提供科学的依据。分别对低度耐药细胞（HSRs）和高度耐 药细胞（DMs）进行研究，试图分析抑制DNA-PKcs对HSRs和DMs形式的基因 扩增是否具有相同的作用，从而为个体化治疗提供确切的依据。

1.细胞培养构建进化模型

人结肠癌细胞系HT29在含有质量分数为15%的胎牛血清的DMEM高糖培养 基中，于体积分数为5%的CO₂、37℃条件下，逐步递增MTX的浓度梯度连续培 养，筛选出一系列HT29MTX耐药细胞，并根据其对MTX的耐受程度命名为HT29  10^-7mol/L MTX，HT29 10^-6mol/L MTX，HT29 10^-5mol/L MTX，HT29 10^-4mol/L MTX。待每个浓度梯度细胞对相应药物浓度耐受后，继续培养5个月直至其稳定 耐药，以备后续试验。

2.HT29 MTX敏感及耐药细胞中DHFR基因扩增程度及扩增形式的变化

（1）应用QIAmp DNA mini kit试剂盒并按照说明书提供的实验步骤进行所需 细胞系基因组DNA的提取，应用Real-time PCR技术分别检测HT29 MTX敏感及 耐药细胞中DHFR基因的扩增程度。与HT29 MTX敏感细胞相比，HT29 MTX耐 药细胞中DHFR基因扩增程度随着MTX耐药浓度升高而增加。

（2）细胞中期核型标本制备，FISH检测DHFR基因扩增形式的变化

与HT29 MTX敏感细胞相比，HT29 MTX耐药细胞中DHFR基因扩增的形式 由HSRs逐步转变为HSRs与DMs共存的方式。

3．HT29 MTX敏感及耐药细胞中DHFR蛋白表达水平的变化

提取细胞总蛋白，应用Western Blotting方法检测HT29 MTX敏感及耐药细 胞中DHFR蛋白表达水平。与HT29 MTX敏感细胞相比，HT29 MTX耐药细胞中 DHFR蛋白表达水平随着MTX耐药浓度升高而逐渐增加。

4．NHEJ相关蛋白的表达分析

提取细胞总蛋白，应用Western Blotting方法检测Ku70、Ku86、DNA-PKcs、 XRCC4、DNA LigⅣ在HT29 MTX敏感及耐药细胞中的表达变化。与HT29 MTX 敏感细胞相比，HT29 10-5mol/L MTX耐药细胞中NHEJ途径相关蛋白DNA-PKcs、 XRCC4表达增加；HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞中NHEJ途径相关蛋白 DNA-PKcs、XRCC4及Ku86过表达。

5．HT29 MTX敏感及耐药细胞中DNA-PKcs的mRNA表达水平差异

用总RNA提取试剂TRIzol Reagent，按说明书提供方法提取HT29 MTX敏感 及耐药细胞的总RNA。利用Transcriptor Eirst strand cDNA Synthesis Kit（Roche） 试剂盒按说明书将提取的细胞总mRNA逆转录为cDNA.应用Real-time PCR方 法，以HT29 MTX敏感及耐药细胞的cDNA为模板，分析DNA-PKcs基因在 mRNA水平上的差异。在HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞中，DNA-PKcs mRNA表 达水平为其在HT29 MTX敏感细胞中表达水平的1.61倍，确定我们可以通过RNAi 方法建立稳定干扰DNA-PKcs的克隆。

6．稳定干扰DNA-PKcs的HT29 10^-5mol/L和HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞 克隆的建立

确定HT29 10^-5mol/L和HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞对嘌呤霉素的敏感性， 选择适当的嘌呤霉素浓度作为稳定转染时的药物筛选浓度。将处于对数生长期的 HT29 10^-5mol/L和HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞接种于6孔板中，每孔细胞3×10⁵个。待细胞长至融合率为70%～80%时，进行稳定转染。细胞转染分两组进行：第 一组转染质粒pSUPER-DNAPKcs；第二组转染质粒pSUPER-sis。培养24h后，加 入适当浓度的嘌呤霉素。在培养过程中，大部分细胞皱缩死亡，只有少数细胞存活， 换液，继续培养，直至存活细胞开始增殖并逐渐形成单克隆。当形成的克隆达到肉 眼可见大小的时候，进行克隆挑取。将HT29 10^-5mol/L MTX耐药细胞对照组克隆 命名为Con，干扰组两个克隆分别命名为Si1、Si2。HT29 10^-4mol/L MTX耐药细 胞对照组克隆命名为Con，干扰组三个克隆分别命名为Si1、Si2、Si3。

7．检测DNA-PKcs蛋白质表达情况鉴定稳定干扰克隆的干扰效果

提取细胞总蛋白，应用Western Blotting方法检测DNA-PKcs在HT29  10^-5mol/L和10^-4mol/L MTX耐药细胞的对照克隆及干扰DNA-PKcs的克隆中的表 达情况。在HT29 10^-5mol/L MTX耐药细胞中，Si2干扰效果优于Si1；在HT29  10^-4mol/L MTX耐药细胞中，干扰效果从强到弱依次为Si2、Si1、Si3。

8．稳定干扰DNA-PKcs对DSBs的产生及细胞功能的影响

（1）免疫荧光通过间接地检测γH2AX Foci来确定细胞中DSBs的多少，以 检测干扰DNA-PKcs对DSBs的产生的影响；

与对照相比，干扰DNA-PKcs的克隆中，γH2AX Foci明显增多，表明干扰 DNA-PKcs后，来不及修复的DSBs明显增多，进一步说明在降低DNA-PKcs的表 达导致NHEJ修复途径发生了功能障碍。

