基于荧光共振能量转移的原理的单分子型FRET生物传感器接头

摘要

本发明提供一种基于荧光共振能量转移原理的单分子型FRET生物传感器的接头以及包含该接头的单分子型FRET生物传感器等，其能够非侵袭性地测定丝氨酸－苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性和低分子量GTP结合蛋白活性等。一种接头，其为包括52个氨基酸残基以上、400个氨基酸残基以下的多肽，总氨基酸残基数的至少95%由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸构成，甘氨酸为35～65%，丝氨酸和苏氨酸的至少任一个为10～40%，丙氨酸为10～40%；包含该接头的单分子型FRET生物传感器；保持包含编码该生物传感器的基因的表达载体的转化细胞和转基因非人动物。

说明书

技术领域

本发明涉及用于将基于荧光共振能量转移原理的单分子型FRET 生物传感器最适化的接头（linker）、包括该接头的生物传感器、编码该 接头或单分子型FRET生物传感器的基因、包含该接头或单分子型 FRET生物传感器的表达载体、具有该表达载体的转化细胞和转基因非 人动物、使用上述生物传感器的测定方法。

背景技术

在生命科学领域中，利用荧光共振能量转移（Fluorescene resonance  energy transfer，以下称为FRET）的原理和荧光蛋白的生物传感器正在 快速地扩展（例如参照非专利文献1～4）。

FRET是指从处于激发状态的荧光分子（供体：能量供给体）向非 常近的荧光分子（受体：能量接受体）转移激发能量的现象。利用FRET 的生物传感器的普及大大促进绿色荧光蛋白（GFP）的颜色突变体的出 现及其改良。现在，很多情况下，作为GFP突变体的CFP（青色荧光 蛋白）和YFP（黄色荧光蛋白）作为供体和受体荧光蛋白而被利用。

使用荧光蛋白的FRET生物传感器系统分为双分子型FRET生物 传感器（图1）和单分子型FRET生物传感器（图2）。双分子型FRET 生物传感器检测分子间相互作用，单分子型FRET生物传感器检测分 子的结构变化（例如，参照非专利文献1～4）。

其中，单分子型生物传感器（单分子型FRET生物传感器）开发 了离子、糖、脂质等低分子的定量、低分子量GTP结合蛋白、激酶等 的活性测定中使用的传感器（例如，参照非专利文献4）。

但是，为了制作该生物传感器，需要结合至少3个，很多情况下4 个以上的蛋白质结构域，仅仅将它们简单接合，通常无法制作具有充 分的灵敏度的单分子型FRET生物传感器。即，为了制作这样的单分 子型FRET生物传感器，必须考虑以下3个因子：i）受体荧光蛋白的 发光光谱与受体荧光蛋白的吸光光谱的重叠；ii）受体荧光蛋白与受体 荧光蛋白之间的距离；iii）受体荧光蛋白的发光瞬间和受体荧光蛋白的 吸光瞬间的取向。此外，在荧光蛋白与其他蛋白质融合的情况下，与 其他蛋白质融合成为负荷，从而产生荧光蛋白的错误折叠，其结果， 发色团形成的效率降低，还必须考虑到有可能成为无荧光。这样，利 用受体荧光蛋白和受体荧光蛋白在两者之间产生FRET的良好的表达 存在严格的条件，两者间的配置等也没有发现一定的规则，因此，每 个制作的单分子型FRET生物传感器都需要将各种蛋白质结构域的长 度、结构域之间的接头序列等进行各种各样的变更，制作最适宜的传 感器，但是这需要多次试行错误或复杂高度的试验等，具有充分灵敏 度的单分子型FRET生物传感器的开发非常的困难。

作为连接各结构域的接头，报告有9个氨基酸的甘氨酸、丝氨酸、 苏氨酸构成的接头（例如参照非专利文献5）、72个氨基酸的甘氨酸接 头（例如参照非专利文献6），但是不能够说充分最适化。此外，这些 接头中，没有在多种单分子型FRET生物传感器中共通的最适化的接 头。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Aoki,K.and M.Matsuda.2009.Visualization of small  GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based  biosensors.Nature Protocol4:1623-1631

非专利文献2：Giepmans,B.N.,S.R.Adams,M.H.Ellisman,and  R.Y.Tsien.2006.The fluorescent toolbox for assessing protein location and  function.Science312:217-224

非专利文献3：Jares-Erijman,E.A.and T.M.Jovin.Imaging  molecular interactions in living cells by FRET microscopy.2006.Curr. Opin.Chem.Biol.10:409-416.

非专利文献4：Kiyokawa,E.,S.Hara,T.Nakamura,and M. Matsuda.2006.Fluorescence(Forster)resonance energy transfer imaging of  oncogene activity in living cells.Cancer Sci.97:8-15.

非专利文献5：Itoh,R.E.，K.Kurokawa,Y.Ohba,H.Yoshizaki,N. Mochizuki,and M.Matsuda.2002.Activation of Rac and Cdc42 video-imaged by FRET-based single-molecule probes in the membrane of  living cells.Mol.Cell.Biol.22:6582-6591.

非专利文献6：Harvey,C.D.,A.G.Ehrhardt,C.Cellurale.H.Zhong,R. Yasuda,R.J.Davis,and K.Svoboda.2008.A genetically encoded  fluorescent sensor of ERK activity.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A

发明内容

发明要解决的课题

本发明就是为了解决上述现有的问题，以达成以下的目的为课题 的。即，本发明的目的在于提供一种用于将基于荧光共振能量转移原 理的单分子型FRET生物传感器最适化，得到高灵敏度的单分子型 FRET生物传感器而能够广泛使用的接头（以下，本说明书中，本发明 的接头称为EV（Enhanced visualization）接头）、包含该接头的生物传 感器、编码该接头或生物传感器的基因、包含该接头或生物传感器的 表达载体、具有该表达载体的转化细胞和转基因非人动物、和使用包 含上述接头的生物传感器的测定丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶 活性、低分子量GTP结合蛋白的活性而使用适宜的上述单分子型FRET 生物传感器的测定方法。

