用于治疗溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)的nAChRα7激动剂和nAChRα7拮抗剂

摘要

公开了nAChRα7的激动剂和拮抗剂以及它们作为用以治疗和管理炎性肠病(IBD)例如克罗恩病(Crohn’s disease，CD)和溃疡性结肠炎(UC)的治疗剂的用途。公开了nAChRα7的激动剂和拮抗剂以及它们作为用以治疗和管理炎性肠病(IBD)例如克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)的治疗剂的用途。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2010年6月25日提交的美国临时申请号为61/358,481 的权益，其在此通过引用全部并入。

背景

炎性肠病(IBD)，包括但不限于克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)， 是慢性肠疾患，其仅在西方国家中就影响大约340万人并且导致巨大的患 病和健康护理花费。在过去的几十年，科学家和临床医生被如下观察结果 所困惑：吸烟的烟草产物对UC的进程有有益的影响并且对CD的进程有 有害的影响。但是，吸烟和烟碱在UC和CD的进程中的作用并没有被很 好地理解。

概述

在一些方面，本公开主题提供在有相应治疗需要的受治疗者中治疗炎 性肠病(IBD)的方法，所述方法包括以有效调节所述受治疗者中至少一 种细胞的nAChRα7活性的量对所述受治疗者施用烟碱型乙酰胆碱受体α7 (nAChRα7)拮抗剂，借此所述至少一种细胞中nAChRα7活性的调节治 疗所述受治疗者的IBD。在特别的方面，IBD包括克罗恩病(CD)。

在其他方面，本公开主题提供在有相应治疗需要的受治疗者中治疗炎 性肠病(IBD)的方法，所述方法包括以有效调节所述受治疗者中至少一 种细胞的nAChRα7活性的量对受治疗者施用nAChRα7激动剂，借此所述 至少一种细胞中nAChRα7活性的调节治疗受治疗者的IBD。在特别的方 面，IBD包括溃疡性结肠炎(UC)。

在另外的方面，本公开主题提供用于调节至少一种免疫细胞类型中的 nAChRα7活性的方法，所述方法包括使至少一种免疫细胞类型与以有效调 节至少一种免疫细胞类型中的nAChRα7活性的量的nAChRα7拮抗剂或 nAChRα7激动剂接触。

在其他方面，本公开主题提供用于减少在有慢性胃肠道炎症的受治疗 者中发展结直肠癌的风险的方法，所述方法包括以有效调节一种或多种胃 肠道免疫细胞中nAChRα7活性的量对所述受治疗者施用nAChRα7拮抗剂 或nAChRα7激动剂，借此调节nAChRα7活性改变在一种或多种胃肠道免 疫细胞中的炎症反应，因此减少发展结直肠癌的风险。

在一些方面，本公开主题提供用于鉴定在表达nAChRα7的至少一种 细胞中调节nAChRα7活性的化合物或剂的方法，所述方法包括：(i)使表 达nAChRα7的至少一种细胞与候选化合物或剂接触；(ii)确定与所述候 选化合物或剂接触的表达nAChRα7的至少一种细胞中nAChRα7的活性； (iii)确定没有与所述候选化合物或药剂接触的表达nAChRα7的至少一种 对照细胞中nAChRα7的活性；和(iv)对比与所述候选化合物或剂接触的 至少一种细胞中nAChRα7的活性和至少一种对照细胞中nAChRα7的活 性；其中在与所述候选化合物或剂接触的至少一种细胞中的nAChRα7活 性与至少一种对照细胞中的nAChRα7活性的差异鉴定在至少一种细胞中 调节nAChRα7活性的候选化合物或剂。

仍然在其他方面，本公开主题提供用于预测对受害于由nAChRα7的 基因或蛋白表达的异常水平导致的IBD的受治疗者施用nAChRα7表达调 节剂的治疗效果的方法，其中nAChRα7表达调节剂是nAChRα7拮抗剂或 nAChRα7激动剂，所述方法包括：(a)测量在施用nAChRα7调节剂之前 受治疗者的组织或细胞中nAChRα7的基因或蛋白表达水平；(b)以有效 改变受治疗者的组织或细胞中nAChRα7基因或蛋白表达水平的量对受治 疗者施用nAChRα7调节剂；(c)测量来自于施用nAChRα7调节剂之后的 受治疗者的组织或细胞中的nAChRα7的基因或蛋白表达水平；和(d)确 定施用nAChRα7调节剂之后的组织或细胞中nAChRα7的基因或蛋白表达 水平相比较于施用nAChRα7调节剂之前的组织或细胞中的基因或蛋白表 达水平的改变；其中在组织或者细胞中的nAChRα7基因或蛋白表达水平 的改变预测nAChRα7表达调节剂对受害于IBD的受治疗者的治疗效果。

在一些方面，本公开主题提供药物组合物，其包括有效调节nAChRα7 的功能以治疗或预防有相应治疗需要的受治疗者的炎性肠病(IBD)的量 的烟碱型乙酰胆碱受体α7(nAChRα7)的特异性激动剂或特异性拮抗剂。

本公开主题的某些方面已在上文中陈述，其被本公开主题全部或部分 地提及；当与下文中最佳描述的所附实施例和附图联系起来时，其他方面 将随着描述进行而变得明显。

附图简述

已用一般术语这样描述了本公开主题，现在将参考附图，附图不一定 按比例绘制，并且其中：

图1显示来自微阵列谱的代表性的分级聚类(hierarchical clustering)， 显示IBD中不同的表达模式。每一行表示基因，且每一列表示独立的生物 样品。免疫细胞中基因表达图谱的聚类分析显示了差异模式，其被聚类为 如下显示的四组：正常(N)，CD，UC，和正常(N)。阴影表示下调或者 过度表达，而黑色表示类似的表达；

图2显示由DFA鉴定的10个基因的判别潜力。DFA被用于选择最大 判别变量(maximal discriminatory variable)，并且UC、CD和健康对照被 分组为3个不同的位置；

图3显示由基因微阵列鉴定并由QRT-PCR确认的nAChRα7在UC、 CD和未受影响的对照中的差异基因表达模式。左图：微阵列数据：来自 免疫细胞的标准化的nAChRα7表达水平描述在UC和CD中独特的差异基 因表达模式。N：嗜中性粒细胞；P：PMBC；Ctrl：对照。右图：QRT-PCR 对微阵列结果的验证。QRT-PCR确认了nAChRα7的基因表达结果和来自 PBMC的五(5)个其他选择的基因的基因表达结果(数据未显示)；

图4证明在CD相对于UC的淋巴细胞中nAChRα7介导不同的免疫调 节图谱。显示了来自于UC和CD中处理过的转化的淋巴细胞相比于未处 理的细胞的上清液中的细胞因子图谱的比例(至少三个类似实验中的一 个)。处理包括烟碱[2μM(+)和20μM(++)]以及在添加烟碱之前使用 选择性拮抗剂α-环蛇毒素(α-bungarotoxin)[2nM(+)和20nM(++)] 的预处理。A图：细胞因子IL-10和细胞因子/趋化因子IL-8。图B：趋化 因子。对于所有未受影响的对照，加入烟碱或α-环蛇毒素自身表现了非显 著性的细胞因子/趋化因子的改变(未显示)。Nic：烟碱。Antg：选择性拮 抗剂α-环蛇毒素；

图5显示烟碱和nAChRα7特异性激动剂对“CD样”TNBS结肠炎和 “UC样”DSS结肠炎的进程的相反的效果。这些IBD小鼠模型被认为是“CD 样”或“UC样”不仅因为它们的疾病表型分别与人类CD或UC相类似，而 且因为它们的细胞因子图谱与人类CD或UC相类似，尤其是TNBS或DSS 模型的慢性模型，如前所述的(Alex等人，2009 IBD，15(3)，341-352)。这 些实验性小鼠结肠炎模型如前所述的产生(Alex等人，2009 IBD，15(3)， 341-352)。乙醇：TNBS的对照；Nic：烟碱；α7Ag：nAChRα7激动剂PNU 282987(PNU)；

图6显示了nAChRα7激动剂对于UC样DSS结肠炎不仅是预防性的， 而且是治疗性的。在急性模型中，小鼠用或不用nAChRα7激动剂药物处 理，持续5天。然后给予DSS，持续7天。评价临床活动性评分(clinical  activity score)。在慢性模型中，小鼠被给予DSS，持续7天，然后给予七 天的水。这些DSS-水的循环被继续重复再3次。在第四个循环的末尾，甚 至没有DSS下，小鼠发展为慢性结肠炎，其有大约3的临床活动性评分。 在这时，nAChRα7激动剂被给予一组小鼠(one set of mice)并且跟踪所有 小鼠11天。在急性模型和慢性模型中，疾病(结肠炎)基本上消失并且小 鼠看起来与对照小鼠(无DSS处理)没有差别。箭头指示在慢性模型中 nAChRα7激动剂处理的开始(第53天)；

