一种基于金属离子改性的磁性介孔二氧化硅核壳结构亲和微球及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及功能材料技术领域，公开了一种基于金属离子改性的磁性介孔二氧化硅核壳结构亲和微球的制备方法，包括以下步骤：1）用六水合三氯化铁制备磁性粒子；2）利用磁性粒子制备粒子分散液；3）向粒子分散液中加入含有硅酸乙酯和钛酸正丁酯的乙醇溶液，超声，搅拌，磁分离，去除模板分子，得到磁性粒子为核，SiO

说明书

技术领域

本发明涉及功能材料领域，发明了一种基于金属离子改性的磁性介孔二氧化 硅核壳结构亲和微球及其制备方法及其应用。

背景技术

人体液中有许多小分子量的內源肽、蛋白等生物分子，是一些疾病产生的原 因，同时也是结果。检测这些小分子量的生物分子，对疾病诊断有着十分重要的 作用。

质谱是一种能够快速、灵敏的检测生物分子（特别是多肽和蛋白）的有效工 具。由于一些样品中目标肽段浓度特别低，含高浓度盐或其它非目标生物分子， 而导致质谱检测无法进行。因此，在质谱检测前，需对这些低分子量的多肽或蛋 白进行高效的分离、富集、脱盐及除杂处理，以提高被检测物质的相对含量。

采用冻干或蒸发浓缩样品的方法，可以提高样品的相对浓度，但是由于盐分 的浓度也相应增加，而难以避免对质谱检测的干扰；常用的脱盐办法是采用疏水 烷基链修饰的SiO₂填料，吸附多肽和蛋白而达到纯化目的，但是对于一些含大量 高丰度非目标蛋白的复杂样品却脱盐能力有限。近年来，也有文献报道利用介孔 SiO₂的孔道体积排阻效应纯化多肽，但是由于其仅依靠表面亲水基团硅醇羟基和 多肽的作用，因此对多肽的亲和富集能力有限。此外，利用这些材料富集多肽和 蛋白，往往需要反复的离心分离，过程复杂繁琐，损失量大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于金属离子改性的磁性介孔二氧化硅核壳结 构亲和微球。

第二个目的在于提供一种基于金属离子改性的磁性介孔二氧化硅核壳结构 亲和微球的制备方法。

第三个目的在于提供基于金属离子改性的磁性介孔二氧化硅核壳结构亲和 微球的应用，尤其是在从复杂的生物样品中富集和纯化低分子量多肽和蛋白的应 用。

为达到上述目的，具体技术方案为：

一种基于金属离子改性的磁性介孔二氧化硅核壳结构亲和微球的制备方法， 包括以下步骤：

1）用六水合三氯化铁制备磁性粒子；

2）利用磁性粒子制备粒子分散液；

3）向粒子分散液中加入含有硅酸乙酯和钛酸正丁酯的乙醇溶液，超声，搅 拌，磁分离，去除模板分子，得到磁性粒子为核，SiO₂为壳的磁性介孔二氧化硅 核壳结构亲和微球。

所述磁性粒子为Fe₃O₄或Fe₂O₃。

所述步骤2）具体为：取Fe₃O₄粒子分散于乙醇水溶液中，加入氨水，再加 入模板分子，分散均匀，得到Fe₃O₄粒子分散液。

所述模板分子为十六烷基溴化铵或十六烷基氯化铵。

所述步骤2）具体为：取100mg Fe₃O₄粒子，分散于乙醇水溶液水（水:醇 =2:1），加入1‐10mL氨水，加入600mg十六烷基溴化铵，分散均匀，得到Fe₃O₄粒子分散液。

所述步骤3）中采用煅烧法或者有机溶剂萃取法去除模板分子。

所述步骤3）具体为取0.25‐1.25mL硅酸乙酯与10-60μL钛酸正丁酯溶于4mL 乙醇，加入Fe₃O₄粒子分散液中，室温搅拌2h；之后升温至70℃，继续搅拌6h； 磁分离，乙醇洗涤数次至上清清澈；80℃真空干燥过夜；乙醇回流洗涤3次以上 或550℃煅烧，得到基于金属离子改性的磁性介孔SiO₂核壳结构亲和微球。