用于解决课题的方法

为了解决上述课题进行了潜心研究，发现具有一定以上长度的接 头可以解决上述问题，该接头将基于荧光共振能量转移原理的单分子 型FRET生物传感器最适化，为了获得高灵敏度的单分子型FRET生 物传感器而能够广泛应用。并且发现，通过包含一定比例或一定序列 的特定氨基酸的重复，能够提高最适化的效果。

即，本发明基于下述见解：使用具有一定以上长度的接头，能够 显著降低作为降低单分子型FRET生物传感器的增益的主要原因的基 础状态的FRET，本发明能够广泛应用在单分子型FRET生物传感器制 作中。本发明的接头是为了增大上述单分子型FRET生物传感器的增 益而开发得到的接头，其技术价值非常大。

即，用于解决上述课题的方法如下。

（1）一种接头，其为基于荧光共振能量转移原理的单分子型FRET 生物传感器的接头，所述接头的特征在于，其为包括52个氨基酸残基 以上、400个氨基酸残基以下的多肽，总氨基酸残基数的至少45%为甘 氨酸和丙氨酸的至少任一个，丙氨酸在总氨基酸残基数中含有至少 10%。

（2）如上述（1）所述的接头，其为包括84个氨基酸残基以上的 多肽。

（3）如上述（1）或（2）所述的接头，丝氨酸和苏氨酸的至少任 一个在总氨基酸残基数中含有至少10%。

（4）如上述（3）所述的接头，总氨基酸残基数的至少95%由甘 氨酸、丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸构成，甘氨酸含有35～65%，丝氨酸 和苏氨酸的至少任一个含有10～40%，丙氨酸含有10～40%。

（5）上述（4）所述的接头，总氨基酸序列的至少95%为由SAGG 和GGAS的任一个的氨基酸序列的重复构成，SAGG和GGAS的任一 个的氨基酸序列的重复单元含有13个以上、100个以下。

（6）如上述（1）或（2）所述的接头，精氨酸和谷氨酸的至少任 一个在总氨基酸残基数中含有至少10%。

（7）如上述（6）所述的接头，总氨基酸残基数的至少95%由甘 氨酸、精氨酸、谷氨酸和丙氨酸构成，甘氨酸含有4～30%，精氨酸含 有5～30%，谷氨酸含有5～30%，丙氨酸含有30～60%。

（8）一种基因，其特征在于，编码上述（1）～（7）中任一项所 述的接头。

（9）一种表达载体，其特征在于，包含编码上述（1）～（7）中 任一项所述的接头的基因。

（10）一种转化细胞，其特征在于，保持上述（9）所述的表达载 体。

（11）一种转基因非人动物，其特征在于，保持上述（9）所述的 表达载体。

（12）一种单分子型FRET生物传感器，其为基于荧光共振能量 转移原理的单分子型FRET生物传感器，其特征在于，其为具有传感 器区域、配体区域、受体荧光蛋白区域、供体荧光蛋白区域和连接该 传感器区域与该配体区域的接头区域的融合蛋白，该接头区域上述 （1）～（7）中任一项所述的接头构成。

（13）如上述（12）所述的单分子型FRET生物传感器，该供体 荧光蛋白为YPet。

（14）一种基因，其特征在于，编码上述（12）或（13）中任一 个所述的单分子型FRET生物传感器。

（15）一种表达载体，其特征在于，包含编码上述（14）所述的 单分子型FRET生物传感器的基因。

（16）一种转化细胞，其特征在于，保持上述（15）所述的表达 载体。

（17）一种转基因非人动物，其特征在于，保持上述（15）所述 的表达载体。

（18）一种测定方法，其特征在于，包括使用上述（12）所述的 单分子型FRET生物传感器检测FRET的工序，测定丝氨酸－苏氨酸 激酶活性、酪氨酸激酶活性和低分子量GTP结合蛋白活性的任一个。

（19）一种测定方法，其特征在于，包括使用上述（16）所述的 转化细胞或上述（13）所述的转基因非人动物检测FRET的工序，测 定丝氨酸－苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性和低分子量GTP结合蛋 白活性的任一个。

（20）一种丝氨酸－苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性和低分子 量GTP结合蛋白活性的任一个的调节物质的筛选方法，包括：

（a）使上述（16）所述的转化细胞与被检物质接触的工序；和

（b）通过检测FRET，检测丝氨酸－苏氨酸激酶活性、酪氨酸激 酶活性和低分子量GTP结合蛋白活性的任一个的变化的工序。

发明的效果

根据本发明的接头，能够将基于荧光共振能量转移原理的单分子 型FRET生物传感器最适化，得到高灵敏度单分子型FRET生物传感 器。根据本发明的单分子型FRET生物传感器，能够测定丝氨酸－苏 氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性和低分子量GTP结合蛋白活性。

附图说明

图1表示双分子型FRET生物传感器的基本结构和工作原理。为 了检测A和B的分子间相互作用，A融合FRET受体荧光蛋白（示例 CFP），B融合FRET受体荧光蛋白（示例YFP）。若A和B结合，则 FRET供体荧光蛋白接近FRET受体荧光蛋白，利用FRET检测来自 FRET受体荧光蛋白的荧光。带有箭头的波浪线是表示激发光和荧光。

图2表示单分子FRET生物传感器的基本结构和工作原理。已知A 分子发生结构变化的情况下，在两个位置融合FRET供体荧光蛋白（示 例CFP）和FRET受体荧光蛋白（示例YFP）。A分子的结构变化带来 FRET的效率变化。附有箭头的波浪线表示激发光和荧光。

图3表示利用包括传感器区域和配体区域的FRET的单分子型 FRET生物传感器的原理。在FRET供体荧光蛋白（示例CFP）和FRET 受体荧光蛋白（示例YFP）之间，通过接头序列结合传感器区域与配 体区域。传感器区域包括与激酶的活化、GTP交换因子的活化等各种 细胞内环境的变化相对应而发生结构变化的部分。配体区域为与该传 感器区域的结构变化相对应而结合的结构域。若传感器区域的结构变 化，则配体区域结合。与之相伴，FRET供体荧光蛋白接近FRET受体 荧光蛋白，利用FRET检测来自FRET受体荧光蛋白的荧光。