图7显示MLA药物(nAChRα7特异性拮抗剂)的预处理可以有效预 防小鼠发展CD样TNBS结肠炎。用PBS(对照)、或烟碱、PNU(α7激 动剂)、或MLA药物通过腹腔注射每天一次持续5天预处理C57BL/6小鼠。 然后使用TNBS(在50％乙醇中)或仅50％乙醇作为对照诱导小鼠发展结 肠炎，持续7天。每天监控所有小鼠的疾病活动。在使用MLA(α7拮抗 剂+TNBS)预处理的TNBS处理的小鼠中，疾病(结肠炎)基本上消失。 这些MLA处理的小鼠看起来与无TNBS的对照小鼠(乙醇)没有差别。 相反，使用烟碱(烟碱+TNBS)或PNU(α7激动剂+TNBS)预处理的小 鼠，与仅TNBS处理(TNBS)相比，显示均没有治疗性益处，甚至恶化 疾病活动。

图8显示使用nAChRα7特异性拮抗剂(Antg；MLA)处理有效逆转 慢性CD样TNBS诱导的结肠炎的疾病进程。慢性TNBS结肠炎模型的诱 导如前所述(Alex等人，2009IBD，15(3)，341-352)。拮抗剂处理的结肠炎 小鼠的DAI与对照小鼠(使用乙醇(E-OH)处理)相似。nAChRα7激动 剂(Ag；PNU)和烟碱显示无显著性效果。使用ANOVA和Tukey检验 (Tukey’s test)进行统计学分析；p＜0.05。N≥12每组；

图9显示使用nAChRα7拮抗剂的处理逆转TNBS诱导的结肠炎症： (A)来自于具有处理的慢性TNBS诱导的结肠炎的小鼠的结肠是更短的， 发炎的，并充满了血性和软的粪便；(A-c)，而来自于拮抗剂处理的结肠 炎小鼠的结肠是完全正常的外观(A-d)，与对照小鼠(A-a&b)相比几乎 没有差别；(B)使用H&E染色进行的组织学分析显示拮抗剂处理的TNBS 小鼠有正常的结肠粘膜并且几乎没有炎症迹象(B-c)，如在未经TNBS处 理过的小鼠中看到的一样(B-b)。显示了至少十个独立实验的代表；

图10显示nAChRα7特异性激动剂和拮抗剂都对nAChRα7缺陷性小 鼠的DSS或TNBS诱导的结肠炎无任何治疗性效果，表明这些药物的特异 性。野生型(WT)nAChRα7缺陷性(nAChRα7敲除；α7KO)小鼠，均 以C57B/6为背景，使用DSS(A)或TNBS(B)诱导发展结肠炎。尽管 在野生型小鼠中激动剂(PNU)和拮抗剂(MLA)分别有效预防DSS和 TNBS诱导的结肠炎，在nAChRα7KO小鼠中它们对任何一种结肠炎都完 全没有展现出任何效果。这些数据进一步说明这些激动剂和拮抗剂对 nAChRα7的靶特异性；测量值中的统计学差异通过ANOVA和Tukey检验 以5％显著性水平评价。N≥6每组；

图11显示经历了迷走神经切断术的小鼠完全丧失了nAChRα7激动剂 对结肠炎发展的保护作用：(A)在迷走神经切断术之前和之后：基于在之 前的报道(Verma-Gandhu等人，Gut 2007：56：358-364)基础上修改的方案 进行迷走神经切断术。简单而言，C57B/6小鼠(7周龄)的胃食管连接处 (以白色箭头标出)的左迷走神经分支(大约5-10mm；以双头箭头表示) 在显微镜放大下(10×)被使用电灼术切断(S，胃；E，食管)。手术开口 使用可吸收的缝合线缝合。假手术包括除了迷走神经切断以外同样的步骤 (仅暴露)。给予经历了迷走神经切断术的小鼠7天的时间恢复。经历了 手术(迷走神经切断术和假手术)的所有30只小鼠100％存活而没有并发 症，并且恢复至正常。然后以IP给予小鼠nAChRα7激动剂，持续5天， 之后进行DSS处理(7天)以诱导结肠炎；(B)经历了迷走神经切断术的 小鼠(迷走神经切断术)没有展现nAChRα7激动剂对结肠炎的任何保护 性效果，而经历了假手术的小鼠(假手术)反应与没有经历任何手术的小 鼠反应一样良好(见图5和6)。测量值的统计学差异使用Wilcoxon轶和 检验(Wilcoxon rank-sums test)(P＜0.05)评价。N≥5每组；

图12显示nAChRα7激动剂对于GPX 1/2DKO结肠炎有治疗效果。 缺乏两个谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)Gpx1和Gpx2的小鼠[Gpx1/2双敲 除(DKO)小鼠]在混合的C57BL/6和129S1/SvJ(B6.129)基因背景下有 回结肠炎的倾向。评价临床活动性评分。对照(来自于混合的C57BL/6和 129S1/SvJ(B6.129)基因背景)未发展严重的结肠炎，而GPX1/2 DKO小 鼠被发现发展临床活动性评分大约为9的严重结肠炎。在用nAChRα7激 动剂处理的GPX1/2 DKO小鼠中，疾病(结肠炎)的发展显著减少。然而 使用nAChRα7拮抗剂或盐水处理的GPX1/2 DKO小鼠在结肠炎评分上没 有展现显著性改变；

图13显示判别功能分析(Discriminant Functional Analysis)(DFA)鉴 定细胞因子/趋向因子的变量，其可以充分的区分一个疾病类型与其他疾病 类型以及区分治疗响应者(therapeutic responder)与对照。DSS诱导的和 TNBS诱导的结肠炎形成不同的组，其在图谱上与对照相远离，并且彼此 相远离。另一方面，用激动剂处理的DSS诱导的小鼠和用拮抗剂处理的 TNBS诱导的小鼠在图谱上非常靠近于对照和彼此——在各自药物的有效 处理后，细胞因子图谱从疾病状态向正常状态清楚的转移；和

图14显示强迫游泳实验显示nAChRα7激动剂(PNU)对小鼠行为没 有可测量的效果。通过在圆柱形容器中强迫小鼠游泳6分钟进行测试。小 鼠被分为4组：(a)对照；(b)接受IP激动剂的小鼠；(c)用DSS诱导 的小鼠；和(d)接受IP激动剂并用DSS诱导的小鼠(n＝6每组)。在25℃ 有13cm水的容器中不动(immobility)的总持续时间被评分。不动被定义 为当小鼠在水中停止挣扎并保持漂浮静止，仅做出维持其头在水面上所必 需的动作时。第0天和第7天表示DSS处理的天。

详细描述

本公开主题现在将在下文根据附图被更完全的描述，在附图中显示本 公开主题的一些但不是所有实施方案。贯穿全文类似的数字指相似的要 素。本公开主题可以以很多不同形式被实施并不应该解释为限于本文陈述 的实施方案；反而，提供这些实施方案以使本公开满足适用的法律要求。 的确，受益于前述描述和相关附图中呈现的教导的本公开主题所属领域技 术人员会想到本文陈述的本公开主题的很多修改和其他实施方案。因此， 要理解，本公开主题不受限于所公开的具体的实施方案，并且旨在将修改 和其他实施方案包括在所附加权利要求的范围内。

I.用于治疗溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)的nAChRα7激 动剂和nAChRα7拮抗剂

在一些实施方案中，本公开主题鉴定了烟碱型乙酰胆碱受体α7 (nAChRα7)是调节吸烟(烟碱)对CD相比于UC的相反效果的主要的 调节因子。因此，本公开主题将nAChRα7鉴定为IBD的新治疗靶。本公 开主题提供nAChRα7的特异性激动剂和拮抗剂，以及它们作为用于治疗 和管理UC和CD的治疗剂的用途。

A.在IBD中吸烟(烟碱)的作用

炎性肠病(IBD)是一种流行的慢性进行性多因子的胃肠(GI)道炎 性疾患，其表现在两个不同的常见实体中：溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩 病(CD)。Xavier R.J.，Podolsky D.K，“Unravelling the pathopenesis of  inflammatory bowel disease，”Nature 488：427-434(2007)。正如本文使用的短 语“炎性肠病”或“IBD”旨在包括两种影响胃肠道的慢性疾病，称为克罗恩 病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)。术语克罗恩病和溃疡性结肠炎的含义是 被医学领域的专业技术人员所普遍接受的定义。

仅在美国就有超过一百万被诊断的患者，IBD在西方人口中有大约 0.2％的患病率并且有大量的患病和健康护理花费。Loftus E.V.，Jr.，“℃linical  epidemiology of inflammatory bowel disease：Incidence，prevalence，and  environmental influences，”Gastroenterology 126：1504-1517(2004)。结肠的 IBD的主要并发症是增加的发展结直肠癌(CRC)的风险，主要是由于慢 性GI炎症。Shanahan F.，“Review article：colitis-associated cancer--time for  new strategies 1，”Aliment Pharmacol Ther 18 Suppl 2：6-9(2003)；Campbell  B.J.，Yu L.G.，Rhodes J.M.，“Altered glycosylation in inflammatory bowel  disease：a possible role in cancer development，”Glycoconj J 18：851-858 (2001)。有趣的是，吸烟对UC的进程有有益的影响，并且对CD的进程有 有害的影响。Birrenbach T.，Bocker U.，“Inflammatory bowel disease and  smoking：a review of epidemiology，pathophysiology，and therapeutic  implication，”Inflamm Bowel Dis 10：848-859(2004)；Rubin D.T.，Hanauer S.B.， “Smoking and inflammatory bowel disease，”Eur J Gastroenterol Hepatol  12：855-862(2000)；Thomas G.A.，Rhodes J.，Ingram J.R.，“Mechanisms of  disease：nicotine--a review of its actions in the context of gastrointestinal  disease，”Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol 2：536-544(2005)；和Ingram  J.R.，Rhodes J.，Evans B.K.，Thomas G.A.，“Preliminary observations of oral  nicotine therapy for inflammatory bowel disease：an open-label phase I-II study  of tolerance，”Inflamm Bowel Dis 11：1092-1096(2005)。