（2）MTT法绘制生长曲线检测干扰DNA-PKcs对细胞生长的影响；

与对照相比，干扰DNA-PKcs后细胞生长减慢，其中干扰效果最好的克隆生 长最慢，说明降低DNA-PKcs的表达导致细胞的增殖能力下降。

（3）流式细胞仪检测干扰DNA-PKcs对细胞凋亡的影响；

与对照相比，干扰DNA-PKcs后的克隆中，细胞早期凋亡比例明显增加，说 明降低DNA-PKcs的表达导致HT29 MTX耐药细胞抗调亡能力下降。

（4）MTT法检测干扰DNA-PKcs对细胞耐药性的影响；

通过MTT法检测药物半致死浓度并计算细胞耐药指数，分析干扰 DNA-PKcs对耐药细胞的MTX药物敏感性的影响。与对照相比，在HT29 MTX 耐药细胞中MTX对干扰DNA-PKcs的克隆的半数抑制浓度（IC₅₀）都降低了2倍 以上，说明降低DNA-PKcs的表达导致HT29 MTX耐药细胞对MTX的药物敏感 性升高。

9．干扰DNA-PKcs对基因扩增及其相应蛋白表达情况的影响

（1）以HT29 10^-5mol/L和HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞干扰DNA-PKcs 克隆及对照细胞的DNA为模板，应用Real-time PCR技术分析干扰DNA-PKcs 对DHFR基因扩增程度的影响，β-ACTIN作为内参对照基因。

降低DNA-PKcs的表达导致HT29 10^-5mol/L MTX耐药细胞中DHFR基因扩增 程度未发生明显改变，导致HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞中DHFR基因扩增程度 下降。

（2）HT29 10^-5mol/L和HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞干扰DNA-PKcs克隆 及对照细胞中期核型标本制备，FISH检测干扰DNA-PKcs对DHFR基因扩增形 式的影响。

稳定干扰DNA-PKcs后，HT29 10^-5mol/L MTX耐药细胞中DHFR基因扩增形 式未发生明显改变，HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞中DHFR的扩增形式由以DMs 为主转变为以HSRs为主。

（3）以HT29 10^-5mol/L和HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞干扰DNA-PKcs克 隆及对照细胞的DNA为模板，应用Real-time PCR技术分析干扰DNA-PKcs对 XRCC4、MSH3、ZFYVE16等其它基因扩增程度的影响，前期实验结果显示： 这些基因可能位于DMs上或DMs附近。

与对照相比，干扰DNA-PKcs后的克隆中，MSH3、ZFYVE16基因扩增程度 明显降低，证明了降低DNA-PKcs的表达导致HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞的基 因扩增程度降低。

（4）提取细胞总蛋白，应用Western Blotting方法检测HT29 10^-5mol/L和 HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞干扰DNA-PKcs克隆及对照细胞中DHFR蛋白及 XRCC4、MSH3、ZFYVE16等其它蛋白的表达情况。

与对照相比，干扰DNA-PKcs的克隆中，MSH3、ZFYVE16、XRCC4等蛋白 的表达水平未发生明显变化。

10.干扰DNA-PKcs对微核的产生和微核外排的影响

HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞干扰DNA-PKcs克隆及对照细胞中期核型标本 制备，FISH检测微核外排DHFR情况。

在干扰DNA-PKcs并形成稳定克隆之后，以微核形式外排的DHFR减少。

11．HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞在DNA-PK复合物特异性抑制剂短期作用 下以微核形式外排的DHFR的情况

取生长状态良好的HT29 10^-4mol/L MTX细胞，以每孔30万的细胞种在6 孔板中。第二天更换新鲜培养基，并加入终浓度为10^-4mol/L的MTX及终浓度 为10μmol/L的NU7026。作用24h后，换只加MTX的培养基继续培养3天。第三 天进行中期核型制备。随后用FISH方法分析NU7026短期作用HT29 10^-4mol/L  MTX耐药细胞对以微核形式外排DHFR的影响。

NU7026处理后的HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞，与DMSO处理后的对照相 比，通过微核外排的DHFR增多，也进一步证明了DHFR基因扩增程度降低是通 过DHFR以微核形式外排实现的。

本发明取得的有益效果：

本发明的方法为以MTX为主要治疗药物且易产生耐药性的恶性肿瘤的生物治 疗提供新的靶向性治疗方案，为有效地对抗MTX耐药提供了科学的依据。针对 MTX耐药且DHFR基因高度扩增的恶性肿瘤细胞，特异性地抑制NHEJ通路的关 键蛋白DNA-PKcs，能够降低基因扩增程度、减少细胞内的双微体，从而降低肿瘤 细胞的恶性程度、逆转肿瘤耐药，提高肿瘤治疗的效率。此外，分别在低度耐药和 高度耐药细胞中针对基因扩增机制进行研究，还可以实现肿瘤耐药的个体化治疗。 更重要的是，这种基因扩增去除机制可能适用于多种不同药物引起的耐药。本发明 对于深入了解化疗耐药的本质以及寻找个体化治疗的耐药靶点都有非常积极的意 义。

