一种快速从土壤筛选产抗菌素的放线菌的方法

摘要

一种快速从土壤中筛选产抗菌素的放线菌的方法，包括以下步骤：采集土壤样本；培养：样本系列经梯度稀释后，接种于含有高氏一号培养基的培养皿里，培养6-12天；挑选单菌落：将形成的单菌落数量最多培养皿中所有的单菌落挑选出来进行转接；长方形转接：所有单菌落编号，转接至新的高氏一号培养基上，划短线转接到新培养基中；筛选：用不锈钢打孔器将生长放线菌的培养基打成圆形的琼脂快，用镊子夹取琼脂块放置于预先涂布测试细菌的培养基上，培养18-24h，采用透明圈直径D-琼脂块直径d分析抗菌活性大小，将放线菌继续分离培养，得到稳定性的抗菌素放线菌。本发明提供的从土壤中筛选产抗菌素放线菌的方法，具有操作方便、迅速的优势，可替代单菌落琼脂块法、单菌落涂布琼脂块和单菌落液体发酵法而广泛推广使用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗菌素微生物筛选方法，尤其是快速地从土壤中筛选产抗菌素的放线菌的方法。

背景技术

病原细菌耐药已经成为动植物及人类用药中最为困扰的事件之一，并且病原菌耐药趋势还在上升，但是新型抗菌素的发现相对滞后，从自然界中筛选产新型抗菌素的微生物显得尤为重要。放线菌产生的抗菌素种类占所有发现的抗菌素的三分之二左右，说明利用放线菌筛选新型抗菌素具有较高的成功几率。土壤是微生物最丰富的环境，许多研究工作者从事土壤放线菌产生抗菌素研究。采用单菌落琼脂块法筛选产抗菌素的放线菌，由于单菌落分布范围小，一个单菌落只能测试一种类型细菌：革兰氏阴性细菌或者革兰氏阳性细菌，这样就会错过评估一种放线菌对另外一类病原细菌的抑制作用，缩小了抗菌素发现范围。有的研究人员将单菌落重新涂布接种后，用琼脂块进行抑菌测试（朱文杰等. 秦岭太白山北坡土壤拮抗性放线菌分布及特性. 应用生态学报, 2011, 22(11): 3003-3010），即单菌落涂布琼脂块法，每个单菌落需要一个培养皿，导致工作量增大很多。 

    还有一种方法就是液体发酵法，将放线菌单菌落接种于液体培养基中，发酵培养后再测试该放线菌发酵液对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌的抑制作用 [肖静等，红树林放线菌的分离及其抗菌和抗肿瘤细胞活性. 应用与环境生物学报, 2008, 14: 244-248]。由于一个土样可以获得几十个单菌落，液体发酵法工作量非常繁重，导致一定时间内筛选的土壤样品数量减少。

产放线菌筛选工作非常庞大，目前为了从放线菌中筛选获得新型抗菌素，在筛选培养基组成上进行了许多研究，以期筛选到稀有放线菌或常规培养方法难以培养的放线菌。然而这些放线菌的抗菌活性初筛采用单菌落琼脂块法、单菌落涂布琼脂块法和单菌落液体发酵法，使得抗菌素产生放线菌漏选或者工作量大增，从而影响了产抗菌素放线菌的发现机会，制约了新型抗菌素的研究开发。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种以长方形转接，其中一个10cm的培养皿可以转接多达35个单菌落，采用琼脂块抑菌测试，可以同时测试两类细菌（革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌）的方法。为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

1）土壤样本的采集及处理：采集新鲜土壤，放入50mL灭菌塑料袋中，立即带回实验室，称取湿重样品5g于80℃烘干恒重，计算出5g干重土样所需湿重量。

2）培养：将步骤1）采集的相当于干重5g的湿重样本经梯度稀释后在65℃水浴恒温10min，接种于含有高氏一号培养基的培养皿里，培养6-12天；

3）挑选单菌落：将步骤2）中形成的单菌落数量最多培养皿中所有的单菌落挑选出来进行转接；

4）长方形转接：将步骤3）所有单菌落编号，用接种环转接至新的高氏一号培养基上，划短线转接到新培养基中，28℃培养12天，其中每个短线之间距离为6-10mm，每个10cm的培养皿至少可以转接35个单菌落；

5）筛选：用直径为4mm的不锈钢打孔器将生长放线菌的琼脂培养基打成2块圆形的琼脂培养基块，用镊子分别夹取琼脂培养基块放置于预先涂布测试革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌的培养基上，培养18-24 h，观察抗菌活性，产生透明圈的即为有抗菌活性，抗菌活性大小R=透明圈直径D-琼脂块直径d；

6）将产生透明圈琼脂块的原始单菌落重复步骤4）、5）再次进行划线分离纯化，得到稳定的产抗菌素的放线菌。

本发明的优点：本发明采用将单菌落以长方形转接方式接种提高了发现抗菌素产生放线菌的速度，具有操作方便、迅速的优势，能方便、快捷地从土壤中初步筛选产抗菌素的放线菌菌株，可替代单菌落琼脂块法、单菌落涂布琼脂块和单菌落液体发酵法而广泛推广使用。