溃疡性结肠炎(UC)已经被鉴定为主要是非吸烟者和/或曾吸烟者的 疾病，并且，尽管吸烟的开始保护和改善UC的进程，但吸烟的终止恶化 UC的进程。尽管烟碱，吸烟中的活性部分，作为治疗在临床试验中展示 了对UC的显著临床疗效，但是其应用被可观的耐受性变化和副作用所限 制。相反，大约72％的CD患者是吸烟者，而且，尽管吸烟增加了CD的 风险并且恶化了CD的进程使其达到更严重的形式(结构化或者瘘管化)， 但是吸烟的终止显著改善CD。Birrenbach T.，Bocker U.，“Inflammatory  bowel disease and smoking：a review of epidemiology，pathophysiology，and  therapeutic implication，”Inflamm Bowel Dis 10：848-859(2004)。吸烟在CD 和UC上的相反效果的分子机制数十年来仍保持神秘。

B.烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)

烟碱已被阐明通过其对nAChR的活性触发炎性级联反应，nAChR是 一个配体门控离子通道家族，该家族由多种同源五聚体(homopentameric) 或异源五聚体(heteropentameric)受体亚基形成，其由两个亚家族9α (α2-α10)和3β(β2-β4)组成并在神经系统和非神经组织(如免疫细胞 和肠上皮细胞)中均有表达。Gaimarri A.，Moretti M.，Riganti L.，Zanardi A.， Clementi F.，Gotti C.，“Regulation of neuronal nicotinic receptor traffic and  expression，”Brain Res Rev 55：134-143(2007)。烟碱是对UC相比于CD起 相反效果的主要的药理成分。Thomas G.A.，Rhodes J.，Ingram J.R.， “Mechanisms of disease：nicotine--a review of its action in the context of  gastrointestinal disease，”Nat Clin Prac Gastroenterol Hepatol 2：536-544 (2005)。

烟碱在UC治疗中的临床疗效表明NAChR是基于烟碱的治疗的最有 可能的靶。然而其临床应用，被可观的耐受性的变化和副作用所限制，这 很可能是因为烟碱对nAChR的配体特异性。近期研究表明，烟碱特别地 通过抑制巨噬细胞中促炎细胞因子的产生而充当抗炎剂。 Gallowitsch-Puerta M.，Tracey K.J.，″Immunologic role of the cholinergic  anti-inflammatory pathway and the nicotinic acetylcholine alpha 7 receptor，″ Ann N Y Acad Sci 1062：209-219(2005)。这个现象被定义为“胆碱能抗炎通 路”，其中神经肽作为神经免疫轴的分子基础，该通路通过自主神经系统 (ANS)向免疫系统提供抗炎反馈。Tracey K.J.，″The inflammatory reflex，″ Nature 420：853-859(2002)。这个通路已知通过传出迷走神经从神经胆碱能 抗炎信号传递并且受到nAChR的特异性调节；特别是免疫细胞上表达的 nAChRα7。Wang H.，Yu M.，Ochani M.，Amelia C.A.，Tanovic M.，Susarla S.， Li J.H.，Wang H.，Yang H.，Ulloa L.，Al-Abed Y.，Czura C.J.，Tracey K.J.， ″Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit is an essential regulator of  inflammation，″Nature 421：384-388(2003)；de Jonge W.J.，van der Zanden E. P.，The F.O.，Bijlsma M.F.，van Westerloo D.J.，Bennink R.J.，Berthoud H.R.， Uematsu S.，Akira S.，van den Wijngaard R.M.，Boeckxstaens G. E.， ″Stimulation of the vagus nerve attenuates macrophage activation by activating  the Jak2-STAT3 signaling pathway，″Nat Immunol 6：844-851(2005)；Floto R. A.，Smith K.G.，″The vagus nerve，macrophages，and nicotine，″Lancet 361： 1069-1070(2003)；Ghia J.E.，Blennerhassett P.，Kumar-Ondiveeran H.，Verdu  E.F.，Collins S.M.，″The vagus nerve：a tonic inhibitory influence associated  with inflammatory bowel disease in a murine model，″Gastroenterology 131： 1122-1130(2006)。

nAChRα7是近年来最被广泛研究的nAChR。Mazurov A.，Hauser T.， Miller C.H.，″Selective alpha7 nicotinic acetylcholine receptor ligands，″Curr  Med Chem 13：1567-1584(2006)。最近增加了对nAChRα7配体和它们的用 途的兴趣，并且这些剂中很多在进行临床试验(但不是针对IBD)。这些进 展提供鉴定和设计/合成nAChRα7特异性药物的分子基础。

C.代表性实施方案

本公开主题鉴定了nAChRα7作为调节吸烟(即烟碱暴露)对CD相对 于UC的相反的效果的主要调节因子。首先，通过来自于IBD患者的淋巴 细胞和嗜中性粒细胞的基因表达图谱发现烟碱型乙酰胆碱受体α7亚型 (nAChRα7)，相比于未受影响的对照而言，在克罗恩病(CD)患者中显 著过度表达，但在溃疡性结肠炎(UC)患者中被下调。不期望受到任何一 种具体理论束缚，假设吸烟可能通过nAChRα7对UC相比于CD导致相反 的效果。为检验此假设，使用非特异性配体(烟碱)和若干特异性配体(包 括PNU 282987(PNU)，GTS-21，和MLA，如下文所定义的)以检测它 们对小鼠IBD模型中UC样DSS结肠炎和CD样TNBS结肠炎的效果，这 些小鼠模型是在基本上所有IBD的治疗性药物的临床前研究中最普遍使用 的动物模型。

在一些实施方案中，本公开主题阐明了nAChRα7激动剂PNU 282987 (N-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基]-4-氯苯甲酰胺)和3-(2，4-二甲氧基苯 亚甲基)假木贼因(3-(2，4-dimethoxybenzylidene)anabaseine，GTS-21，本文 也被称为DMXB-A)对UC样结肠炎是高度有效的治疗药，但恶化CD样 结肠炎，该观察结果与吸烟对人类UC相比于CD的效果极其类似。

另一方面，在其他的实施方案中，本公开主题阐明了nAChRα7拮抗 剂甲基牛扁亭(MLA)是对CD样结肠炎高度有效的治疗剂，但对UC样 结肠炎无效果。再次重申，不期望受到任何一种具体理论束缚，相信这些 激动剂和拮抗剂通过调节抗炎细胞因子和促炎细胞因子的作用而发挥作 用。例如，激动剂能够刺激抗炎细胞因子，而抑制促炎细胞因子。而且， 本公开主题阐明了PNU和MLA的效果是特异性通过nAChRα7的，因为 其效果在被诱导产生IBD的nAChRα7缺陷小鼠中没有被观察到。因此， 本公开主题不仅表征吸烟对IBD的效应，而且鉴定了nAChRα7作为用于 CD和UC的治疗干预的分子靶。

更特别地，在一些实施方案中，本公开主题提供了用于治疗有相应治 疗需要的受治疗者的炎性肠病(IBD)的方法，所述方法包括以有效调节 所述受治疗者中至少一种细胞中的nAChRα7的活性的量对受治疗者施用 烟碱型乙酰胆碱受体α7(nAChRα7)拮抗剂，借此至少一种细胞中的 nAChRα7活性的调节治疗受治疗者的IBD。在一些实施方案中，IBD包括 克罗恩病(CD)。

在其他实施方案中，本公开主题提供用于治疗有相应治疗需要的受治 疗者的炎性肠病(IBD)的方法，所述方法包括以有效调节所述受治疗者 中至少一种细胞中的nAChRα7的活性的量对受治疗者施用烟碱型乙酰胆 碱受体α7(nAChRα7)激动剂，借此至少一种细胞中的nAChRα7活性的 调节治疗受治疗者的IBD。在一些实施方案中，IBD包括溃疡性结肠炎 (UC)。

术语活性剂的“有效量”指引出期望的生物学反应所必需的量。正如将 被本领域普通技术人员所了解的，剂的有效量可能随各种因素而改变，这 些因素例如期望的生物学终点，被递送的剂，药物组合物的组成，靶组织 或细胞，诸如此类。更特别地，术语“有效量”指足以产生期望效果的量， 所述期望效果例如减少或改善严重性、持续时间、进程，或疾病、病症或 疾患(例如与丧失细胞功能相关的疾病，病症或疾患)的发作或其一个或 多个症状；预防疾病、病症或疾患的进展；导致疾病、病症或疾患的消退； 预防与疾病、病症或疾患有关的症状的复发、发展、发作或进展；或增强 或改善另一种治疗的预防或治疗效果。根据本公开方法，化合物的有效量 的范围可以是，例如从约0.001mg/kg到约1000mg/kg，或在某些实施方 案中，从约0.01mg/kg到约100mg/kg，或在某些实施方案中，从约0.1mg/kg 到约50mg/kg。正如本领域技术人员意识到的，有效剂量还随如下而变化： 治疗的疾患，施用途径，赋形剂使用，受治疗者的年龄和性别，和与其他 治疗性治疗(例如使用其他药剂)共同使用的可能性。应了解，为到达期 望生物学反应所需要的化合物的量可能与化合物对于其他目的有效的量 不同。