附图说明

图1是HT29 MTX敏感及耐药细胞中DHFR基因扩增程度变化的实时定量 PCR柱状图；

图2是HT29 MTX敏感及耐药细胞中DHFR基因扩增形式变化的荧光原位杂 交图；

图3是HT29 MTX敏感及耐药细胞中DHFR蛋白表达水平变化的western  boltting图；

图4是NHEJ途径相关蛋白在HT29 MTX敏感及10^-5mol/L MTX耐药细胞中 的表达情况的Western Blotting图；

图5是NHEJ途径相关蛋白在HT29 MTX敏感及10^-4mol/L MTX耐药细胞中 的表达情况的Western Blotting图；

图6是DNA-PKcs在HT29 MTX敏感及10^-4mol/L MTX耐药细胞中mRNA的 差异表达的实时定量PCR柱状图；

图7是鉴定HT29 10^-5mol/L MTX耐药细胞稳定干扰克隆的干扰效果的 Western Blotting图；

图8是鉴定HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞稳定干扰克隆的干扰效果的 Western Blotting图；

图9是干扰DNA-PKcs导致γH2AX Foci增多的免疫荧光图；

图10是干扰DNA-PKcs导致HT29 10^-5mol/LMTX耐药细胞增殖能力下降的 细胞生长曲线图；

图11是干扰DNA-PKcs导致HT29 10^-4mol/LMTX耐药细胞增殖能力下降的 细胞生长曲线图；

图12是HT29 10^-5mol/LMTX耐药细胞中干扰DNA-PKcs后DHFR基因扩增 程度的实时定量PCR柱状图；

图13是HT29 10^-4mol/LMTX耐药细胞中干扰DNA-PKcs后DHFR基因扩增 程度的实时定量PCR柱状图；

图14是HT29 10^-5mol/LMTX耐药细胞干扰DNA-PKcs后DHFR扩增形式的 荧光原位杂交图，其中，为DHFR探针，“→”为5号染色体着丝粒替代 探针；

图15是HT29 10^-4mol/LMTX耐药细胞干扰DNA-PKcs使DHFR基因扩增形 式由HSRs转变为DMs的荧光原位杂交图，其中，为DHFR探针，“→” 为5号染色体着丝粒替代探针；

图16是HT29 10^-4mol/LMTX耐药细胞对照及干扰DNA-PKcs后DHFR扩增 形式的差异情况的荧光原位杂交实验统计图；

图17是HT29 10^-4mol/LMTX耐药细胞中干扰DNA-PKcs导致其他基因扩增 程度变化的实时定量PCR图；

图18是HT29 10^-5mol/LMTX耐药细胞中干扰DNA-PKcs后DHFR蛋白表达 水平的Western Blotting图；

图19是HT29 10^-4mol/LMTX耐药细胞中干扰DNA-PKcs后DHFR蛋白表达 水平的Western Blotting图；

图20是HT29 10^-5mol/LMTX耐药细胞中干扰DNA-PKcs后MSH3和 ZFYVE16蛋白表达水平的Western Blotting图；

图21是HT29 10^-4mol/LMTX耐药细胞中干扰DNA-PKcs后MSH3和 ZFYVE16蛋白表达水平的Western Blotting图；

图22是HT29 10^-4mol/LMTX耐药细胞干扰DNA-PKcs使DHFR通过微核外 排的荧光原位杂交图，其中微核外排的内容物包括：图A中DMs、图B中断裂的 5号染色体、图C中DMs+5号染色体或HSRs；图D中5号染色体/DHFR以外的 断片；

图23是HT29 10^-4mol/LMTX耐药细胞对照及干扰DNA-PKcs克隆中微核外排 DHFR情况荧光原位杂交实验统计图；

图24是耐药细胞在DNA-PK复合物特异性抑制剂作用下以微核外排的DHFR 情况的荧光原位杂交实验统计图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，以便更明确的阐述其优点和特点。 但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该 理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

试验材料：人结肠癌细胞系HT29购自上海细胞库；BAC克隆：RP11-90A9 （Bacpac resources）、5号染色体着丝粒替代BAC由北京协和医学院附属肿瘤医院 王明荣教授赠。

试验试剂：氨甲蝶呤、DMSO、秋水仙胺、NU7026等试剂均为市售。

试验例1

1.细胞培养

人结肠癌细胞系HT29用浓度梯度递增的MTX连续培养，筛选出一系列HT29  MTX耐药细胞，并根据其对MTX的耐受程度命名为HT29 10^-7mol/L MTX，HT29  10^-6mol/L MTX，HT29 10^-5mol/L MTX，HT29 10^-4mol/L MTX。待每个浓度梯度 细胞对相应药物浓度耐受后，继续培养5个月直至其稳定耐药后，进行后续试验。

HT29 MTX敏感细胞在含质量分数为15%的胎牛血清的DMEM高糖培养基中 培养，耐药细胞系培养基中添加相应浓度的MTX。所有细胞均在37℃、体积分数 为5%CO₂的细胞培养箱中培养。

2.HT29 MTX敏感及耐药细胞中DHFR基因扩增程度及扩增形式的变化

（1）细胞基因组DNA提取

应用QIAmp DNA mini kit试剂盒并按照说明书提供的实验步骤进行所需细胞 系基因组DNA的提取。将处于对数期生长期的细胞（细胞数量不超过5×10⁶个）， 用胰酶消化后进行收集，600r/min离心5min收集细胞沉淀。PBS冲洗，1000r/min 离心5min。弃上清，然后将细胞沉淀弹开，加入200μL PBS混匀，再加入20μL 蛋白酶K及200μL Buffer AL，涡旋15s混匀。56℃水浴10min后瞬时离心，然后 加入200μL无水乙醇，涡旋15s，8000r/min离心1min。转移混合物至QIAmp mini 离心柱中，8000r/min离心1min。将离心柱放在新的2mL收集管上，加500μL Buffer  AW1，8000r/min离心1min。将离心柱放在新的2mL收集管上，加500μL Buffer  AW2，14000r/min离心3min。将离心柱放在新的2mL收集管上，14000r/min离心 1min。将离心柱至于1.5mL Eppendorf管上，加200μL Buffer AE，室温孵育1min， 8000r/min离心1min，在1.5mL Eppendorf管中收集到的液体即为基因组DNA。应 用Nature Gene紫外光分光光度计测定所提取DNA的浓度，放入-20℃冰箱储存备 用。