一种基于金属离子改性的磁性介孔二氧化硅核壳结构亲和微球，由磁性核 和修饰有金属离子介孔二氧化硅外壳组成，所述磁性核为Fe₃O₄磁性粒子。

由上述方法制备得到的基于金属离子改性的磁性介孔二氧化硅核壳结构亲 和微球。

所述基于金属离子改性的磁性介孔二氧化硅核壳结构亲和微球在选择性富 集和纯化低分子量多肽和蛋白方面的应用。

本申请所述方法将金属离子修饰到磁性介孔SiO₂上，利用金属离子和多肽 的相互作用，亲和多肽，同时也能利用介孔的体积排阻效应，去除大量高丰度蛋 白，而达到富集和纯化的目的，所制备的基于金属离子改性的磁性介孔二氧化硅 核壳结构亲和微球可以从复杂的生物样品中富集和纯化多肽和低分子量的蛋白。 此外，利用亲和材料的磁性，大大简化样品纯化和分离过程，缩短操作时间。

说明书附图

图1：磁性介孔SiO₂亲和微球的TEM图片；

图2：磁性介孔SiO₂亲和微球的能量色散谱仪（EDS）图谱；

图3A：低浓度标准多肽直接质谱检测，MALDI‐TOF MS图；

图3B：低浓度标准多肽在磁性介孔SiO₂亲和微球富集后质谱检测， MALDI‐TOF MS图；

图4A：复杂多肽样品直接质谱检测，MALDI‐TOF MS图；

图4B：复杂多肽样品在磁性介孔SiO₂亲和微球富集纯化后质谱检测， MALDI‐TOF MS图。

具体实施方式

实施例1基于金属离子改性的磁性介孔二氧化硅核壳结构亲和微球的制 备

1．Fe₃O₄磁性粒子制备

采用溶剂热法制备，具体步骤如下：称取5.13g的六水合三氯化铁（FeC1₃· 6H₂O）均匀地分散到80mL乙二醇中制成溶液，并在磁力搅拌下依次加入表面活 性剂PEG1.25g和无水乙酸钠5.00g，搅拌成均匀体系。将此混合物转移至带有聚 四氟乙烯衬的120mL高压釜中密封，最后将高压反应釜置于恒温箱中加热到200℃ 并恒温反应6h。待反应体系自然冷却后，将所得悬浊液磁分离得到黑色的粉末 状物质。再用去离子水和乙醇交替洗涤几次后，于60℃干燥8h，最终得到Fe₃O₄粒子产品。

2.基于金属离子改性的磁性介孔SiO₂核壳结构亲和微球制备

具体步骤如下：100mg Fe₃O₄粒子，分散于乙醇水溶液（水:醇=2:1），加入 2.4mL氨水，加入600mg CTAB十六烷基溴化铵（模板分子），分散均匀，得到Fe₃O₄粒子分散液；

取500μL硅酸乙酯（TEOS）与50μL钛酸正丁酯溶于4mL乙醇（Si：Ti=10:1）， 振荡均匀后，缓慢加入Fe₃O₄粒子分散液中，室温搅拌2h；之后升温至70℃， 继续搅拌6h；磁分离，乙醇洗涤数次至上清清澈；80℃真空干燥过夜；乙醇回 流洗涤3次以上或550℃煅烧，得到基于金属离子改性的磁性介孔SiO₂核壳结构 亲和微球，其透射电镜照片如图1所示。从图1可以观察到，所制备的亲和微球 具有明显的核壳结构，外层壳上可以观察到明显的短道介孔。其能量色散谱仪 （EDS）图谱如图2所示。所制备的亲和微球由Fe、O、Si和Ti四种元素组成。 以上结果证明，实施例1成功的制备了金属离子改性的磁性介孔SiO₂核壳结构 亲和微球。

实施例2利用基于金属离子改性的磁性介孔SiO2核壳结构亲和微球富集低 丰度标准肽

1．样品溶液的制备：配制50mL5nM的合成多肽MW=1533.6溶液。

2.合成多肽的富集及质谱分析：取500μL上述多肽溶液，加入100ug磁性 介孔SiO₂亲和微球，分散均匀，振荡10min。磁分离后移去上清液，5μL80% 丙烯腈（CAN）、0.5%三氟乙酸（TFA）(v/v)，振荡5分钟后，磁分离。收集上 清液，取0.7uL样品，与0.7基质混合，点到MALDI-TOF靶板上，形成共结晶， 进行质谱分析。

3．分析结果：图3A为5nM标准多肽富集前，直接进行质谱检测的结果。 因为多肽浓度十分低，所以很难检测到有效的质谱信号。图3B是5nM标准多肽 经金属离子改性磁性介孔SiO₂亲和微球富集后再进行检测的质谱图。可以观察 到，在富集后，标准多肽的信号强度和信噪比都有很大的提高。由图3A和图3B 可见，金属离子改性磁性介孔SiO₂亲和微球对低浓度的标准多肽有很好的的富 集效果。