图4为以针对PKA的生物传感器Eevee-PKA为例，例示利用包括 传感器区域和配体区域的FRET的单分子型FRET生物传感器中的接 头区域的作用。传感器区域包括由PKA特异性磷酸化的底物序列。配 体区域为已知抑制与该磷酸化肽接合的Rad1蛋白的FHA1结构域。若 传感器区域的底物序列被PKA磷酸化，则与配体区域接合。与之相伴， FRET供体荧光蛋白（CFP）接近FRET受体荧光蛋白（YFP），利用 FRET检测来自FRET受体荧光蛋白的荧光。

图5表示EV接头的长度与增益的关系，在HeLa细胞中表达具有 各种长度的EV接头的Eevee-PKA，在24小时后，通过1mM的联丁 酰基cAMP将PKA活化。测定刺激前和刺激后30分钟的FRET/CFP 荧光比，将相对于刺激前的增加的比例作为增益。

图6表示YFP受体蛋白为YPet突变株时，EV接头的效果更显著。 制作具有YPet和各种长度的EV接头的Eevee-PKA。接着，在HeLa 细胞中表达这些Eevee-PKA，24小时后，通过1mM的联丁酰基cAMP 将PKA活化。测定刺激前和刺激后30分钟的FRET/CFP荧光比，将 相对于刺激前的增加的比例作为增益。

图7表示EV接头的效果是通过降低基础状态的FRET来获得的。 图7A为在HeLa细胞中表达Eevee-PKA-52，通过激光共聚焦显微镜 FV1000以438nm的激光激发，测定各波长的荧光强度的结果。

图7B为采用Eevee-PKA-84，与图7A同样测定的结果。

图7C为采用Eevee-PKA-116，与图7A同样测定的结果。表示基 础状态下的FRET的530nm荧光通过增长EV接头而显著降低。

图8A表示由EV接头导致的基础状态的FRET效率降低来自磷酸 化的降低。与图7同样，在HeLa细胞中表达Eevee-PKA。刺激前样品 分为1mM联丁酰基cAMP进行15分钟处理的物质和1mM联丁酰基 cAPM和50nM花萼海绵诱癌素进行15分钟处理的物质，通过含有 50μM PhosTag的6%SDS聚丙烯酸酰胺凝胶进行分离。之后，以抗GFP 抗体小鼠单克隆抗体进行免疫印迹。得知随着EV接头缩短，基础状态 的磷酸化降低。

图8B为用图表表示图8A的磷酸化比例的图。

图9A表示具有PIP3结合结构域的Akt生物传感器（Eevee-Akt-84） 的结构。记载为84a.a.的为EV84接头。AktPH表示Akt蛋白的PH结 构域，NES为核输出信号。

图9B是与图9A同样表示具有PIP3结合结构域的Akt生物传感器 （Eevee-Akt-116）的结构。记载为116a.a.的为EV116接头。

图10表示在Akt的生物传感器中也观察到由EV接头导致的基础 状态的FRET降低。在COS7细胞中表达Eevee-Akt，测定FRET/CFP 荧光比。对5个以上的细胞进行测定，显示平均值。EV接头为116的 比72Gly接头具有更低的基础状态的FRET。

图11A为由Eevee-ERK进行的ERK活性测定与具有甘氨酸接头 的情况下进行比较的图。图11A为在HeLa细胞中表达包含EV116接 头的Eevee-ERK（3560NES），以10ng/ml的EGF刺激，将实测值的 FRET/CFP荧光比记录于Y轴的图。

图11B表示将上述FRET/CFP荧光比以刺激前状态标准化后的图。

图11C为与图11A同样表示具有甘氨酸接头的EKAR-1667nes （72Gly接头）（1667NES）的结果的图。

图11D为表示将上述FRET/CFP荧光比以刺激前状态标准化后的 图。实测值的FRET/CFP的上限为2.2左右，因此显示，相比于具有甘 氨酸接头的EKAR-1667nes，包括EV116接头的Eevee-ERK（参照图 11A和B）具有很广的增益，这是由于低的基础状态的FRET效率所导 致的。

图12表示具有EV接头的EGFR/Ab1的生物传感器Picchu-734的 反应性。在HeLa细胞中表达Picchu-734，用10ng/ml的EGF刺激。可 知与没有EV接头的Picchu-730相比，具有更广的增益。

图13A表示由具有EV接头的Raichu-Rac1（2246X）进行的Rac1 活性测定。为在HeLa细胞中转染没有EV接头的pRaichu-Rac1（2241X） 和具有EV接头的pRaichu-Rac1（2246X），在48小时后，用实施例2 记载的方法进行显像。在激光共聚焦显微镜FV1000下，用438nm的 激光激发，测定各波长的荧光强度的图。可知表示基础状态的FRET 的530nm的荧光由于增长EV接头而显著降低。

图13B为在图13A的显像中，在显像开始10分钟后投与表皮生 长因子（EGF），使其达到25ng/ml，继续显像。将标准化后的FRET/CFP 作为图表显示。具有EV接头的Raichu-Rac1（2246X）具有更高的反 应性。

图14A表示稳定表达Raichu-2246X的大鼠C6细胞经过24小时定 时成像，测定FRET/CFP效率（记载为Rac1活性）的数据。箭头表示 细胞分裂。显示在表达EV接头的细胞中，FRET长时间能够稳定测定。

图14B为在与上述相同的条件下摄影的其他细胞的结果。

图14C为在与上述相同的条件下摄影的其他细胞的结果。

图14D为在与上述相同的条件下摄影的其他细胞的结果。

图15A为在COS7细胞中表达具有EV接头的Raichu-Cdc42。比 较基础状态的FRET效率，显示EV接头显著降低基础状态的FRET。

图15B为对具有EV接头的Raichu-Cdc42在显像开始10分钟后投 与表皮生长因子（EGF），使其达到25ng/ml，将继续显像时的标准化 后的FRET/CFP作为图表表示的图。