正如本文使用的，术语“激动剂”被定义为刺激或诱导nAChRα7活性的 物质。术语“拮抗剂”被定义为阻断或抑制nAChRα7活性的物质。在一些实 施方案中，nAChRα7受体激动剂或拮抗剂包括小分子抑制剂，其包括但不 限于如下提供的示例性的激动剂和拮抗剂。但是，nAChRα7活性可以通过 本领域技术人员已知的任何方法调节，包括但不限于生物剂例如特异性抗 体的使用，通过基因疗法增加基因表达，或通过RNAi抑制基因表达。

在特别的实施方案中，选择性的nAChRα7激动剂选自由以下组成的 组：PNU 282987(N-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基]-4-氯苯甲酰胺)、MEM 3454、PH-399733、AR-R1779、SSR180711A(4-溴苯基1，4二氮杂双环(3.2.2) 壬烷-4-羧酸酯，单盐酸盐(4-bromophenyl 1，4diazabicyclo(3.2.2) nonane-4-carboxylate，monohydrochloride))、ABT-418(3-甲基-5-[(2S)-1-甲 基吡咯烷-2-基]-1，2-噁唑)、甲碘可卡因(cocaine methiodide)、3-2，4-二甲氧 基苯亚甲基假木贼因(GTS-21或DMXB-A)、3-(4-羟基苯亚甲基)假木贼因、 3-(4-甲氧基苯亚甲基)假木贼因、3-(4-氨基苯亚甲基)假木贼因、3-(4-羟基 -2-甲氧基苯亚甲基)假木贼因、3-(4-甲氧基-2-羟基苯亚甲基)假木贼因、反 式-3-亚肉桂基假木贼因、反式-3-(2-甲氧基-亚肉桂基)假木贼因、和反式 -3-(4-甲氧基亚肉桂基)假木贼因。

在其他实施方案中，选择性的nAChRα7激动剂选自由以下组成的组： N-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基]-4-(4-羟基苯氧基)苯甲酰胺、N-[(3R)-1- 氮杂双环[2.2.2]辛-3-基]-4-(4-乙酰氨基苯氧基)苯甲酰胺、N-[(3R)-1-氮杂双 环[2.2.2]辛-3-基]-4-(苯基硫烷基苯氧基)苯甲酰胺 (N-[(3R)-1-azabicyclo[2.2.2]oct-3-y1]-4-(phenylsulfanylphenoxy)benzamide) 、N-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基]-4-(3-氯苯磺酰基)苯甲酰胺、和(1-氮杂 -双环[2.2.2]辛-3-基)氨基甲酸1-(2-氟苯基)-乙酯。

在下列专利申请中描述了适用于本公开主题的选择性nAChRa7激动 剂：PCT/US2006/022136；PCT/US1998/17850；PCT/EP2007/005724； WO99/62505；WO99/03859；WO97/30998；WO01/36417；WO02/15662； WO02/16355；WO02/16356；WO02/16357；WO02/16358；WO02/17358， 美国专利申请公开第2006/0166974号；2006/0128676号；2005/0282823号； 2005/0165047号；2004/0044026号；2004/0229868号，以及MazurovA.， Hauser T.，Miller C.H.，“Selective alpha7 nicotinic acetylcholine receptor  ligands，”Curr Med  Chem 13：1567-1584(2006)，上述每一个均被通过引用全 部并入本文。

在某些实施方案中，nAChRα7激动剂选自由nAChRα7特异性抗体、 nAChRα7特异性抑制性RNA或其组合所组成的组。

在一些实施方案中，选择性nAChRα7拮抗剂包括α-环蛇毒素和甲基 牛扁亭(MLA)。在下列文献中描述了另外的选择性nAChRα7拮抗剂的实 例：Mazurov A.，Hauser T.，Miller C.H.，“Selective alpha7 nicotinic  acetylcholine receptor ligands，”Curr Med Chem 13：1567-1584(2006)，其在此 通过引入全部并入。在某些实施方案中，nAChRα7拮抗剂选自由nAChRα7 特异性抗体、nAChRα7特异性抑制性RNA或其组合组成的组。

在其他实施方案中，nAChRα7受体的配体包括但不限于二氮杂双环烷 衍生物，例如如WO2005/028477中描述的；螺环奎宁环醚(spirocyclic  quinuclidinic ether)衍生物，例如如WO2005/066168中描述的；稠合的双 环杂环取代的奎宁环衍生物，例如如美国专利申请公开第US2005/0137184 号；US2005/0137204号；和US2005/0245531号中描述的；3-奎宁环基氨 基-取代的联芳衍生物，例如如WO2005/066166中描述的；3-奎宁环基杂 原子桥接的联芳衍生物，例如如WO2005/066167中描述的；和氨基取代的 三环衍生物，例如如WO2005/077899中描述的，上述的每一个都被通过引 用全部并入。

贯穿说明书和权利要求书，给定的化学式或名称应该包括所有互变异 构体、同源化合物(congener)、以及光学和立体异构体，和其中存在这种 异构体和混合物的消旋混合物。

在一些实施方案中，治疗包括预防受治疗者的IBD的发展或预防受治 疗者的IBD的进展。术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”及其语 法衍生物旨在包括疾病状态和病症的治疗、管理、预防和治愈。

术语“受治疗者”指生物体、组织或细胞。受治疗者可以包括用于医学 目的的人类受治疗者，医学目的例如现存病症或疾病的诊断和/或治疗，或 预防病症或疾病的发作的预防性治疗，或用于医学、兽医学目的或发育目 的的动物受治疗者。受治疗者还可以包括来自于组织培养、细胞培养、器 官复制、干细胞生产诸如此类的样品材料。合适的动物受治疗者包括哺乳 动物和禽类。本文使用的术语“哺乳动物”包括但不限于灵长类，例如人， 猴子，猿，和诸如此类；牛类，例如牛，阉牛(ox)，和诸如此类；绵羊 类(ovines)，例如绵羊(sheep)和诸如此类；山羊类(caprines)，例如山 羊(goat)和诸如此类；猪类，例如猪，肉猪(hog)和诸如此类；马类， 例如马，驴，斑马和诸如此类；猫类，包括野生和家养的猫；犬类，包括 狗；兔类，包括家兔(rabbit)，野兔(hare)和诸如此类；和啮齿类，包 括小鼠，大鼠，和诸如此类。本文使用的术语“禽类”包括但不限于，鸡， 鸭，鹅，鹌鹑，火鸡和野鸡。优选地，受治疗者为哺乳类动物或哺乳类细 胞。更优选地，受治疗者是人类或人类细胞。人类受治疗者包括但不限于， 胎儿，新生儿，婴儿，青少年，和成人受治疗者。而且，“受治疗者”可以 包括受害于或怀疑正受害于病症或疾病的患者。因此，术语“受治疗者”和 “患者”在本文可互换使用。受治疗者还可以指实验室中的细胞或细胞收集 物或用于活性、分化、标志物生产、表达和诸如此类的测试中的生物处理 培养物。

在一些实施方案中，受治疗者是啮齿类，例如小鼠，其已被化学诱导 为IBD模型。在特定的实施方案中，小鼠模型是下列的一个或多个：(a) 暴露于葡聚糖硫酸钠(DSS)以诱导溃疡性结肠炎样病症的小鼠；(b)暴 露于三硝基苯磺酸(TNBS)以诱导克罗恩病样病症的小鼠；(c)诱导产 生结肠炎的nAChRα7缺陷小鼠；或(d)缺失两种谷胱甘肽过氧化物酶 (GPX)Gpx1和Gpx2，[Gpx1/2-双敲除(DKO)小鼠]，并进而发展出回 结肠炎的小鼠。

在其他的实施方案中，本公开方法针对真核细胞，优选哺乳动物细胞， 且更优选人类细胞。细胞或细胞系可以通过商业获得或可以从哺乳动物组 织中分离。适合用于本公开方法的细胞还可以作为组织或器官制备物的一 部分存在。细胞不限于可以从大鼠、猫、马、小鼠、仓鼠、鸡、绵羊、山 羊、猪、牛、兔、非人类灵长类、和人类中获得。

在其他的实施方案中，本公开主题提供用于调节至少一种免疫细胞类 型中的nAChRα7活性的方法，所述方法包括使至少一种免疫细胞类型与 有效调节至少一种免疫细胞类型中的nAChRα7活性的量的nAChRα7拮抗 剂或nAChRα7激动剂接触。

正如本文使用的，短语“免疫细胞”意在表示在哺乳动物免疫反应中发 挥功能的那些细胞，免疫反应包括细胞介导的免疫反应和体液免疫反应。 该短语包括但不限于，淋巴细胞、抗原特异性细胞毒T淋巴细胞、嗜中性 粒细胞、外周血单核细胞(PBMC)、巨噬细胞、和自然杀伤细胞。

还在其他的实施方案中，本公开主题提供用于减少有慢性胃肠道炎症 的受治疗者发展结直肠癌的风险的方法，所述方法包括以有效调节一种或 多种胃肠道免疫细胞中的nAChRα7活性的量对受治疗者施用nAChRα7拮 抗剂或nAChRα7激动剂，借此调节nAChRα7活性改变一种或多种胃肠道 免疫细胞中的炎症反应，因此减少发展结直肠癌的风险。