实施例3利用基于金属离子改性的磁性介孔SiO₂核壳结构亲和微球富集复 杂样品中的低丰度肽

1．样品溶液的制备：称取l mg的牛血清白蛋白BSA溶解于在lmL50mM 的碳酸氢胺溶液中（pH8.0)，按照与胰蛋白酶的质量比50:1的比例加入胰蛋白 酶酶解16小时，酶解温度控制在37℃，最后加入1％甲酸终止反应。取50uL 多肽溶液，用含4M尿素的水溶液稀释至5nM，备用。

2．多肽的富集及质谱分析：取500uL上述多肽溶液，加入100ug磁性介孔 SiO₂亲和微球，分散均匀，振荡10min。磁分离后移去上清液，用500uL去离子 水，洗涤亲和微球，磁分离，去除上清，重复两次；加入5μL80%ACN、 0.5%TFA(v/v)洗涤，振荡5分钟后，磁分离。收集上清液，取0.7uL样品，与0.7 基质混合，点到MALDI-TOF靶板上，形成共结晶，进行质谱分析。

3．分析结果：图4A为5nM BSA蛋白酶切液富集前，直接进行质谱检测的 结果。因为多肽浓度十分低，而且有大量盐等污染物的干扰，所以质谱信号的强 度和信噪比都很低，仅能检测到4条归属于BSA蛋白的多肽峰。图4B是5nM BSA 蛋白酶切液经金属离子改性磁性介孔SiO₂亲和微球富集后再进行检测的质谱图。 可以观察到，在富集后，标准多肽的信号强度和信噪比都有很大的提高，可以检 测到44条归属于BSA蛋白的多肽峰。由图4A和图4B可见，磁性介孔SiO₂亲 和微球对含高浓度盐的低浓度的混合多肽有很好的的富集效果。表1为在混合多 肽溶液中检测和鉴定到的多肽。

表1在混合多肽溶液中检测和鉴定到的多肽

BSA蛋白中的位置 理论分子量 多肽序列 29–34 711.3664 K.SEIAHR.F 35–44 1248.614 R.FKDLGEEHFK.G 37–44 973.4505 K.DLGEEHFK.G 66–75 1162.623 K.LVNELTEFAK.T 89–100 1361.665 K.SLHTLFGDELCK.V 123–130 976.4436 R.NECFLSHK.D 131–138 885.408 K.DDSPDLPK.L 139–151 1518.739 K.LKPDPNTLCDEFK.A 139–155 1961.94 K.LKPDPNTLCDEFKADEK.K 161–167 926.4861 K.YLYEIAR.R 168–183 2044.021 R.RHPYFYAPELLYYANK.Y 169–183 1887.92 R.HPYFYAPELLYYANK.Y 198–204 700.3942 K.GACLLPK.I

212–218 702.4024 K.VLASSAR.Q 229–235 819.4603 K.FGERALK.A 229–235 819.4603 K.FGERALK.A 233–241 1000.582 R.ALKAWSVAR.L 242–248 846.4963 R.LSQKFPK.A 246–256 1293.697 K.FPKAEFVEVTK.L 286–297 1385.613 K.YICDNQDTISSK.L 298–309 1417.731 K.LKECCDKPLLEK.S 310–318 1014.48 K.SHCIAEVEK.D 341–346 751.35 K.NYQEAK.D 347–359 1566.735 K.DAFLGSFLYEYSR.R 360–371 1438.805 R.RHPEYAVSVLLR.L 361–371 1282.703 R.HPEYAVSVLLR.L 402–412 1304.709 K.HLVDEPQNLIK.Q 413–420 1010.413 K.QNCDQFEK.L 421–433 1478.788 K.LGEYGFQNALIVR.Y 437–451 1638.931 R.KVPQVSTPTLVEVSR.S 438–451 1510.836 K.VPQVSTPTLVEVSR.S 452–459 816.4818 R.SLGKVGTR.C 456–468 1464.681 K.VGTRCCTKPESER.M 460–468 1051.443 R.CCTKPESER.M 469–482 1666.806 R.MPCTEDYLSLILNR.L 483–489 840.4527 R.LCVLHEK.T 499–507 1023.448 K.CCTESLVNR.R 508–523 1822.892 R.RPCFSALTPDETYVPK.A 548–557 1141.707 K.KQTALVELLK.H 549–557 1013.612 K.QTALVELLK.H 562–568 817.4181 K.ATEEQLK.T 569–580 1398.685 K.TVMENFVAFVDK.C 588–597 1049.485 K.EACFAVEGPK.L 598–607 1001.576 K.LVVSTQTALA.-