图15C为没有EV接头的Raichu-Cdu42，与图15B同样，将标准 化后的FRET/CFP作为图表表示。可知与没有EV接头的Raichu-Cdc42 相比，具有EV接头的Raichu-Cdu42具有更高的反应性。

图16A为在HeLa细胞中表达具有EV接头的Raichu-Ras（3705X）， 用10ng/ml的EGF刺激，每隔1分钟获取的定时摄影的图。可知与没 有EV接头的Raichu-HRas（图16B）相比较，具有EV接头的 Raichu-HRas能够早期检测出很强的活化。

图16B为没有EV接头的Raichu-HRas与图16A同样获取图像的 图。

图17为用荧光显微镜拍摄表达Eevee-ERK的转基因小鼠的胎儿的 矢状切面，获取FRET图像的图。基础状态前后40%用伪彩色表示（暖 色表示高的FRET）。能够观察到个体内的ERK活性分布。

图18为在HeLa细胞中稳定表达Eevee-ERK的细胞在96孔培养 皿中培养，加入梯度稀释的抑制剂之后，用25ng/ml的EGF刺激得到 的结果。对30个以上的细胞自动测定ERK活性，将平均值图表化。 图18A表示DMSO的对照。

图18B表示使用EGF受体抑制剂（AG1478）作为抑制剂的情况。

图18C表示使用MEK抑制剂（PD15035）作为抑制剂的情况。

图18D表示使用BRAF的抑制剂（PLX4720）作为抑制剂的情况。

图18E表示使用MEK抑制剂（PD184351）作为抑制剂的情况。

图18F表示使用磷脂酰肌醇3-磷酸激酶的抑制剂（LY294002）作 为抑制剂的情况。

图18G表示使用RSK的抑制剂（BI-D1870）作为抑制剂的情况。

图18H表示使用JNK抑制剂（JNK inhibitor VIII）作为抑制剂的 情况。显示EGK依赖性ERK活化在HeLa细胞中通过EGF受体和MEK 的抑制剂而被有效抑制。

图19表示在表达Eevee-PKA（3536NES）的转基因小鼠中，分别 静脉注射磷酸二酯酶的抑制剂茶碱和环腺苷三磷酸的类似物布拉地 新，测定PKA活性得到的结果。分别在肌间神经细胞、肠道平滑肌、 血管平滑肌中能够实时可视化PKA的活性变化。

图20为将图19的图像图表化的图。

图21为显示使用减少甘氨酸含量的EV3×8和EV6×4接头的生 物传感器也具有与使用EV116接头的生物传感器几乎相同的效果的 图。与图7同样，在HeLa细胞中表达Eevee-PKA-3×8、Eevee-PKA-4 ×6、Eevee-PKA-116，在激光共聚焦显微镜FV1000下，用438nm的 激光激发，测定各波长的荧光强度的图。可知EV3×8和EV4×6接头 具有与EV116接头相匹敌的效能。

具体实施方式

以下，说明本发明的实施方式。

本发明的接头（EV接头）为基于荧光共振能量转移（FRET）原 理的单分子型FRET生物传感器的接头，为包括52个氨基酸残基以上、 400个氨基酸残基以下的多肽，总氨基酸残基数的至少45%为甘氨酸和 丙氨酸的任一个，丙氨酸在总氨基酸残基数中至少包含10%。

本发明的接头，作为基于荧光共振能量转移（FRET）原理的单分 子型FRET生物传感器，即单分子型FRET生物传感器中的构成要素 之一而连结使用。本发明中，所谓FRET，是指从处于激发状态的荧光 分子（供体：能量供给体）向非常近的荧光分子（受体：能量接受体） 转移激发能量的现象。单分子型FRET生物传感器通常具有供体荧光 蛋白、受体荧光蛋白、传感器结构域、配体结构域这四个区域，接头 连接这些的2个区域之间。

图3为单分子型FRET生物传感器中使用的本发明的接头的示例。 将CFP作为供体荧光蛋白的一例，YFP作为受体荧光蛋白的一例，对 本发明进行具体说明，但是如后所述，供体荧光蛋白和受体荧光蛋白 不限于此。传感器结构域和配体结构域在基础状态下处于空间上离开 的位置，在该状态下，供体荧光蛋白和受体荧光蛋白也处于空间上离 开的位置，基础状态的FRET效率低。在活化状态中，由结构识别结 构域构成的配体区域（B）识别因磷酸化、GTP结合等各种信号诱导的 传感器区域（A）的结构变化并与之结合，由此使供体接近受体，从而 使FRET效率提高。

在此，FRET效率是指激发供体荧光蛋白所得到的荧光强度的在受 体荧光蛋白存在下的减少比例，但是在本说明书中，为了方便起见， 使用在供体荧光蛋白的激发波长照射单分子型FRET生物传感器的情 况下的供体荧光蛋白的荧光强度与受体荧光蛋白的荧光强度的比（荧 光强度比）（参照非专利文献1和3）。以下，本说明书中记载的参考文 献通过参照而将其全部教导引入本说明书中。

本说明书中的EV接头是至少具有52个氨基酸以上、400个氨基 酸以下的长度，没有获得稳定的三级结构的多肽。如果不足52个氨基 酸，则基础状态下的FRET效率增高，不会获得很大的增益；如果超 过400个氨基酸，则FRET生物传感器的分子量增大，表达量降低。 从增大上述增益的观点出发，更优选84个氨基酸以上，特别优选116 个氨基酸以上。从抑制上述分子量的观点出发，更优选244个氨基酸 以下。从上述观点出发，接头的长度特别优选84氨基酸以上、244氨 基酸以下。