在另外的实施方案中，本公开主题提供用于鉴定调节表达nAChRα7 的至少一种细胞中nAChRα7活性的化合物或剂的方法，所述方法包括：(i) 使表达nAChRα7的至少一种细胞与候选化合物或剂接触；(ii)确定与所 述候选化合物或剂接触的表达nAChRα7的至少一种细胞中的nAChRα7的 活性；(iii)确定没有与所述候选化合物或剂接触的表达nAChRα7的至少 一种对照细胞中nAChRα7的活性；和(iv)对比与所述候选化合物或剂接 触的至少一种细胞中nAChRα7的活性和至少一种对照细胞中nAChRα7的 活性；其中在与所述候选化合物或剂接触的至少一种细胞中的nAChRα7 活性与至少一种对照细胞中的nAChRα7活性的差异鉴定调节至少一种细 胞中的nAChRα7活性的候选化合物或剂。

还在另外的实施方案中，本公开主题提供用于预测对受害于由 nAChRα7的基因或蛋白表达的异常水平导致的IBD的受治疗者施用 nAChRα7表达调节剂的治疗效果的方法，其中所述nAChRα7表达调节剂 是nAChRα7拮抗剂或nAChRα7激动剂，所述方法包括：(a)测量在施用 nAChRα7调节剂之前受治疗者的组织或细胞中nAChRα7的基因或蛋白表 达水平；(b)以有效改变受治疗者的组织或细胞中nAChRα7基因或蛋白 表达水平的量对受治疗者施用nAChRα7调节剂；(c)测量来自于施用 nAChRα7调节剂之后的受治疗者的组织或细胞中的nAChRα7的基因或蛋 白表达水平；和(d)确定施用nAChRα7调节剂之后的组织或细胞中 nAChRα7的基因或蛋白表达水平相比较于施用nAChRα7调节剂之前的组 织或细胞中的基因或蛋白表达水平的改变；其中在组织或者细胞中的 nAChRα7基因或蛋白表达水平的改变预测nAChRα7表达调节剂对受害于 IBD的受治疗者的治疗效果。

在一些实施方案中，在受害于IBD的受治疗者中nAChRα7被过度表 达至异常水平，且基因或蛋白表达水平的降低预测对施用nAChRα7调节 剂的正反应。在其他实施方案中，在受害于IBD的受治疗者中nAChRα7 的表达被下调至异常水平，且基因或蛋白水平的增加预测对施用nAChRα7 调节剂的正反应。

在一些实施方案中，使用一种或多种方法确定基因表达水平的改变， 所述方法选自由RNA印迹法、RT-PCR、实时RT-PCR、原位杂交和微阵 列组成的组。在其他的实施方案中，蛋白表达水平的改变使用选自由以下 组成的组的一种或多种方法确定：蛋白质印迹法、ELISA、质谱、免疫组 织化学和蛋白质阵列。

因此，在一些实施方案中，本公开方法可以用于诊断，用于预后或疾 病状态或病症的监控。正如本文使用的，术语“诊断”指预测性的过程，其 中评价了疾病、疾患或其他医学病症的存在、不存在、严重性或治疗进程。 为了本文的目的，诊断还包括用于确定治疗结果的预测性的过程。类似的， 术语“诊断”指确定受治疗者是否展现病症或疾病的一个或多个特征。术语 “诊断”包括确立例如靶抗原或结合试剂的靶的存在或不存在，或确立或以 其他方式确定病症或疾病的一个或多个特征，包括类型、等级、阶段、或 类似情况。正如本文使用的，术语“诊断”可以包括区分疾病的一个形式与 另一个形式。术语“诊断”包括最初的诊断或检测，预后，和病症或疾病的 监控。另外，例如在“疾病或病症进程的监控”中的术语“监控”指进行中的 对从具有或疑似具有疾病或病症的受治疗者获得的样品的诊断。术语“预 后”及其衍生形式指确定或预测疾病或病症的进程。疾病或病症的进程可以 例如基于生命预期或生命质量来确定。“预后”包括接受治疗或不接受治疗 的情况下，疾病或病症的时间进程的确定。在考虑治疗的情况下，预后包 括确定对于疾病或病症的疗效。正如本文使用的，术语“风险”指预测性过 程，其中评价特定结果的可能性。

因此，本公开主题包括监控nAChRα7基因表达和/或蛋白水平作为IBD 患者治疗性反应的预后性测量。响应于治疗剂的对nAChRα7基因表达和/ 或蛋白水平的效果可以提供用于确定患者是否对治疗有反应的手段。在 nAChRα7过度表达的情况下，例如克罗恩病(CD)的患者，基因/蛋白表 达水平的降低应该指示对于治疗的正反应。在nAChRα7下调的情况下， 例如溃疡性结肠炎的患者，基因/蛋白的表达水平的增加应该指示对于治疗 的正反应。可以使用本领域技术人员已知的任何方法完成检测基因表达水 平的方法，包括但不限于上文中刚公开的那些方法。这些方法可以使用任 何感兴趣的组织样品中的RNA或蛋白，例如IBD组织活检，新鲜的或存 档的外科标本，存在于血液中的循环细胞，血清，尿液，和细胞系。

II.药物组合物、药盒和施用

在另一方面，本公开提供了药物组合物，其包括与药学上可接受的赋 形剂混合的单独或与一种或多种额外的治疗剂组合的一种或多种 nAChRα7拮抗剂和/或nAChRα7激动剂。本领域技术人员将意识到，药物 组合物包括上述化合物的药学上可接受的盐。

更特别的，在一些实施方案中，本公开主题提供了药物组合物，其包 括有效调节nAChRα7功能以治疗或预防有相应治疗需要的受治疗者的炎 性肠病(IBD)的量的烟碱型乙酰胆碱受体α7(nAChRα7)的特异性激动 剂或特异性拮抗剂。在一些实施方案中，所述药物组合物包括与一种或多 种无毒的药学上可接受的载体、佐剂、或赋形剂配制在一起的治疗有效量 的nAChRα7激动剂/拮抗剂。本文所述组合物或其药学上可接受的加成盐 或水合物可以根据本公开方法使用各种各样的施用途径或方式被递送至 受治疗者以避免或减少不必要的副作用。所述药物组合物可以被配制成以 固体或液体形式口服施用。

不干扰药学上可接受的载体的功能的本领域技术人员已知的各种成分 可以以有效量任选地被包括在药物组合物中。概括的说，润滑剂、粘合剂、 明胶、和/或崩解剂是合适的。其他任选的成分包括缓冲液，防腐剂，张力 调节剂，抗氧化剂，用于调节粘度或用作于增量剂的聚合物，和赋形剂， 和诸如此类。药学领域的普通技术人员已知的其他传统添加剂包括但不限 于，湿润剂，软化剂，稳定剂，和染料，且只要这些添加剂不干扰药物组 合物的治疗性质就可以被使用。使用药学领域普遍已知的方法容易制备所 述药物组合物。可以单独或与其他本公开的化合物组合和/或与其他治疗或 预防IBD的治疗剂组合施用所述化合物或其药学上可接受的盐和/或水合 物。

在其他的实施方案中，本公开主题提供了包括本公开的药物组合物的 药盒。药盒包括至少一种包含激动剂或拮抗剂、或其盐的药物组合物。药 盒还包括用于容纳组合物的容器。在一些实施方案中，药盒还包括对受治 疗者施用至少一种包含激动剂或拮抗剂、或其盐的药物组合物的指南。

合适的施用途径包括但不限于，吸入，经皮，口服，直肠，经粘膜， 肠道，和肠胃外施用，包括肌肉内，皮下，和静脉注射。在治疗和/或诊断 应用中，本公开的化合物可以被配制成用于各种施用方式，包括系统的和 外用的(topical)或局部的(1ocalized)施用。技术和配方通常可以在 Remington：The Science and Practice of Pharmacy(20^th ed.)Lippincott， Williams & Wilkins(2000)中找到。

根据本公开的化合物在一个宽的剂量范围内有效。例如，在治疗成年 人时，剂量从0.01到1000mg，从0.5到100mg，和从1到50mg每天。 确切的剂量依赖于施用途径，化合物被施用的形式，待治疗的受治疗者， 待治疗的受治疗者的体重，以及主治医生的偏好和经验。