（2）应用Real-time PCR技术检测HT29MTX敏感及耐药细胞中DHFR基因 的扩增程度。

20μL PCR反应体系：480SYBR Green Master10μL，上下 游引物各为1μL（即终浓度为50μmol/L），cDNA模板为2μL（即终浓度为 100ng/μL），ddH₂O7μL。

PCR的反应条件为：95℃6min；95℃20s，Tm20s，72℃20s，进行45个 循环的反应；融解曲线95℃5s，65℃，97℃。

每个样本中目的基因的结果均利用内参对照基因β-ACTIN进行归一化处 理，然后应用独立样本t检验统计学方法，将目的基因在HT29 MTX敏感及耐 药细胞中的结果进行比较，得到的差异结果用倍数表示。确定P值，当P≤0.05 时，差异具有显著的统计学意义，用*表示；当P≤0.01时，差异具有极显著的 统计学意义，用**表示。

（3）细胞中期核型标本制备

挑选处于有丝分裂旺盛期的HT29各浓度梯度MTX耐药细胞制备染色体 标本。向培养于50mL培养瓶中处于生长旺盛期的细胞加入10μL秋水仙胺 （10μg/μL），作用1h后收获细胞。PBS冲洗，胰酶消化收集细胞，1000r/min 离心6min使细胞沉淀。弃上清，将细胞沉淀弹开成为细胞悬液，加入9mL37℃ 预热的KCl低渗液（0.075mol/L），37℃低渗12min后，加入1mL新配制的固 定液（甲醇：冰醋酸=3:1）预固定1min，1620r/min离心7min。弃上清，弹开 细胞沉淀，10mL固定液后1620r/min离心7min，弃上清，弹匀，加10mL固定 液后1620r/min离心7min。弃上清，加入2mL新配制的固定液（甲醇：冰醋酸 =2:1），吹匀细胞。

取预冷的载玻片，将吹匀的细胞悬液滴片。空气中干燥后，镜检，检测是 否可做FISH。

（4）FISH检测DHFR扩增程度及形式的改变

a.FISH探针制备及探针沉淀

应用Genopure Plasmid Midi Kit试剂盒，按说明书提供方法提取BAC克隆 （RP11-90A9：DHFR；5号染色体着丝粒替代探针）DNA，以所提取的DNA为模 板，应用BioPrime DNA Labeling System试剂盒通过随机引物法标记FISH探针。 反应体系：先配制总体系5μL的反应液，其中Random Primer占总体系的80%， BAC DNA模板浓度为8μg/mL，其余以H₂O补齐。反应液95℃反应10min后，立 刻置于冰上静置2min，之后加入终浓度为0.25mmol/L缺T的dNTP，体积分数为 2%的Klenow和终浓度为125μmol/L的dNTP，37℃水浴3h，加入体积分数为10% 的终止Buffer。用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测产物。

反应结束后，进行探针沉淀。反应体系为：Labeled BAC DNA3μl，ssDNA6μl， Human CotI6μL，H₂O补齐至50μL，醋酸钠(3mol/L)5μL，冷的无水乙醇（-20℃ 冰箱冷藏）110uL。然后将探针放置-80℃冰箱沉淀20min后12000rpm离心10min， 吸去上清（200uL枪头，勿碰到探针沉淀），110μlL体积分数为75%的冷乙醇洗涤 沉淀。12000rpm离心10min，吸去上清，避光干燥5min～10min。加9μL杂交液， 37℃水浴1～2h，使探针溶解。随后75℃水浴8min进行探针变性，立即置冰上2min。 最后，37℃水浴30min进行探针预复性。

b.FISH玻片处理流程

用钻石笔将之前滴好的片子标出目标区域（约一个20×20盖玻片大小），随后 加100μL RNase工作液于目标区域，盖上PE手套（剪成小块），放在湿盒里，37℃ 孵育40min。孵育结束后，在室温条件下，用2×SSC洗3min，体积分数为75%、 85%、100%梯度的乙醇脱水各3min并用吹风机吹干。每个目标区域加100μL胃 蛋白酶工作液，盖上手套，放在湿盒里，37℃孵育15min。孵育结束，1×PBS洗5 min后用质量分数为1%多聚甲醛处理10min，1×PBS洗5min，体积分数为75%、 85%、100%梯度的乙醇脱水各3min，吹风机吹干。将玻片放入预热的体积分数 为70%的甲酰胺中，75℃水浴3min。最后将玻片放入4℃预冷的2×SSC I、2×SSC  II中各洗3min，体积分数为75%、85%、100%的梯度乙醇脱水各3min。

c.FISH杂交流程

每个目标区域加9μL探针，盖上盖玻片（20×20），rubber cement封片；放入 湿盒37℃孵育，隔天收。

隔天，揭去Rubber Cement封片剂，将玻片放入44℃水浴预热的体积分数为 50%甲酰胺中，夹住玻片晃动，使盖玻片脱落，计时15min。2×SSC I、2×SSC II各 3min，体积分数为75%、85%、100%的乙醇脱水各3min，吹干。5μL DAPI复 染，24×32盖玻片封片。荧光显微镜下观察。