本发明的EV接头是没有取得稳定的三级结构的多肽，总氨基酸残 基数的至少45%为甘氨酸和丙氨酸的至少任一个（即，意为甘氨酸残 基和丙氨酸残基的合计占总氨基酸残基数的至少45%），丙氨酸在总氨 基酸残基数中至少包含10%。总氨基酸残基数的至少45%为甘氨酸和 丙氨酸的至少任一个构成，从制作可动性大的多肽的观点出发是非常 重要的，通过使丙氨酸在总氨基酸残基数中至少包含10%，能够比仅 由甘氨酸构成的接头增大增益。作为甘氨酸和丙氨酸以外的氨基残基， 只要注意不能取得稳定的三级结构，则也可以包含其他氨基酸。从制 作不能取得稳定的三级结构的多肽的观点出发，特别适宜包含丝氨酸、 苏氨酸、精氨酸、谷氨酸等。

例如，优选除了甘氨酸和丙氨酸，丝氨酸和苏氨酸的至少任一个 在总氨基酸残基数中含有至少10%的多肽。作为这样的多肽，可以举 出总氨基酸残基数的至少95%由Gly、Ser、Thr和Ala构成，Gly含有 35～65%、Ser和Thr的至少任一个含有10～40%、Ala含有10～40% 的多肽。这些氨基酸残基优选均匀分布于全长中，其中，优选重复包 含Ser-Ala-Gly-Gly、其反向序列Gly-Gly-Ala-Ser或Gly-Ala-Gly-Ser的 序列。作为这样的序列，例如，优选Ser-Ala-Gly-Gly、Gly-Gly-Ala-Ser 或Gly-Ala-Gly-Ser的重复单元在总氨基酸残基数中包含95%以上，在 上述基本序列之外，也优选以总体不足5%的范围在序列中插入Gly、 Ser、Ala、Thr等的序列。上述序列中，优选以与Ser性质非常接近的 氨基酸Thr取代Ser的序列。上述氨基酸序列的重复单元优选包含13 个以上、100个以下。这样的接头的具体例子可以例举如下。

EV52接头（序列号：12）

SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGS AGGSAGG

EV84接头（序列号：15）

SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGS AGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGG

EV116接头（序列号：18）

SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGS AGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAG GSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGG EV180接头（序列号：23） SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGS AGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAG GSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSA GGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSA GG

EV244接头（序列号：26）

SAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGS AGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAG GSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSA GGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSA GGSGSAGGSAGGSTSAGGSAGGSAGGSAGGSAGGSGSAGGSAGGS TSAGGSAGGSAGGSAGGSAGG

此外，优选除了丙氨酸和甘氨酸，精氨酸和谷氨酸的至少任一个 在总氨基酸残基数中含有至少10%的多肽。作为这样的多肽，可以举 出总氨基酸残基数的至少95%由甘氨酸、精氨酸、谷氨酸和丙氨酸构 成，甘氨酸含有4～30%，精氨酸含有5～30%，谷氨酸含有5～30%、 丙氨酸含有30～60%的多肽。这样的氨基酸残基优选均匀分布于全长 中，例如，可以例举下述序列。

EV3×8接头（序列号：45）

EAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAA REAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGE AAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAR EAAAR

EV6×4接头（序列号：46）

EAAAREAAAREAAAREAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREA AAREAAAREAAAREAAARGGEAAAREAAAREAAAREAAAREAA AREAAARGGEAAAREAAAREAAARAAREAAAREAAAR

EV3×8接头为3次重复EAAAR序列得到的15个氨基酸残基的 序列单元以GG序列连接8个而得到的134个氨基酸残基的多肽。总 氨基酸残基数134个中，丙氨酸为72个（53.7%），甘氨酸为14个 （10.4%），谷氨酸为24个（17.9%），精氨酸为24个（17.9%）。丙氨 酸和甘氨酸合计为64.1%。此外，EV6×4接头为124个氨基酸残基的 多肽，总氨基酸残基数124个中，丙氨酸为71个（57.3%），甘氨酸6 个（4.8%），谷氨酸23个（18.5%），精氨酸24个（19.4%），丙氨酸和 甘氨酸合计为62.1%。

本发明的EV接头增大了单分子型FRET生物传感器的增益，该单 分子型FRET生物传感器中的插入部位考虑到基础状态和活化状态的 FRET效率之差，即，增益的增大而适宜选择。即，能够连接选自单分 子型FRET生物传感器的供体荧光蛋白、受体荧光蛋白、传感器结构 域和配体结构域的任2个区域之间而使用，对于用在哪个区域间没有 特别限定。例如，如图3所示，能够用在传感器结构域和配体结构域 之间的连接。

本发明的单分子型FRET生物传感器是基于荧光共振能量转移原 理的单分子型FRET生物传感器，其为具有传感器区域、配体区域、 受体荧光蛋白区域、供体荧光蛋白区域和连接该传感器区域和配体区 域的接头区域的融合蛋白，该接头区域由上述本发明的接头构成。本 发明的单分子型FRET生物传感器的优选方式为：至少包含供体荧光 蛋白、受体荧光蛋白、传感器结构域、配体结构域、接头的5个区域 的至少每一个，并且，从氨基末端侧包含供体（或受体）荧光蛋白、 传感器（或配体）结构域、EV接头、配体（或传感器）结构域、受体 （或供体）荧光蛋白的方式（1）；至少包含供体荧光蛋白、受体荧光 蛋白、传感器结构域、配体结构域、接头的5个区域的至少每一个， 并且，从氨基末端侧包含传感器（或配体）结构域、供体（或受体） 荧光蛋白、EV接头、受体（或供体）荧光蛋白、配体（或传感器）结 构域的方式（2）；至少包含供体荧光蛋白、受体荧光蛋白、传感器结 构域、配体结构域、接头的5个区域的至少每一个，并且，从氨基末 端侧包含供体（或受体）荧光蛋白、传感器（或配体）结构域、EV接 头、受体（或供体）荧光蛋白、配体（或传感器）结构域的方式（3）； 至少包含供体荧光蛋白、受体荧光蛋白、传感器结构域、配体结构域、 接头的5个区域的至少每一个，并且，从氨基末端侧包含传感器（或 配体）结构域、供体（或受体）荧光蛋白、EV接头、受体（或供体） 荧光蛋白、配体（或传感器）结构域的方式（4）。

