β-抑制蛋白-1在制备防治缺血引起的神经损伤疾病药物中的应用

摘要

本发明涉及医药技术领域。β-抑制蛋白-1是细胞内存在的一种蛋白质，是β-抑制蛋白家族中的一员。本发明提供了β-抑制蛋白-1在制备预防或治疗缺血引起的神经损伤疾病药物中的应用。本发明经动物实验证明β-抑制蛋白-1可以有效地防治脑卒中和保护神经元细胞。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及β-抑制蛋白-1在制备预防或治疗缺血引起的神经损伤疾病药物中的应用。 

背景技术

缺血性脑卒中的发病机制复杂，严重危害人类健康，因此，寻求理想的脑卒中治疗药物一直是心脑血管医药领域研究的热点之一。脑卒中治疗药物中以溶栓剂、神经保护剂为主。现有的脑卒中治疗药物如组织型纤溶酶原激活酶(tPA)等的不足之处主要在于治疗时间窗短、安全性不够、效果不够确实。而且，绝大部分药物是从降低脑梗死发生后产生的损害因子方面考虑，从增强机体本身的保护因子方面考虑的药物很少。 

β-抑制蛋白-1（英文名β-arrestin-1）是细胞内存在的一种蛋白质，是β-抑制蛋白家族中的一员。β-抑制蛋白是一类多功能的蛋白，其经典的功能是介导细胞膜表面各种类型受体的脱敏和内吞。除此以外，β-抑制蛋白-1还可以结合其它信号分子，调节后者的磷酸化、泛素化或者细胞内定位等等，从而调控相应的信号通路（参见文献：Scott M.DeWire,Seungkirl Ahn,Robert J.Lefkowitz,and Sudha K.Shenoy.β-Arrestins and Cell Signaling.Annual Review of Physiology.69:483-510）。 

目前，尚无β-抑制蛋白在脑缺血损伤中的任何作用的报道；在缺氧缺糖导致的神经元坏死的领域中，亦没有任何相关文献。 

发明内容

本发明的目的在于提供β-抑制蛋白-1（英文名β-arrestin-1）的新用途。 

本发明提供了β-抑制蛋白-1在制备预防或治疗缺血引起的神经损伤疾病药物或保健品中的应用。 

本发明人经过大量试验研究，惊喜地发现，β-抑制蛋白-1具有抗脑卒中和抗神经元损伤（即保护神经元细胞）的作用。 

本发明的第一方面，是提供了β-抑制蛋白-1在制备预防或治疗脑卒中的药物或保健品中的应用。 

本发明的第二方面，是提供了β-抑制蛋白-1在制备预防或治疗神经元细胞损伤的药物或保健品中的应用。 

根据本发明，术语“脑卒中”是指脑血管疾病，俗称中风，通常分为缺血性或出血性脑卒中，前者又包括脑梗死、脑栓塞以及短暂性脑缺血发作（TIA，俗称小中风），后者则包括脑出血和蛛网膜下腔出血。而脑卒中均可产生缺血缺氧导致的脑细胞特别是神经元细胞的损伤，进而出现相应功能障碍等临床症状。本发明涉及的预防或治疗脑卒中的药物或保健品，较优的是指缺血性脑卒中的药物或保健品。 

本发明涉及的预防或治疗神经元细胞损伤的药物或保健品，较优的是指缺氧缺糖导致的神经元细胞损伤。 

本发明的体外试验显示出用基因敲除手段去除掉小鼠的神经元的β-抑制蛋白-1后，使用缺氧缺糖处理模拟缺血模型，发现神经元细胞损伤加重，说明β-抑制蛋白-1具有抗缺氧缺糖导致的神经元细胞损伤而保护神经元细胞的功效。而以缺血性脑卒中为例，体内动物试验也证实了用基因敲除手段去除掉小鼠全身的β-抑制蛋白-1具有加重脑梗死范围、增加梗死区脑细胞凋亡/死亡数目，从而说明β-抑制蛋白-1有对抗脑卒中的作用。 

本发明中，所述的β-抑制蛋白-1是人体内存在的一种内源性蛋白，β-抑制蛋白-1可以从Novoprotein Scientific公司或Abcam公司购得。 

本发明中，β-抑制蛋白-1的基因敲除手段是指β-抑制蛋白-1基因敲除小鼠，市售可得。比如KOMP公司，货号CSD47583（链接可见https://www.komp.org/geneinfo.php?geneid=23785）。 

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：本发明提供了β-抑制蛋白-1的一种新的应用，其可以有效地防治脑卒中和保护神经元细胞。这对脑卒中的医治具有重大意义。并且β-抑制蛋白-1是机体内源性蛋白质，因此作为药物的安全性很高。 