具体实施方式

实施例1

一种快速从土壤中筛选产抗菌素的放线菌的方法，该方法包括以下步骤：

1）采集样本：从三峡水库香溪河段香溪镇附近采集土壤样本，放入50ml的灭菌塑料管中，立即将样本带回实验室；

2）培养：培养基是高氏一号合成培养基；

将步骤1）采集的样本取5g于80℃烘至恒重，计算出5g干重土样所需湿重量。取新鲜土壤（湿重）6.3g（相当于5g干重），加入45ml灭菌水中，充分混匀，此为10^-1；取5ml 10^-1液体加入45ml灭菌水中，此为10^-2；取5ml 10^-2液体加入45ml灭菌水中，此为10^-3。10^-1、10^-2和10^-3稀释液在65℃水浴恒温10min，分布涂布于高氏一号固体培养基上，于28℃培养7天。

3）长方形转接：10^-1稀释液有最多的放线菌单菌落，到达47个；将这47个单菌落编号后，采用长方形转接，划短线（长方形，长：8-10mm，宽：一个接种环划线宽度）于2个新的培养基上，28℃培养7天。

4）抗菌筛选：用不锈钢打孔器将生长放线菌的琼脂培养基打成圆形的琼脂培养基块2片(d=4mm)，用镊子分别夹取琼脂培养基块放置于预先涂布测试革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌的培养基上，37℃培养20h。4个琼脂培养基块抑制大肠埃希菌ATCC 25922生长，R值最大的是11mm，最小的是4mm。8个琼脂块抑制枯草芽孢杆菌 ATCC 6633生长，R值最大的是13mm，最小的是5mm。其中有2片琼脂块既能抑制大肠埃希菌ATCC 25922，又能抑制枯草芽孢杆菌 ATCC 6633。

5）分离纯化：将具有抗菌活性的原始10个单菌落再次划线分离纯化，重复步骤3）和4）检测抗菌活性的传代稳定性，通过10次转接发现4个单菌落有稳定的抗菌活性。

实施例2

一种快速从土壤中筛选产抗菌素的放线菌的方法，该方法包括以下步骤：

1）采集样本：从三峡水库香溪河段峡口镇附近采集土壤样本，放入50ml的灭菌塑料管中，立即将样本带回实验室；

2）培养：培养基是高氏一号合成培养基；

将步骤1）采集的样本取5g于80℃烘至恒重，计算出5g干重土样所需湿重量。取新鲜土壤（湿重）7.1g（相当于5g干重），加入45ml灭菌水中，充分混匀，此为10^-1；取5ml 10^-1液体加入45ml灭菌水中，此为10^-2；取5ml 10^-2液体加入45ml灭菌水中，此为10^-3。10^-1、10^-2和10^-3稀释液在65℃水浴恒温10min，分布涂布于高氏一号固体培养基上，于28℃培养10天。

3）长方形转接：10^-2稀释液有清晰的放线菌单菌落31个；将这31个单菌落编号后，采用长方形转接，划短线（长方形，长：8-10mm，宽：一个接种环划线宽度）于1个新的培养基上，28℃培养10天。

4）抗菌筛选：用不锈钢打孔器将生长放线菌的琼脂培养基打成圆形的琼脂培养基块2片(d=4mm)，用镊子分别夹取琼脂培养基块放置于预先涂布测试革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌的培养基上，37℃培养20h。没有琼脂培养基块抑制大肠埃希菌ATCC 25922生长。1个琼脂培养基块抑制枯草芽孢杆菌 ATCC 6633生长，R值是5mm。

5）分离纯化：将具有抗菌活性的这个原始单菌落再次划线分离纯化，重复步骤3）和4）检测抗菌活性的传代稳定性，通过10次转接发现这个单菌落有稳定的抗菌活性。

实施例3

一种快速从土壤中筛选产抗菌素的放线菌的方法，该方法包括以下步骤：

1）采集样本：从三峡水库香溪河段昭君镇附近采集土壤样本，放入50ml的灭菌塑料管中，立即将样本带回实验室；

2）培养：培养基是高氏一号合成培养基；

将步骤1）采集的样本取5g于80℃烘至恒重，计算出5g干重土样所需湿重量。取新鲜土壤（湿重）6.9g（相当于5g干重），加入45ml灭菌水中，充分混匀，此为10^-1；取5ml 10^-1液体加入45ml灭菌水中，此为10^-2；取5ml 10^-2液体加入45ml灭菌水中，此为10^-3。10^-1、10^-2和10^-3稀释液在65℃水浴恒温10min，分布涂布于高氏一号固体培养基上，于28℃培养12天。

3）长方形转接：10^-1稀释液有最多的放线菌单菌落，达到56个；将这56个单菌落编号后，采用长方形转接，划短线（长方形，长：8-10mm，宽：一个接种环划线宽度）于2个新的培养基上，28℃培养12天。

4）抗菌筛选：用不锈钢打孔器将生长放线菌的琼脂培养基打成圆形的琼脂培养基块2片(d=4mm)，用镊子分别夹取琼脂培养基块放置于预先涂布测试革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌的培养基上，37℃培养20h。3个琼脂培养基块抑制大肠埃希菌ATCC 25922生长，R值最大的是14mm，最小的是4mm。2个琼脂块抑制枯草芽孢杆菌 ATCC 6633生长，R值最大的是4mm，最小的是3mm。其中有1片琼脂培养基块既能抑制大肠埃希菌ATCC 25922，又能抑制枯草芽孢杆菌 ATCC 6633。

5）分离纯化：将具有抗菌活性的原始4个单菌落再次划线分离纯化，重复步骤3）和4）检测抗菌活性的传代稳定性，通过10次转接发现2个单菌落有稳定的抗菌活性。