药学上可接受的盐一般是本领域普通技术人员所熟知的，且可包括， 例如但不限于，醋酸盐，苯磺酸盐(benzenesulfonate)，苯磺酸盐(besylate)， 苯甲酸盐，碳酸氢盐，酒石酸氢盐，溴化物，乙二胺四乙酸钙，右旋樟脑 磺酸盐，碳酸盐，柠檬酸盐，乙二胺四乙酸盐，乙二磺酸盐(edisylate)， 丙酸酯十二烷基硫酸盐(estolate)，乙磺酸盐(esylate)，延胡索酸盐，葡 庚糖酸盐(gluceptate)，葡萄糖酸盐，谷氨酸盐，对羟乙酰氨基苯胂酸盐 (glycollylarsanilate)，己基间苯二酸盐(hexylresorcinate)，海巴明盐，氢 溴酸盐，盐酸盐，羟萘酸盐(hydroxynaphthoate)，碘化物，羟乙基磺酸盐 (isethionate)，乳酸盐，乳糖酸盐，苹果酸盐，马来酸盐，扁桃酸盐，甲 磺酸盐，粘酸盐(mucate)，萘磺酸盐(napsylate)，硝酸盐，巴莫酸盐 (pamoate)(双羟萘酸盐(embonate))，泛酸盐，磷酸/二磷酸盐，聚半乳 糖醛酸盐，水杨酸盐，硬脂酸盐，碱式醋酸盐，琥珀酸盐，硫酸盐，单宁 酸盐，酒石酸盐，或8-氯茶碱盐(teoclate)。其他药学上可接受的盐可以 在比如Remington：The Science and Practice of Pharmacy(20^th ed.)Lippincott， Williams & Wilkins(2000)中找到。药学上可接受的盐包括，比如，醋酸盐， 苯甲酸盐，溴化物，碳酸盐，柠檬酸盐，葡萄糖酸盐，氢溴酸盐，盐酸盐， 马来酸盐，甲磺酸盐，萘磺酸盐，巴莫酸盐(双羟萘酸盐)，磷酸盐，水 杨酸盐，琥珀酸盐，硫酸盐，或酒石酸盐。

根据被治疗的具体病症，这些剂可以被配制成液体或固体剂型并被系 统或局部地施用。本领域技术人员已知，这些剂可以以比如定时或持续的 缓释形式被递送。用于配制和施用的技术可以在Remington：The Science  and Practice of Pharmacy(20^th ed.)Lippincott，Williams & Wilkins(2000)中找 到。适当的途径可包括口服、口腔、吸入式喷剂、舌下、直肠、经皮的、 阴道、经粘膜、鼻部或肠施用；肠胃外递送，包括肌肉内、皮下、髓内注 射，以及鞘内、直接心室内、静脉内、关节内、胸骨内、滑膜内、肝内、 病灶内(intralesional)、颅内、腹膜内、鼻内、或眼内注射或其他递送方式。

对于注射，本公开的药剂可以被配制并稀释于水溶液中，比如生理学 相容的缓冲液例如Hank’s液，林格氏溶液，或生理盐水缓冲液。对于经粘 膜施用，在制剂中使用适合于所需穿透的屏障的渗透剂。这些渗透剂通常 是本领域已知的。

使用药学上可接受的惰性载体将用于本公开实践的本文所公开的化合 物配制成适于系统施用的剂量(dosage)在本公开的范围内。使用适当选 择的载体和合适的制造实践，本公开的组合物，特别是那些配制成为溶液 的组合物，可以在肠胃外施用，比如通过静脉注射。可以使用被本领域熟 知的药学上可接受的载体容易地将化合物配制成适用于口服施用的剂量。 这些载体使得本公开的化合物可配制为片、丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、 浆液、悬浮液和诸如此类的，以使待治疗的受治疗者(比如患者)口服摄 入。

对于鼻部或吸入递送，本公开的剂也可以使用本领域技术人员已知的 方法配制，且可能包括但不限于，例如溶解、稀释、或分散物质例如盐水， 防腐剂(例如苯甲基醇)、吸收促进剂、和碳氟化合物。

适合用于本公开的药物组合物包括如下组合物：其中包括有效量的活 性成分以达到其预期目的。有效量的确定在本领域技术人员的能力范围 内，特别是根据本文提供的详细公开内容。

除了活性成分之外，这些药物组合物可以包括帮助活性化合物加工成 药学可用的制品的合适的药学上可接受的载体，包括赋形剂和辅助剂。配 制成口服施用的制品可以是片剂、糖衣剂、胶囊、或溶液的形式。

口服使用的药物制品可以通过混合活性化合物和固体赋形剂，任选地 研磨得到的混合物，并且如果需要，在加入合适的辅助剂之后，加工颗粒 混合物，得到药片或糖衣核。合适的赋形剂，特别是，填充剂如糖，包括 乳糖，蔗糖，甘露醇，或山梨醇；纤维素制品，例如玉米淀粉、小麦淀粉、 大米淀粉、土豆淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、 羧甲基钠纤维素(CMC)、和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP：聚维酮)。如果需 要，可以添加崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或藻酸或其盐 例如藻酸钠。

给糖衣核提供合适的包衣。为此目的，可使用浓缩的糖溶液，其可任 选包括阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡伯波凝胶(carbopol gel)、聚 乙二醇(PEG)、和/或二氧化钛、漆用溶液(1acquer solution)，和合适的 有机溶剂或溶剂混合物。可以给药片或糖衣包衣添加染料或色素，以鉴别 或表征活性化合物剂量的不同的组合。

可口服使用的药物制品包括由明胶制成的推入配合胶囊，以及由明胶 和增塑剂(如甘油或山梨醇)制成的软的密封的胶囊。推入配合胶囊可以 包括与填充剂(如乳糖)、粘合剂(如淀粉)、和/或润滑剂(如滑石或硬脂 酸镁)和任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可被溶 解于或悬浮于合适的液体，例如脂肪油、液体石蜡、或液体聚乙二醇(PEG)。 另外，可添加稳定剂。

根据要治疗或预防的具体的病症或疾病状态，通常被施用来治疗或预 防病症的额外的治疗剂可以与本公开的激动剂和/或拮抗剂一起施用。因 此，额外的剂可以与本公开的nAChRα7拮抗剂和/或nAChRα7激动剂合并 在药物组合物中。这些额外的剂可以作为多次给药方案(multiple dosage  regimen)的一部分与包含抑制剂的组合物分开施用。可选地，这些剂可以 是与在单一组合物中的抑制剂混合在一起的单剂型的一部分。

尽管在此使用了具体的术语，它们仅在普通的和描述的意义上使用且 并非出于限制的目的。除非另外定义，在此使用的所有技术和科学术语具 有与描述的本主题所属的本领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。

遵循长时间存在的专利法律传统，术语“一个(a)”、“一(an)”和“该” 当在本申请包括权利要求中使用时指“一个或多个”。因此，例如提到“一个 受治疗者”包括多个受治疗者，除非上下文清楚地指向相反(例如多个受治 疗者)，等等。

贯穿此说明书和权利要求书，术语“包括(comprise)”、“包括 (comprises)”、和“包括(comprising)”在非排除的意义上使用，除非上 下文另外要求。类似地，术语“包含”及其语法变形旨在不限定，以使列举 的事项枚举不排除可以被替代或添加至所列举的事项中的其他类似的事 项。

出于本说明书和所附的权利要求书的目的，除非另外指明，所有在本 说明书和权利要求书中使用的表示量、大小、尺寸、比例、形状、配方、 参数、百分比、参数、数量、特征、和其他数值的数字，应理解为在所有 情况下均以术语“大约”修饰，即使术语“大约”可能没有明确地与数值、量 或范围同时出现。因此，除非作出相反的说明，在下述说明书和所附的权 利要求书中陈述的数字参数不是也不需要是准确的，但可以按需要是近似 的和/或更大或更小于所预期的，取决于寻求通过本公开主题得到的所需的 性质，其反映公差，转换因素，舍入，测量误差和诸如此类，和本领域技 术人员已知的其他因素。例如，术语“大约”，当指值时可旨在包括距指定 量值的如下变动：在一些实施方案中为±100％，在一些实施方案中为±50％， 在一些实施方案中为±20％，在一些实施方案中为±10％，在一些实施方案 中为±5％，在一些实施方案中为±1％，在一些实施方案中为±0.5％，和在一 些实施方案中为±0.1％，此类变动适于进行本公开的方法或应用本公开的 组合物。

而且，当与一个或多个数字或数字的范围联合使用时，术语“大约”应 该被理解为指所有这些数字，包括所有在范围内的数字并且通过延伸其界 限高于或低于所述数值而修改其范围。借助终点进行的数字范围的枚举包 括所有数字，例如全部整数，包括其被包括入所述范围的分数，(例如，1 到5的枚举包括1，2，3，4和5，和其分数，例如1.5，2.25，3.75，4.1， 和诸如此类)和在所述范围内的任何范围。

实施例

包括下列实施例以向本领域普通技术人员实践本公开主题的代表性 实施方案提供指导。考虑到本公开内容和本领域的大致技术水平，技术人 员可以理解，下列实施例仅旨在示例，并且许多的变化、修改和改变可以 被应用而不脱离本公开主题的范围。下述的合成描述和具体的实施例仅旨 在出于阐明的目的，并不应被解释为对以其他方法制备本公开的化合物的 任何形式的限制。

实施例1

基因表达图谱显示在IBD中的不同表达模式

从17个患者中得到外周血和结肠活检，患者平均年龄为46.53(95％ 置信水平，39.65-53.41)且患有记录的IBD(9个CD和8个UC)。该群 组还包括17个年龄和性别匹配的未受影响的健康对照。分离嗜中性粒细 胞和外周血单核细胞(PBMC)，并提取总RNA。Cy标记的cDNA与基因 组规模的微阵列杂交，所述微阵列包含21,329个基因的探针。将数据标准 化后，在进行相关性分析之前，每个样品中大约9,500个基因被表达为在 背景值之上的三(3)个标准差。分级聚类显示用于样品分类的分析方法 的稳健性，其显示，在每个亚组中存在基因表达图谱的不同聚类(见图1)。 使用判别功能分析(DFA)来鉴定在免疫细胞中的表达最大程度区分该群 组的基因。Alex P.，Szodoray P.，Knowlton N.，Dozmorov I.M.，Turner M.， Frank M.B.，Arthur R.E.，Willis L.，Flinn D.，Hynd R.F.，Carson C，Kumar A.， El-Gabalawy H.S.，Centola M.，“Multiplex serum cytokine monitoring as a  prognostic tool in rheumatoid arthritis，”Clin Exp Rheumatol 25：584-592 (2007)。