传感器区域包括磷酸化的肽或者低分子量GTP结合蛋白的情况下 优选方式（1）。因此，该EV接头在单分子型FRET生物传感器中优选 存在于配体区域和传感器区域之间。此外，在单分子型FRET生物传 感器中不一定必须存在各一个受体荧光蛋白、受体荧光蛋白、传感器 区域、配体区域、EV接头，也可以存在多个。

作为构成供体荧光蛋白区域的供体荧光蛋白，只要保持形成FRET 对的功能，就没有特别限定，但是从功能性的观点出发，优选CFP或 TFP（Teal Fluorescence Protein）。构成另一方面的受体荧光蛋白区域的 受体荧光蛋白也同样，只要保持形成FRET对的功能，就没有特别限 定，但是从功能性的观点出发，优选YFP。在此，所谓的FRET对的 功能，是指从激发状态的供体荧光蛋白向附近的受体荧光蛋白转移激 发能量，并能够检测该激发能量的转移。

供体荧光蛋白和/或受体荧光蛋白只要能够保持形成FRET对的功 能，则也可以为这些蛋白质的一部分，而不一定为全长。通过屡屡缩 短这些氨基酸序列的羧基末端，产生FRET效率之差的增大。例如， 作为受体荧光蛋白和/或供体荧光蛋白的一部分，可以例举在这些氨基 酸序列的羧基末端区域优选具有至少1个、更优选1～11个缺失的蛋 白。其中，该区域中的氨基酸缺失部位没有特别限定。例如，在YFP 的情况下，其氨基酸序列的羧酸末端区域优选具有至少1个、更优选 1～11个、更优选11个氨基酸缺失。在CFP的情况下，其氨基酸序列 的羧酸末端区域中优选具有至少1个、更优选1～11个、更优选11个 氨基酸缺失。

这里，羧酸末端区域是指在本发明中使用的GFP关联蛋白质的氨 基酸序列中，从其羧酸末端直到氨基酸的个数优选1～20个、更优选 11个的区域。此外，是否保持形成FRET对的功能，例如能够通过以 下方法评价，即，依照公知的方法在大肠杆菌中共同产生假想形成 FRET对的一对蛋白质分子，在含有该一对蛋白质的细胞提取液中，观 察该蛋白质在各自的假定激发波长下的荧光强度。

而且，受体荧光蛋白和/或受体荧光蛋白是否具有突变都可以。只 要是能够保持形成FRET对的功能，则突变的导入可以对受体荧光蛋 白和/或受体荧光蛋白的氨基酸序列中的任意部位进行。例如，作为突 变的方式，可以举出多个氨基酸的取代，作为这样的氨基酸取代的具 体方式，例如可以举出GFP的突变体Leu65Phe、Phe47Leu、Thr66Ser 等。通过导入这样的突变，能够获得使得发色团形成效率上升、FRET 效率上升等效果，因此优选。突变的导入能够通过公知的使用PCR（聚 合酶链式反应）的方法进行。作为YFP的突变体，例如，可以举出Ypet [Nguyen A.W.,and P.S.Daugherty.Evolutionary optimization of  fluorescent proteins for intracellular FRET.2005.Nat.Biotechnol. 23:355-360]、EYFP（Clontech公司）、Venus[Nagai,T.,K.Ibata,E.S. Park,M.Kubota,K.Mikoshiba,and A.Miyawaki.A variant of yellow  fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological  applications.2002.Nat.Biotechnol.20:87-90.]等，作为CFP的突变体， 例如能够举出CyPet[Nguyen A.W.,and P.S.Daugherty.Evolutionary  optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET.2005.Nat. Biotechnol.23:355-360]、ECFP（Clontech公司）、SECFP（非专利 文献5）、Turquoise（Goedhart,J.,L.an Weeren,M.A.Hink,N.O.Vischer, K.Jalink,and T.W.Gadella,Jr.Bright cyan fluorescent protein variants  identified by fluorescence lifetime screening.2010.Nat.Methods 7:137-139.）等。作为受体荧光蛋白和供体荧光蛋白的组合，适宜使用 Venus和ECFP、YPet和ECFP、Venus和Turquoise、YPet和Turquoise。

作为构成传感器区域的传感器蛋白和构成配体区域的配体的组 合，没有特别限定，可以适宜举出能够测定丝氨酸-苏氨酸激酶活性、 酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结合蛋白的任一个的组合。作为测定 丝氨酸-苏氨酸激酶活性的组合，可以适宜地举出包含叉头关联 （Forkhead-associated，以下记载为FHA1）区域、WW（Trp-Trp）区 域、或者BRCT（BRCA1-C末端）区域和丝氨酸或苏氨酸的肽序列； 作为测定酪氨酸激酶活性的组合，可以适宜地举出包含SH2（Src同源 -2）结构域或PTB（Phsophotyrosine-binding：磷酸酪氨酸结合）结构 域和酪氨酸的肽序列；作为测定低分子量GTP结合蛋白活性的组合， 可以适宜地举出包含Ras家族低分子量GTP结合蛋白、Rho家族低分 子量GTP结合蛋白、Rab家族低分子量GTP结合蛋白、Arf家族低分 子量GTP结合蛋白、或者Ran家族低分子量GTP结合蛋白和各自的 标的蛋白。