在应用Real-time PCR及FISH技术对HT29 MTX敏感及耐药细胞中DHFR基 因扩增程度及扩增形式检测时，发现与HT29 MTX敏感细胞相比，HT29 MTX耐 药细胞中DHFR基因扩增程度随着MTX耐药浓度升高而增加，见图1；基因扩增 的形式由HSRs逐步转变为HSRs与DMs共存的方式，见图2。3．HT29 MTX敏 感及耐药细胞中DHFR蛋白表达水平的变化

提取细胞总蛋白，应用Western Blotting方法检测HT29 MTX敏感及各浓度 梯度MTX耐药细胞中DHFR蛋白表达水平的变化。

a.细胞总蛋白的提取

将细胞用预冷的PBS冲洗3次，以去除细胞表面附着的蛋白成份。将细胞培 养瓶放在冰上，吸净残余的PBS。加入适量的细胞裂解液（蛋白酶抑制剂：磷酸酶 抑制剂：RIPA buffer的体积比为1：1：10），用细胞刮刮下细胞并收集于1.5mL  Eppendorf管中，冰上静置，每10min涡旋1次，涡旋3次后，4℃、12000r/min 离心40min，取上清，应用Nature Gene紫外分光光度计测定所提取细胞总蛋白浓 度并分装，-80℃保存备用。

b.SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质

应用质量分数为30%的凝胶储备液（甲叉双丙烯酰胺：丙烯酰胺=1：29）制 备浓度分别为10%和5%的SDS-聚丙烯酰胺分离胶及积层胶（表1）。

表1聚丙烯酰胺凝胶成分

取等量蛋白样品，加入5×loading buffer、RIPA buffer将体系调平、混匀，加 热煮沸3～5min进行变性后，立即放在冰上，待完全冷却后，瞬时离心后上样。

先以80V电压电泳至分离胶中出现蛋白质marker的第一条带后，再以120V 电压电泳至与待测蛋白分子量相近的蛋白质marker条带达到分离胶中1/3处时停 止。

c.转膜

剪取1张与凝胶大小一致的PVDF膜，浸泡于甲醇中30s后备用。同时，将凝 胶转移用滤纸、纤维垫及转子于转移缓冲液中完全浸透。按如下顺序组装转移装置： 阳极→纤维垫→3张3M滤纸→PVDF膜→凝胶→3张3M滤纸→纤维垫→阴极， 确定排出气泡后封闭转移装置，放入转移槽中并在槽中放置冰盒降温，以300mA 室温转移1～2h。

d.免疫反应

转膜结束后，取出PVDF膜并作标记，放入TBS-T洗涤三次，每次10min， 然后放入适量TBS-T溶解的质量分数为5%的脱脂奶粉中，室温封闭1小时。

将封闭好的PVDF膜，加入稀释的一抗（DHFR，1:1000。）4℃震荡过夜。杂 交结束后，用TBS-T洗膜3次，每次洗10min，然后加入以1:10000比例稀释的 二抗，室温下避光杂交1h。杂交结束后，用TBS-T洗膜3次，每次洗10min。最 后用Odyssey Infrared Imaging System扫膜，获取图像。

结果显示，与HT29 MTX敏感细胞相比，HT29 MTX耐药细胞中DHFR蛋白 表达水平随着MTX耐药浓度升高而增加，见图3。

4．NHEJ相关蛋白的表达分析

提取细胞总蛋白，应用Western Blotting方法检测Ku70、Ku86、DNA-PKcs、 XRCC4、DNA LigⅣ在HT29 MTX敏感及HT29 10^-5mol/L和HT29 10^-4mol/L MTX 耐药细胞中的表达变化。

提取细胞总蛋白、Western Blotting具体实验步骤同前。

一抗稀释比例（Ku70，1:500；Ku86，1:500；DNA-PKcs，1:500；XRCC4， 1:500；LigIV，1:500）。

与HT29 MTX敏感细胞相比，HT29 10^-5mol/L MTX耐药细胞中NHEJ途径相 关蛋白DNA-PKcs、XRCC4过表达；而Ku70、Ku86、DNA ligaseⅣ无明显变化， 见图4；HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞中NHEJ途径相关蛋白DNA-PKcs、XRCC4 及Ku86过表达；而Ku70、DNA ligaseⅣ无明显变化，见图5。

5．DNA-PKcs在HT29MTX敏感及耐药细胞中mRNA表达水平的差异

应用Real-time PCR方法，以HT29 MTX敏感及耐药细胞的cDNA为模板， 分析DNA-PKcs基因的mRNA表达水平差异。

a.细胞总RNA的提取

用总RNA提取试剂TRIzol Reagent，按说明书提供方法提取HT29 MTX敏感 及耐药细胞的总RNA。分别取上述几种细胞，预冷的PBS冲洗3次，加入适量TRIzol  Reagent，室温放置5min裂解细胞，吹打均匀后以1mL/管分装至1.5mL Eppendorf 管中。每管加入0.2mL（即总体积的1/5）氯仿，剧烈震荡15s，室温放置10min， 4℃、12000r/min离心15min。将上层水相移至干净Eppendorf管中，加入0.4mL 异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min，4℃、12000r/min离心10min。弃上清，预冷 的体积分数为75%的乙醇洗涤RNA沉淀，12000r/min离心10min。室温干燥RNA 沉淀，5～10min后溶于适量DEPC处理水中。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA样本 的完整性，应用Bio-Photometer对提取的RNA进行定量测定。

b.cDNA第一链的合成

利用Transcriptor Eirst strand cDNA Synthesis Kit（Roche）试剂盒按说明书将提 取的细胞总mRNA逆转录为cDNA，逆转录体系见表2：