96个差异表达的基因中，使用严格的DFA选择10个基因作为具有最 高权力用于患者和对照之间的类别判别。有趣的是，在DFA根值的3D图 中，UC和CD患者和对照被分组到3个不同的位置，表明这是直接与全 部基因表达和疾病病理的组间基因表达变化和组内异质性成比例的(图 2)。nAChRα7是10个差异表达的基因中的一个。

实施例2

在CD相比于UC中鉴定的差异的nAChRα7表达模式

基因微阵列分析显示，与对照相比，在CD患者的嗜中性粒细胞和 PBMC中的nAChRα7被显著上调了，而UC患者的嗜中性粒细胞和PBMC 中的nAChRα7被下调了(图3，左图)。使用QRT-PCT证实在CD相比于 UC中的nAChRα7的表达水平(图3，右图：CD相比于UC的变化倍数 在统计学上是相同的)。因为烟碱是吸烟中的主要活性组分，并且nAChRα7 是仅有的在UC相比于CD中被差异表达的nAChR，这些数据显示 nAChRα7可能是调节在吸烟者和非吸烟者中不同的对CD的促炎作用和对 UC中的抗炎作用的关键参与者。

实施例3

在CD相比于UC中通过nAChRα7介导产生的烟碱的不同免疫调节图谱

考虑到CD相比于UC和健康者中独特的nAChRα7差异表达(图3)， 进行初步的研究以调查nAChRα7的功能贡献及其在CD相比于UC中的免 疫调节图谱。尽管IBD大致上被研究为T细胞介导的疾病，同族肠道微生 物/B/T细胞相互作用对于疾病的发病机理是重要的。研究UC、CD患者和 未受影响的对照的永生化(EBV-转化的)B淋巴细胞，以评价nAChRα7 的免疫调节图谱。对细胞进行烟碱(2μM和20μM)和nAChRα7选择性 拮抗剂α-环蛇毒素(Sigma.St.Louis)(2nM和20nM)的刺激和抑制研究， 所述细胞被培养并维持在1×10⁶个细胞的终浓度。基于夹心免疫测定的蛋 白阵列系统(生物测定夹心ELISA，其包括与针对靶蛋白的特异性单克隆 抗体偶联的染色的微球)，如前所述，Alex P.，Szodoray P.，Knowlton N.， Dozmorov I.M.，Turner M.，Frank M.B.，Arthur R.E.，Willis L.，Flinn D.， Hynd R.F.，Carson C，Kumar A.，E1-Gabalawy H.S.，Cento la M.，“Multiplex  serum cytokine monitoring as a prognostic tool in rheumatoid arthritis，”Clin  Exp Rheumatol 25：584-592(2007)；Nakayama T.，Hieshima K.，Nagakubo D.， Sato E.，Nakayama M.，Kawa K.，Yoshie O.，“Selective induction of Th2- attracting chemokines CCL17 and CCL22 in human B cells by latent  membrane protein 1 of Epstein-Barr virus，”J Virol 78：1665-1674(2004)，被用 于测定在刺激后多个时间点(24、48、72、96和120小时)释放到培养基 的22个细胞的、细胞毒的、体液的细胞因子和趋化因子的水平(图4)。 使用单一蛋白ELISA进行多个实验的验证。在这22个变量中，EBV转化 的淋巴细胞的免疫介质(immune mediator)的分泌在未受影响的对照和IBD 之间的显著变化只在5个细胞因子/趋化因子中是明显的(图4)(在两个 独立实验中再现)。这一图谱是报道的“低Th1，高Th2趋化性”B淋巴母细 胞的免疫生成的典型。Nakayama T.，Hieshima K.，Nagakubo D.，Sato E.， Nakayama M.，Kawa K.，Yoshie O.，“Selective induction of Th2-attracting  chemokines CCL17 and CCL22 in human B cells by latent membrane protein 1  of Epstein-Barr virus，”J Virol 78：1665-1674(2004)；Burdin N.，Peronne C， Banchereau J.，Rousset F.，“Epstein-Barr virus transformation induces B  lymphocytes to produce human interleukin 10，”J Exp Med 177：295-304 (1993)；Vockerodt M.，Pinkert D.，Smola-Hess S.，Michels A.，RansohoffR.M.， Tesch H.，Kube D.，“The Epstein-Barr virus oncoprotein latent membrane  protein 1 induces expression of the chemokine IP-10：importance of mRNA  half-life regulation，”Int J Cancer 114：598-605(2005)。

使用不同剂量的烟碱预处理120小时显示，在CD相比于UC中，促 炎细胞因子/趋化因子IL-8和MIP-1的显著的产生，并且在CD相比于CD 中，抗炎细胞因子IL-10生成的显著抑制(图4A)，这表明烟碱在CD中 有不同的促炎和趋化效果。烟碱在CD中抑制IL-10的效果(图4A)还表 明了一个潜在的机制，其还与已被广泛验证的在基因靶向IL-10敲除的小 鼠中发展的慢性CD样回结肠炎相一致，并且与报告的IL-10对若干结肠 炎的动物模型中的疗效相一致。Kuhn R.，Lohler J.，Rennick D.，Rajewsky K.， Muller W.，“Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis 2，”Cell  75：263-274(1993)；Ribbons K.A.，Thompson J.FL，Liu X.，Pennline K.，Clark  D.A.，Miller M.J.，“Anti-inflammatory properties of interleukin-10  administration in hapten-induced colitis，”Eur J Pharmacol 323：245-254 (1997)。由于在CD中α-环蛇毒素以100％显著地逆转烟碱的效果，这些数 据还表明CD中通过nAChRα7介导的机制的促炎效果。在新鲜分离的淋巴 细胞和嗜中性粒细胞中研究nAChRα7介导的细胞因子图谱的类似的实验 正在进行中。上述的发现强烈表明nAChRα7在调节烟碱效果方面的关键 性作用，并且表明nAChRα7作为CD治疗的治疗靶的显著潜力。

使用烟碱或nAChRα7特异性激动剂预处理预防DSS诱导的“UC样” 小鼠结肠炎(疾病表型与人类UC类似)的发展，而显著恶化“CD样”TNBS 诱导的结肠炎(疾病表型与人类CD类似)。

为得到nAChRα7作为协调烟碱在CD和UC进程中的相反效果的主要 调节者的直接证据；使用已建立好的化学诱导的小鼠IBD模型(DSS和 TNBS结肠炎)进行了一系列实验(图5-13)，所述小鼠IBD模型被广泛用 于IBD治疗性药物的临床前研究。对于CD样小鼠模型，使用BALB/c小 鼠诱导DSS结肠炎。对于CD样小鼠模型，使用BALB/c小鼠诱导TNBS 结肠炎。C57/B6或BALB/c小鼠，6-8周龄，使用烟碱(nAChRα7非特异 性配体；6mg/kg)或nAChRα7特异性激动剂(PNU；8.3mg/kg)预处理 (每天腹膜内注射)一星期。对照是没有预处理的小鼠(每个处理组总共 有大于10只小鼠)。然后，使用TNBS(600μg)诱导小鼠发展CD样结肠 炎，或者使用DSS(2.5％)诱导小鼠发展UC样结肠炎。如图5所示，对 于急性结肠炎模型的疾病活动指数(DAI)，烟碱或PNU预处理5天严重 恶化CD样TNBS结肠炎。截然相反，然而烟碱和PNU预防DSS诱导的 UC样结肠炎，其中PNU稍微更有效。结肠的形态学和组织学检测进一步 证实了DAI的变化(数据未显示)。这些小鼠模型的临床前研究结果准确 模拟了临床上被良好表征的吸烟对人类IBD的相反效果，即吸烟对CD有 害却在UC中有益。这些数据确立：(1)烟碱对CD的发病机理的作用和 对UC的治疗性益处；和(2)nAChRα7作为主要的开关控制烟碱(吸烟) 的不同反应，或者为促炎(如在CD中)或者为抗炎(如在UC中)。激动 剂GTS-21具有类似的预防DSS诱导的CD样结肠炎的发展的效果。

实施例4

nAChRα7激动剂在慢性“UC样”DSS结肠炎的治疗中高度有效

nAChRα7激动剂(PNU和GTS-21)不仅有能力在急性结肠炎模型中 预防DSS诱导的结肠炎(图5)，它们还可以在慢性结肠炎模型中有效逆 转疾病进程(图6)，所述慢性结肠炎模型被认为与人类UC更类似。图6 的图例中描述了慢性UC样结肠炎的诱导。如图6所示，显示了PNU对急 性和慢性结肠炎模型的DAI的影响。PNU处理基本上消除了两种模型中 的炎症。