附图说明

图1是β-抑制蛋白-1基因敲除组和对照组小鼠脑梗死范围检测的照片， 

其中A为脑梗死范围检测的代表性图片，B为两组对比的统计图； 

图2是β-抑制蛋白-1基因敲除组和对照组小鼠脑细胞凋亡/死亡检测的照片， 

其中A为脑细胞凋亡/死亡的代表性图片，B为两组对比的统计图，箭头指向坏死或凋亡的细胞。 

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。 

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

实施例1：基因敲除β-抑制蛋白-1后，缺氧缺糖对神经元细胞导致的损害加重 

制备缺氧缺糖神经元细胞损伤模型，过程如下：将β-抑制蛋白-1基因敲除小鼠（KOMP公司，https://www.komp.org/geneinfo.php?geneid=23785）迅速处死后，分离大脑皮层和海马，消化后悬浮，再铺板，经过抑制神经胶质细胞生长后，基因敲除β-抑制蛋白-1的神经元细胞培养成功；然后改成HBSS无糖培养基，放入缺氧培养箱，使得氧含量低于0.5%（v/v），在体外模拟脑缺血状态。对照组则使用正常的野生型小鼠（C57小鼠，来源中科院斯莱克动物中心），也就是β-抑制蛋白-1基因没有被敲除的小鼠分离出来的神经元。培养24小时后，分别采用三种不同的方法评价烟酰胺单核苷酸对神经元细胞的保护作用，每种方法重复6次。 

结果表明，使用基因敲除手段去除掉细胞内的β-抑制蛋白-1基因后，神经元在缺氧缺糖模拟的缺血模型的刺激下的数目明显减少（表1）；使用基因敲除手段去除掉细胞内的β-抑制蛋白-1基因后，神经元在缺氧缺糖模拟的缺血模型的刺激下的活力明显降低（表2）；这些结果说明，在使用基因敲除手段去除掉细胞内的β-抑制蛋白-1后，神经元细胞更容易被缺血刺激所损伤，这反映了β-抑制蛋白-1具有神经保护作用，可以降低缺氧缺糖对离体培养的神经元细胞损伤。 

表1.基因敲除β-抑制蛋白-1加重缺氧缺糖导致的神经元数目减少 

**表示β-抑制蛋白-1基因敲除组和对照组相比较，有显著的统计学差异（P<0.01）。 

注：神经元数目使用MAP-2免疫荧光法测定。数目越多，表明神经元细胞存活得越多。MAP-2免疫荧光法测定法可参见文献:Shyu WC,et al.Secretoneurin promotes neuroprotection and neuronal plasticity via the Jak2/Stat3pathway in murine models of stroke.J.Clin.Invest.118:133–148(2008) 

表2.基因敲除β-抑制蛋白-1加重缺氧缺糖导致的神经元细胞活力降低 

**表示β-抑制蛋白-1基因敲除组和对照组相比较，有显著的统计学差异（P<0.01）。 

注：神经元细胞活力使用CCK-8法测定。数字越高，表明神经元细胞的活力越高。CCK-8试剂盒购置于日本Dojindo公司，实验步骤均按照其试剂盒说明书实施。 

实施例2：基因敲除β-抑制蛋白-1后，大脑中动脉堵塞导致的脑卒中损伤加重 

用β-抑制蛋白-1基因敲除小鼠（KOMP公司，https://www.komp.org/geneinfo.php?geneid=23785）和对照野生型小鼠（C57小鼠，来源中科院斯莱克动物中心）制备局灶性缺血性脑卒中模型，过程如下：将小鼠麻醉，分离一侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，让尼龙线通过颈内动脉进入大脑中动脉，堵塞2小时后，将线拔出，即成功制备小鼠大脑中动脉堵塞导致的局灶性缺血性脑卒中模型。大脑中动脉堵塞后24小时，检测脑梗死范围和脑细胞凋亡/死亡数目。脑梗死范围检测采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（购自Amersco公司）染色法，即TTC染色法；脑细胞凋亡/死亡数目检测采用荧光末端转移酶标记试剂盒（荧光TUNEL法，试剂盒购自美国Promega公司）检测细胞凋亡。重复8次实验。 

8次重复实验结果显示，β-抑制蛋白-1基因敲除小鼠的脑梗死范围明显大于对照组（表3）。并且，8次重复实验结果也显示β-抑制蛋白-1基因敲除 小鼠的梗死区的脑细胞凋亡/死亡数目明显大于对照组（表4）。脑梗死范围检测的照片见图1，显示β-抑制蛋白-1基因敲除小鼠的脑梗死范围明显大于对照组；脑细胞凋亡/死亡检测的照片见图2，显示β-抑制蛋白-1基因敲除小鼠的梗死区的脑细胞凋亡/死亡数目明显大于对照组。 

表3.β-抑制蛋白-1基因被敲除后明显增加脑梗死范围 

**表示β-抑制蛋白-1基因敲除组和对照组相比较，有显著的统计学差异（P<0.01）。 

表4.β-抑制蛋白-1基因被敲除后明显增加梗死区的脑细胞凋亡/死亡数目 

**表示β-抑制蛋白-1基因敲除组和对照组相比较，有显著的统计学差异（P<0.01）。 

注：梗死区表示梗死的脑组织的中心区域，是脑梗死时的受损区域。 

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。