表2  20μL逆转录体系

反应条件为：50℃60min，85℃5min，16℃∞。

应用Nature Gene紫外分光光度计对逆转录后的cDNA进行浓度测定，放-20℃ 冰箱储存备用。

c.Real-time PCR

20μL PCR反应体系：480SYBR Green Master10μL，上下 游引物各为1μL（即终浓度为50μmol/L），cDNA模板为2μL（即终浓度为 100ng/μL），ddH₂O7μL。

PCR的反应条件为：95℃6min；95℃20s，Tm20s，72℃20s，进行45个 循环的反应；融解曲线95℃5s，65℃，97℃。

每个样本中目的基因的结果均利用内参对照基因β-ACTIN进行归一化处 理，然后应用独立样本t检验统计学方法，将目的基因在HT29 MTX敏感及耐 药细胞中的结果进行比较，得到的差异结果用倍数表示。确定P值，当P≤0.05 时，差异具有显著的统计学意义，用*表示；当P≤0.01时，差异具有极显著的 统计学意义，用**表示。

如图6所示，在HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞中，DNA-PKcs mRNA表达水 平为其在HT29 MTX敏感细胞中表达的1.61倍，确定发明人可以通过RNAi方法 建立稳定干扰DNA-PKcs的克隆。

6．稳定干扰DNA-PKcs的HT29 10-4mol/L MTX克隆的建立

a.细胞转染分组

细胞转染分两组进行：第一组转染质粒pSUPER-DNAPKcs；第二组转染质粒 pSUPER-sis。

b.确定HT29 10^-5mol/L和HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞对嘌呤霉素的敏感性

分别取生长良好的HT29 10^-5mol/L和HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞，制备成 单细胞悬液，计数种板，六孔板每孔种3×10⁵个细胞，种六个孔。第二天，待细胞 贴壁后，换新鲜培养基，每孔加入终浓度分别为0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、 0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL的嘌呤霉素，连续培养7天，观察到，嘌呤霉素 浓度为0.5μg/mL时HT29 10^-5mol/L MTX耐药细胞恰好全部死亡，嘌呤霉素浓度为 0.3μg/mL时HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞恰好全部死亡，故选此浓度作为稳定转 染时的药物筛选浓度。

c.稳定转染

分别将处于对数生长期的HT29 10^-5mol/L和HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞接 种于6孔板中，每孔细胞3×10⁵个。待细胞长至融合率为70%～80%时，进行转染。 第一步配制溶液①：10μL Lipo2000加入到240μL无血清DMEM高糖培养基中， 室温静置15min。第二步配制溶液②：8μL（4ng）质粒加入到242μL无血清培养 基中。第三步将溶液②加入到溶液①中，缓缓混匀，室温放置20min。同时，将6 孔板中的细胞用无血清DMEM高糖培养基清洗两遍，再加入1.5mL培养基。最后 将混合液逐滴加入细胞孔中，培养在37℃，体积分数为5%的CO₂培养箱中。培养 5～6h后，更换含血清的DMEM高糖培养基。

d.转染细胞及克隆筛选

培养24h后，加入嘌呤霉素，在培养过程中，大部分细胞皱缩死亡，只有少数 细胞存活，换液，继续培养直到存活细胞开始增殖并逐渐形成单克隆。

当形成的克隆达到肉眼可见大小的时候，进行克隆挑取。HT29 10^-5mol/L MTX 耐药细胞对照组克隆命名为Con，干扰组两个克隆分别命名为Si1、Si2。HT29  10^-4mol/L MTX耐药细胞对照组克隆命名为Con，干扰组三个克隆分别命名为Si1、 Si2、Si3。

7．检测DNA-PKcs蛋白质表达情况鉴定稳定干扰克隆的干扰效果

提取细胞总蛋白，应用Western Blotting方法检测DNA-PKcs在HT29  10^-4mol/L MTX耐药细胞及干扰DNA-PKcs细胞中的表达情况。

提取细胞总蛋白、Western Blotting具体实验条件及步骤同前。

HT29 10^-5mol/L MTX耐药细胞和HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞的DNA-PKcs 干扰效果分别如图7、图8所示。

8．稳定干扰DNA-PKcs对DSBs的产生及细胞功能的影响

（1）免疫荧光通过间接地检测γH2AX Foci来确定细胞中DSBs的多少，以 检测干扰DNA-PKcs对DSBs的产生的影响

取处于生长旺盛期的对照及干扰DNA-PKcs的HT29 10^-4mol/L MTX耐药细 胞，种在放置有盖玻片的六孔板中。待细胞长到融合率为50%～70%时取出盖玻片， 置于干净的培养皿中（此时细胞已经贴在盖玻片上）。PBS冲洗3次后，用-20℃预 冷的甲醇固定5min，然后干燥5min，用PBS洗3次。用KCM缓冲液（KCM buffer， 成分见表3）在4℃封闭6h。随后用KCM缓冲液稀释的一抗γH2AX4℃孵育过夜。 第二天，将片子取出，用PBS冲洗3次。用由KCM缓冲液稀释的FITC标记鼠二 抗室温避光孵育1.5h。最后，PBS洗3次后，用DAPI复染，细胞面朝下盖在载玻 片上。镜检，拍照。

表3KCM缓冲液成分

免疫荧光结果显示，与对照组相比，干扰DNA-PKcs的克隆中，γH2AX Foci 明显增多，说明干扰DNA-PKcs后，来不及修复的DSBs明显增多，进一步说明在 稳定干扰DNA-PKcs后NHEJ修复途径发生了功能障碍，见图9。