实施例5

nAChRα7拮抗剂MLA对预防CD样TNBS结肠炎高度有效

基于nAChRα7在UC中下调并在CD中上调的观察结果，不期望受到 任何一种特定的理论束缚，假设nAChRα7特异性拮抗剂会使nAChRα7的 功能失活，并因此对CD有治疗性效果。因此，使用BALB/c小鼠检测了 nAChRα7特异性拮抗剂MLA对CD样TNBS结肠炎的效果。的确，如图 7所示，发现对小鼠使用nAChRα7特异性拮抗剂MLA预处理5天可以有 效预防小鼠发展TNBS诱导的结肠炎(图7)。重要地，nAChRα7激动剂 PNU处理不仅对结肠炎的发展没有效果，而且恶化疾病。对nAChRα7特 异性较弱的激动剂烟碱对预防UC样DSS结肠炎有效，但对疾病发展也没 有效果(图5)。这些结果模拟了吸烟在UC和CD中的效果。合并图5和 图6所示的数据，这些结果显示nAChRα7特异性拮抗剂(MLA)对CD 有有效的治疗性益处，但nAChRα7特异性激动剂(PNU和GTS)对UC 有有效的治疗性效果。还表明了MLA对CD样慢性TNBS结肠炎(使用 BALB/c小鼠)的高度治疗性效果(数据未显示)，其效力与PNU对UC 样DSS结肠炎的效力相类似(图6)。

实施例6

nAChRα7拮抗剂对慢性“CD样”TNBS结肠炎的治疗高度有效

nAChRα7拮抗剂(MLA)不仅有能力预防急性TNBS结肠炎(图7)， 它们还可以有效逆转慢性TNBS结肠炎模型的疾病进程(图8)，其中慢性 TNBS结肠炎模型被认为与人类CD更相似。慢性CD样结肠炎的诱导如 前所述(Alex等人，2009 IBD，15(3)，341-352)。激动剂处理对疾病活动没 有影响，然而拮抗剂处理基本上消除了两种模型中的炎症。小鼠看起来正 常并与乙醇处理的对照小鼠是不可区分的。使用H&E染色进行的组织学 分析(图9)进一步显示了nAChRα7特异性拮抗剂对CD样结肠炎的高度 有效的治疗性效果。还可以通过生物化学方法看出治疗性效果，因为对DSS 结肠炎使用激动剂或对TNBS结肠炎使用拮抗剂处理，剧烈改变细胞因子 图谱从疾病状态至正常健康状态(图13)。

实施例7

激动剂PNU和拮抗剂MLA在被诱导产生结肠炎的nAChRα7敲除小鼠中没有治疗性效果，进一步阐明了所述药物对nAChRα7受体是特异性的。

尽管来自于细胞模型和小鼠结肠炎模型的本公开的数据清楚鉴定了 nAChRα7作为CD响应于烟碱的发病机理的关键点，然而其他nAChR未 被包括的可能性不能被完全排除，因为使用的nAChRα7激动剂/拮抗剂的 特异性可能不限于仅nAChRα7。为了排除这个可能性，在nAChRα7敲除 小鼠(nAChRα7-KO)中测试nAChRα7激动剂和拮抗剂，在所述敲除小鼠 中，如果所述剂是仅对nAChRα7特异性的，则化学诱导结肠炎的发展不 会被这些剂所影响。发现，nAChRα7-KO小鼠对DSS或TNBS诱导的结 肠炎更加敏感(图10)。更重要的是，激动剂(PNU)或拮抗剂(MLA) 都不能在nAChRα7-KO小鼠中作为有效的DSS或TNBS诱导的结肠炎的 治疗剂(图10)。这些数据显示，这些药物的靶是对nAChRα7特异性的。

实施例8

nAChRα7激动剂对DSS结肠炎的抗炎效果被迷走神经切断术完全消除，提供在IBD中迷走神经在nAChRα7介导的抗炎通路中发挥关键作用的第一个确定性的体内证据

迷走神经的传出信号可以被大脑网络所控制，通过胆碱能抗炎通路 抑制细胞因子的产生，其中胆碱能抗炎通路依赖于非神经细胞特别是巨噬 细胞上的nAChRα7。通过这条通路，迷走神经的刺激预防在多种炎性疾病 中细胞因子释放的损害效应，炎性疾病包括败血症、内毒素血症、缺血、 出血性休克、关节炎、和术后肠闭塞。尽管已显示经历了迷走神经切除术 的小鼠对DSS和TNBS诱导的结肠炎更敏感，但是没有直接的实验性证据 将迷走神经和nAChRα7对IBD的调节特定地联系起来。由于之前所展示 的数据清楚显示nAChRα7对UC的抗炎效果和CD的发病机理的特异性参 与，进一步确定这种nAChRα7的特异性效果是否依赖于迷走神经。

对麻醉下的C57B/6小鼠(7周龄)的膈下迷走神经的胃食管连接处的 左迷走神经分支(大约5-10mm)进行迷走神经切断术(图11A)。给予经 历了迷走神经切断术的小鼠7天的时间恢复，然后以IP施用nAChRα7激 动剂，持续5天，之后进行DSS处理(7天)以诱导结肠炎。如图11B所 示，经历了迷走神经切断术的小鼠完全丧失了nAChRα7激动剂对结肠炎 的保护作用。这些数据显示，nAChRα7介导的对IBD的抗炎效果完全依 赖于具有功能的迷走神经。

实施例9

激动剂PNU对治疗GPX 1/2 DKO介导的结肠炎高度有效

由于之前的体内实验的大部分是在实验性结肠炎模型中进行的，检验 了nAChRα7激动剂对治疗由基因缺陷介导的结肠炎有效的假设。两个谷 胱甘肽过氧化物酶(GPX)Gpx1和Gpx2缺陷的小鼠[Gpx1/2-双敲除(DKO) 小鼠]在混合的C57BL/6和129S1/SvJ(B6.129)基因背景下自发发展回结 肠炎。Lee D.H.，Esworthy R.S.，Chu C，Pfeifer G.P.，Chu F.F.，“Mutation  accumulation in the intestine and colon of mice deficient in two intracellular  glutathione peroxidases，”Cancer Res.66(20)：9845-51(2006年10月15日)。 B6.129 Gpx1/2-DKO小鼠的亚组到6-8周发展回结肠炎症，并且到6-9个 月发展回结肠肿瘤。然而对照(来自于混合的C57BL/6和129S1/SvJ (B6.129)基因背景)不发展结肠炎的体征，发现GPX1/2DKO小鼠发展 具有临床活动性评分大约为9的严重的结肠炎(图12)。一旦结肠炎体征 立即明显，施用nAChRα7激动剂和nAChRα7拮抗剂于GPX1/2DKO小鼠。 在使用nAChRα7激动剂处理的GPX1/2DKO小鼠中，疾病(结肠炎)的 发展显著降低，表明nAChRα7激动剂PNU对治疗由GPX1/2DKO介导的 结肠炎高度有效(图12)。然而使用nAChRα7拮抗剂或盐水处理的GPX1/2 DKO小鼠未显示在结肠炎的评分上的显著性变化。这些数据表明 nAChRα7激动剂对结肠炎的化学和基因模型的治疗都高度有效。

实施例10

PNU对小鼠的主要器官和行为没有可观察到的副作用.

在临床前研究使用的剂量下，PNU药物对小鼠展示无副作用。所有主 要器官，包括心脏，肾脏，肝脏，小肠和大肠，脾脏，外观均看起来正常。 强制游泳实验：老鼠被强迫在圆柱形容器内游泳6分钟，如Porsolt R.D.， Bertin A.，Jalfre M.，“Behavioral despair in mice：a primary screening test for  antidepressants，”Arch Int  Pharmacodyn Ther 229：327-336(1977)所描述的，以 评价药物是否改变小鼠的行为(活动作为读数)。ZomkowskiA.D.，Santos A. R.，Rodrigues A.L.，“Evidence for the involvement of the opioid system in the  agmatine antidepressant-like effect in the forced swimming test，”Neurosci Lett  381：279-283(2005)。如图14所示，没有观察到显著性的小鼠行为变化， 无论经过或未经过药物处理。仅DSS诱导结肠炎的小鼠表现显著性的不 动。使用激动剂PNU的处理预防结肠炎，并且因此完全逆转DSS小鼠的 不动。这个结果显示，nAChRα7激动剂对研究的小鼠的行为不具有副作用。 这些nAChRα7特异性药物的其他研究，包括毒性和药物动力学，正在研 究进行中。

综上所述，本公开的化合物对CD和UC提供了单个治疗靶，nAChRα7： nAChRα7激动剂(例如PNU和GTS-21)是对UC高度有效的治疗性药物， 而nAChRα7拮抗剂(例如MLA)对CD具有显著性的治疗潜力。

参考文献

在本说明书中提到的所有出版物、专利申请、专利、和其他参考文献 是对本公开主题所属的领域的技术人员的水平的指示。所有出版物、专利 申请、专利、和其他参考文献均以引用并入本文，与每一个单独的出版物、 专利申请、专利、和其他参考文献被具体地和单独地指出以引用而并入一 样。要理解，尽管本文提到大量专利申请、专利、和其他参考文献，但这 种引用不构成对这些文件中的任何一个形成本领域常见的普通知识的一 部分的承认。

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尽管出于清楚理解的目的通过阐述和实例的方法以一些细节描述了 前述的主题，本领域技术人员要理解某些改变和修改可以在所附的权利要 求的范围内被实践。