作为本发明的单分子型FRET生物传感器的构成要素和分别特别 优选的组合，从有效性、特异性、灵敏度的观点出发，传感器区域为 低分子量GTP结合蛋白Ras，配体区域为Ras的标的蛋白Raf，供体荧 光蛋白为CFP，受体荧光蛋白为YFP；或者，传感器区域为低分子量 GTP结合蛋白Rac1，配体区域为Rac1的标的蛋白Pak，供体荧光蛋白 为CFP，受体荧光蛋白为YFP；或者，传感器区域为低分子量GTP结 合蛋白Cdc42，配体区域为Cdc42的标的蛋白Pak，供体荧光蛋白为 CFP，受体荧光蛋白为YFP；或者，传感器区域为由蛋白激酶A（A激 酶，以下记为PKA）磷酸化的肽，配体区域为FHA1结构域，供体荧 光蛋白为CFP，受体荧光蛋白为YFP；或者，传感器区域为由细胞外 信号调节激酶（Extracellular Signal-regulated Kinase，以下记载为ERK） 磷酸化的肽，配体区域为WW结构域，供体荧光蛋白为CFP，受体荧 光蛋白为YFP；或者，传感器区域为由酪氨酸激酶磷酸化的肽，配体 区域为Crk蛋白的SH2结构域，供体荧光蛋白为CFP，受体荧光蛋白 为YFP。

受体（供体）荧光蛋白、配体（或传感器）结构域、低分子量GTP 结合蛋白、标的蛋白的结合顺序，从增大增益的观点出发，在包含本 发明的EV接头的单分子型FRET生物传感器中，优选可以例举从氨基 酸末端侧为YFP-FHA1-EV接头-PKA底物肽-CFP、YFP-FHA1-EV接 头-ERK底物肽-CFP、YFP-Raf-EV接头-Ras-CFP、YFP-Rac1-EV接头 -Pak-CFP、YFP-Cdc42-EV接头-Pak-CFP、或者YFP-CRK SH2结构域 -EV接头-酪氨酸激酶底物肽-CFP。这些中，能够适宜地使用YFP和 CFP的位置相互交换的，或者也能够适宜地使用YFP和CFP的各种突 变体，例如Ypet、CyPet、EYFP（Clontech公司）、ECFP（Clontech公 司）、SECFP、Venus等。

本发明的单分子型FRET生物传感器只要是具有上述5个区域的 即可，为了根据目的改变细胞内分布，或者为了容易进行单分子型 FRET生物传感器的精制，适宜使用在其N末端、C末端或者单分子型 FRET生物传感器内部含有肽标签、其他荧光蛋白或者细胞内定位信 号、调节蛋白质-蛋白质之间相互作用的结构域等。

对于上述本发明的EV接头是否实现本发明所期望的效果的评价， 例如，基于后述的实施例1记载的方法进行评价。

本发明还提供编码本发明的上述EV接头的基因（DNA）和编码 本发明的上述单分子型FRET生物传感器的基因（DNA）。EV接头的 基因能够化学合成，此外，上述单分子型FRET生物传感器的基因， 对于EV接头以外的上述各构成蛋白质而言，能够从GenBank等获得 基因信息，通过公知的使用PCR的方法和使用限制性内切酶和连接酶 的方法依照通常的方法制作。

本发明还提供包含上述基因的表达载体。这样的载体能够通过下 述方法获得，即，依照公知的方法将编码本发明的EV接头或者单分子 型FRET生物传感器的基因插入公知的原核细胞表达载体，例如 pGEX-2T（GE Healthcare公司制造）、真核细胞表达载体，例如 pCAGGS[Niwa,H.,K.Yamamura,and J.Miyazaki.1991.Efficient  selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene108:193-200.]、或者病毒载体，例如pCX4[Iwahara,T.,T.Akagi,Y. Fujitsuka,and H.Hanafusa.2004.CrkII regulates focal adhesion kinase  activation by making a complex with Crk-associated substrate,p130Cas. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A101:17693-17698.]而得到。

本发明还提供保持上述表达载体的转化细胞和转基因非人动物。 该转化细胞通过将上述表达载体导入作为对象的细胞而获得。作为导 入细胞中的方法，能够使用公知的转染法或病毒感染法，没有特别限 定，例如磷酸钙法、脂质转染法、电穿孔法或者使用转座子的方法等。 作为该细胞，能够使用真核细胞或者原核细胞，没有特别限定。例如， 作为真核细胞能够使用来自人癌的HeLa细胞、来自人胎儿肾脏的 HEK293细胞、来自狗肾脏的MDCK细胞、来自猴肾脏的COS7细胞、 大鼠C6神经胶质瘤细胞、酵母等，作为原核细胞能够使用大肠杆菌等 及其他的各种细胞。

另一方面，通过公知的方法，例如，在小鼠受精卵的核内显微注 射质粒DNA的方法或者利用Tol2转座酶的方法[Sumiyama,K.,K. Kawakami,and K.Yagita.2010.A simple and highly efficient transgenesis  method in mice with the Tol2transposon system and cytoplasmic  microinjection.Genomics95:306-311.]等将上述表达载体直接导入小鼠 等的个体中，能够获得转基因非人动物。作为转基因非人动物，只要 是人以外的则没有特别限定，能够举出小鼠、大鼠、猪、斑马鱼、线 虫等。从应用于医药产业的观点出发，优选小鼠。

本发明还提供测定丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低 分子量GTP结合蛋白活性的任一个的测定方法，该测定方法包括使用 本发明的单分子型FRET生物传感器检测FRET的工序。作为使用本 发明的单分子型FRET生物传感器检测FRET的工序，可以举出在荧 光显微镜下观察表达单分子型FRET生物传感器的细胞株、进行定时 摄影的方法；使用流式细胞仪分析表达单分子型FRET生物传感器的 细胞株的方法等。通过这些方法就检测本发明的单分子型FRET生物 传感器中的FRET，从而能够测定丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激 酶活性、低分子量GTP结合蛋白活性。