（2）MTT法绘制生长曲线检测干扰DNA-PKcs对细胞生长的影响

收集对数生长期的细胞，稀释到适宜细胞浓度的单细胞悬液，以每孔适宜 的细胞密度平行接种5～7块96孔板，并加入相应浓度的MTX。种板后的前三 天不换液，第四天开始酌情换液。

自种板起每过24小时对一块96孔板进行读数。吸出培养基，小心用PBS 冲洗一遍后每孔加入100μL新鲜培养基，并加入20μL5mg/ml的MTT溶液，继 续培养4h后终止培养。小心吸出孔内培养液，每孔加150μL DMSO，将96孔 板置于摇床上低速摇10min以上直至沉淀完全溶解。在酶标仪OD492nm处测 量各孔吸光值。

计算每个浓度吸光值的平均值，去除背景吸光值后以此绘制生长曲线。

MTT结果显示，与对照组相比，干扰DNA-PKcs后细胞生长减慢，其中干扰 效果最好的克隆生长最慢，呈现出干扰效果越好，细胞增殖能力越差的现象，说明 降低DNA-PKcs的表达导致细胞的增殖能力下降，见图10、图11。

（3）流式细胞仪检测干扰DNA-PKcs对细胞凋亡的影响

PBS冲洗细胞，胰酶消化，培养基终止消化，1000r/min离心收集细胞，细 胞计数50万。用冷的PBS洗涤细胞2次，1×binding buffer重悬细胞。加入100μL 上述细胞悬液至5mL的离心管中，加入5μL Amexinν-FITC及5μL DAPI。轻轻 涡旋细胞，避光室温孵育15min。加入400μL 1×binding buffer，1h内上流式细 胞仪观察计数。

流式测凋亡结果显示：与对照组相比，干扰DNA-PKcs后的克隆细胞早期凋 亡比例明显增加。说明降低DNA-PKcs的表达导致HT29 10^-5mol/L和HT29  10^-4mol/L MTX耐药细胞抗调亡能力下降（表4、表5）。

表4 HT29 10^-5mol/L MTX耐药细胞对照及稳定干扰DNA-PKcs克隆的凋亡情况

表5对照及稳定干扰DNA-PKcs克隆的HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞凋亡情况

（4）MTT法检测干扰DNA-PKcs对细胞耐药性的影响

通过MTT法检测药物半致死浓度并计算细胞耐药指数，分析干扰 DNA-PKcs对MTX耐药细胞的MTX药物敏感性的影响。

收集对数生长期的细胞，稀释到适宜细胞浓度的单细胞悬液，以每孔适宜 细胞密度接种到96孔板，并加入浓度梯度连续的MTX。酌情换液，培养96h 后读数，方法同MTT测生长曲线。

根据对照孔（未加药）计算MTX对细胞的生长抑制率，根据各个浓度对 细胞的生长抑制率计算得出MTX对细胞的药物半致死浓度。

在HT29 10^-5mol/L MTX耐药细胞中，与对照组相比，MTX对干扰DNA-PKcs 的两个克隆Si1、Si2的半数抑制浓度（IC₅₀）都降低了约2倍，即降低DNA-PKcs 的表达导致HT29 10^-5mol/L MTX耐药细胞对MTX的药物敏感性升高。

在HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞中，与对照组相比，MTX对干扰DNA-PKcs 的三个克隆Si1、Si2、Si3的半数抑制浓度（IC₅₀）分别降低了4.8、8.8、2.0倍， 即降低DNA-PKcs的表达导致HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞对MTX的药物敏感 性升高（表6）。

表3HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞对照及稳定干扰DNA-PKcs克隆 对MTX敏感性的差异情况

9．干扰DNA-PKcs对基因扩增及其相应蛋白的表达情况的影响

（1）以HT29 10^-5mol/L和HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞干扰DNA-PKcs 克隆及对照细胞的DNA为模板，应用Real-time PCR技术分析干扰DNA-PKcs 对DHFR基因扩增程度的影响。β-ACTIN作为内参对照基因。

HT29 10^-5mol/L MTX耐药细胞中，与对照组相比，干扰DNA-PKcs后的两个 克隆中DHFR基因的扩增程度均未发生明显下降，见图12。而在HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞中，与对照组相比，干扰DNA-PKcs后的三个克隆中DHFR基因的 扩增程度均明显下降。说明降低DNA-PKcs的表达导致HT29 10^-4mol/L MTX耐药 细胞中DHFR基因扩增程度下降，见图13。

（2）HT29 10^-5mol/L和HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞干扰DNA-PKcs克隆 及对照细胞中期核型标本制备，FISH检测干扰DNA-PKcs对DHFR基因扩增形 式的影响

发明人发现，HT29 10^-5mol/L MTX耐药细胞对照组及干扰DNA-PKcs的两个 克隆中，DHFR都是以HSRs的形式存在。说明DNA-PKcs干扰之后，DHFR的扩 增形式未发生明显改变，见图14。

HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞对照组中DHFR主要是以DMs形式存在，而在 干扰DNA-PKcs的三个克隆中，DHFR主要是以HSRs的形式存在，见图15。针 对这一现象，发明人做出统计：分别随机拍摄了对照组及干扰组三个克隆中处于分 裂中期的核型50个，其中，Con中含DMs的中期核型占总数的66%，而Si1、Si2、 Si3中含DMs的中期核型占总数的比例分别为2%、0%、1.96%；Con中同时包含 DMs及HSRs的中期核型占总数的10%，而Si1、Si2、Si3中同时包含DMs及HSRs 的中期核型占总数的比例分别为18%、0%、1.96%；Con中仅包含HSRs的中期核 型占总数的8%，而Si1、Si2、Si3中仅包含HSRs的中期核型占总数的比例分别为 74%、96%、90%。说明DNA-PKcs干扰之后，DHFR的扩增形式由以DMs为主转 变为以HSRs为主，见图16。

（3）以HT29 10^-5mol/L和HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞干扰DNA-PKcs克 隆及对照细胞的DNA为模板，应用Real-time PCR技术分析干扰DNA-PKcs对 XRCC4、MSH3、ZFYVE16等其它基因扩增程度的影响。

在前期的研究中，发明人应用17个浓度梯度递增的HT29 MTX耐药细胞进行 基因进化研究时发现，CCNH、MSH3、XRCC4、ZFYVE16、CAST、POLK、GLRX 几个基因与DHFR一样是随着MTX药物浓度升高而扩增程度增加的，RAD1、PLK2 是随着MTX药物浓度升高而扩增程度降低的，并且这些基因与DHFR基因一起位 于5号染色体同一个扩增子上。本研究显示，干扰DNA-PKcs后DHFR基因拷贝 数降低，那么干扰DNA-PKcs是仅影响了DHFR基因的拷贝数还是对更多的基因 产生影响，对此发明人选取了以上几个基因进行了Realtime PCR验证。Real-time  PCR结果显示，与对照组相比，干扰DNA-PKcs后的克隆中，MSH3、ZFYVE16 基因扩增程度明显降低。此结果与前面DHFR基因的结果一致，证明了降低 DNA-PKcs的表达导致HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞的基因扩增程度降低，也进 一步证明了DHFR、MSH3、ZFYVE163个基因位于基因扩增的核心地位。另外 XRCC4也出现了一定程度的拷贝数降低，见图17。

（4）提取细胞总蛋白，应用Western Blotting方法检测HT29 10^-5mol/L和 HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞干扰DNA-PKcs克隆及对照细胞中DHFR蛋白及 XRCC4、MSH3、ZFYVE16等其它蛋白的表达情况。

HT29 10^-5mol/L MTX耐药细胞对照组及干扰DNA-PKcs的两个克隆中，DHFR 蛋白表达水平未发生明显变化，见图18。HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞中，与对 照组相比，干扰DNA-PKcs的三个克隆DHFR蛋白表达水平明显降低，见图19。 而MSH3、ZFYVE16、XRCC4等蛋白在HT29 10^-5mol/L和HT29 10^-4mol/L MTX 耐药细胞的对照组及干扰DNA-PKcs的各个克隆中的表达水平均没有明显改变， 见图20、图21。

10.干扰DNA-PKcs对微核外排的影响

HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞干扰DNA-PKcs克隆及对照细胞中期核型标本 制备，FISH检测微核外排DHFR情况。

如图22所示，通过微核外排的内容物可以体现为4种形式，包括（a）DMs 形式外排的DHFR（统计图中以“DHFR”表示）、（b）包含5号染色体的片段（统 计图中以“5CEN”表示）、（c）DMs及断裂的5号染色体或HSRs（统计图中以 “DHFR&5CEN”表示）、（d）5号染色体/DHFR以外的断片（统计图中以“无信号” 表示）。发明人发现，包含以上4种形式微核的间期核在对照及干扰组中的三个克 隆中存在着差异，与对照组相比，干扰DNA-PKcs的细胞微核较小，DHFR外排较 少，所以发明人做了进一步的统计，结果见图23。发明人随机选取了对照组及干 扰组中带有微核的间期核各50个，进行拍照并作了统计。其中，Con含携带DHFR 信号微核的间期核型占总数的49.2%，而Si1、Si2、Si3含携带DHFR信号微核的 间期核型占总数的比例分别为20.0%、20.3%、30.4%；Con含无DHFR信号微核 的间期核型占总数的24.6%，而Si1、Si2、Si3含无DHFR信号微核的间期核型占 总数的比例分别为55.7%、55.4%、53.6%；然而，含携带5号染色体断裂片段及携 带DMs与断裂的5号染色体或HSRs的微核的间期核在对照及干扰组中差异不大。 说明，在干扰DNA-PKcs并形成稳定克隆之后，以微核形式外排的DHFR减少。

11．HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞在DNA-PK复合物特异性抑制剂短期作用 下以微核外排的DHFR的情况

取生长状态良好的细胞，以每孔30万的细胞种在6孔板中。第二天更换新 鲜培养基，并加入终浓度为10^-4mol/L的MTX及终浓度为10μmol/L的NU7026。 作用24h后，换只加MTX的培养基继续培养3天。第三天进行中期核型制备。随 后用FISH方法分析NU7026短期作用HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞对以微核形 式外排DHFR的影响。

中期核型制备及FISH具体实验条件及步骤同前。

如图24所示，在DMSO处理组及NU7026处理组中，携带微核的间期核核型 分别占分裂间期核型总数的26.2%、37.3%，携带DHFR信号微核的间期核型分别 占间期核型总数的7.5%、9.8%，不携带DHFR信号微核的间期核型分别占间期核 型总数的18.7%、27.5%。说明NU7026处理后的HT29 10^-4mol/L MTX耐药细胞， 与DMSO处理的对照组相比，通过微核外排的DHFR增多，也进一步证明了DHFR 基因扩增程度降低是通过DHFR以微核形式外排实现的。