此外，本发明提供测定丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性 以及低分子量GTP结合蛋白活性的任一个的测定方法，该测定方法包 括使用本发明的转化细胞或者转基因非人动物检测FRET的工序。丝 氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性以及低分子量GTP结合蛋白活 性能够通过使用上述的能够测定丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶 活性、低分子量GTP结合蛋白活性的任一个的具有传感器区域和配体 区域的单分子型FRET生物传感器来测定。作为检测FRET的工序， 只要能够检测FRET激发能量的转移，就没有特别限定，例如，可以 举出使用显微镜的测定方法、使用流式细胞仪的测定方法、使用分光 光度计的测定方法、使用荧光ELISA检测仪的方法等。该测定方法中， 检测FRET，能够直接测定该细胞或动物中的丝氨酸-苏氨酸激酶活性、 酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结合蛋白活性。在这样的情况下，能 够另外使用磷酸化特异性抗体，计算磷酸化的比例，测定对应的FRET 效率，制作标准曲线；或者测定GTP结合的低分子量GTP结合蛋白和 由GTP的无机磷酸游离产生的GDP结合的低分子量GTP结合蛋白， 计算GTP/GDP比[或者GTP/（GDP+DTP）比]（均为摩尔比），测定对 应的FRET效率，制作标准曲线。使用这样的标准曲线，根据该细胞 或者动物的FRET效率，计算磷酸化、GTP/GDP比。

例如，示例如下的具体方法。

在荧光显微镜下观察表达本发明的单分子型FRET生物传感器的 本发明的转化细胞或者转基因非人动物，直接检测传感器区域的结构 变化前后产生的FRET效率的变化。该测定方法基于（非专利文献1） 进行。在转基因非人动物的情况下，观察对象优选例如外耳等容易固 定的部位。

使用的荧光显微镜没有特别限定，优选具有公知的氙光源的倒置 荧光显微镜（IX81，奥林巴斯公司生产）上具备旋转式荧光激发滤 色片和旋转式荧光发光滤色片、具备高灵敏度冷却CCD照相机的显 微镜。滤色片和照相机图像优选能够通过Molecular Devices公司生 产的MetaMorph图像分析软件控制和分析的系统。

对上述细胞或者动物照射供体荧光蛋白的激发光，供体荧光蛋白 的荧光波长下的图像通过CCD照相机拍摄，然后，拍摄受体荧光蛋白 的荧光波长下的图像。测定两图像的荧光强度的比，由此能够计算各 测定点的FRET效率。

根据本发明，能够提供包含本发明的EV接头的、可以非侵袭性地 测定丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结合蛋 白活性的单分子型FRET生物传感器、其基因等。能够进行非侵袭性 活性测定是由于使用的激发光为可见光区域的缘故。还提供表达这样 的单分子型FRET生物传感器、保持在非侵袭性测定丝氨酸-苏氨酸激 酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结合蛋白活性中有用的上述 表达载体的转化细胞和转基因非人动物、以及使用包含上述EV接头的 单分子型FRET生物传感器测定丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶 活性、低分子量GTP结合蛋白活性的方法。因此，在细胞内或者个体 内非侵袭性地获知丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子 量GTP结合蛋白活性成为可能，不仅能够理解生命现象，还能够在药 剂开发（例如，癌、自身免疫疾病、过敏性疾病等的治疗剂或者预防 剂）方面带来利益。

作为本发明的其他方式，提供丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激 酶活性、低分子量GTP结合蛋白活性调节物质的筛选方法。即，该筛 选方法为丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结 合蛋白活性的任一个的调节物质的筛选方法，包括：（a）使本发明的 转化细胞与被检物质接触的工序、和（b）通过检测FRET而检测丝氨 酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结合蛋白活性的 任一个的变化的工序。本发明的转化细胞是表达本发明的单分子型 FRET生物传感器、保持包含具有EV接头的单分子型FRET生物传感 器基因的表达载体的转化细胞。根据本发明的筛选方法，构建表达包 含本发明的EV接头的单分子型FRET生物传感器的细胞，使用生物检 测体系，由此能够有效筛选使得丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶 活性、低分子量GTP结合蛋白活性变化的物质或其盐（即，丝氨酸- 苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结合蛋白的活性调 节物质）。作为该方法中的被检物质没有特别限定，例如能够举出肽、 蛋白质、非肽性物质、合成物质、发酵产物等。

实施例

以下，根据实施例说明本发明，但是本发明的范围不限于这些实 施例。

（实施例1）

由Eevee-PKA进行的丝氨酸-苏氨酸激酶A激酶（PKA）的酶活性 测定

（1）编码用于测定PKA的酶活性的包含EV接头的单分子型FRET生 物传感器的基因的制作

（i）用于插入EV接头基因的平台Eevee-PKA-G72（3520NES）基因 的制作

单分子型FRET生物传感器Eevee-PKA-G72（3520NES）基因使 用PCR等公知的方法制造（图3）。即，单分子型FRET生物传感器从 氨基末端依次具有YFP、接头、配体结构域（本例中是与磷酸化苏氨 酸特异性结合的FHA1结构域）、接头、由PKA磷酸化的底物序列、 接头、CFP供体荧光蛋白。说明该碱基序列（序列号：1）和预测的氨 基酸序列（序列号：2）：

nt1-714：水母（Aequorea）的YFP（YPet）

nt715-720：接头（Leu-Glu）

nt721-1143：酵母的Rad53基因的FHA1结构域

nt1144-1149：接头（Gly-Thr）

nt1150-1392：甘氨酸接头

nt1393-1437：PKA的底物序列

nt1438-1446：接头（Gly-Gly-Arg）

nt1447-2163：水母的CFP（ECFP）

nt2164-2169：接头（Ser-Arg）

nt2170-2205：核输出信号（NES）

nt2206-2208：终止密码子

（ii）EV20接头的合成和Eevee-PKA-20基因（3532NES）的制作

将正义引物F_20a.a_linker（序列号：3）和反义引物R_20a.a_linker （序列号：4）退火，插入3520NES的Asp7181和Aor3HI的限制性内 切酶的切断部位。该插入的核苷酸所编码的20个氨基酸的接头称为 EV20接头（序列号：5）。此外，将YPet取代为Venus。所制作的单分 子型FRET生物传感器命名为Eevee-PKA-20（3532NES）。说明该碱基 序列（序列号：6）和预测的氨基酸序列（序列号：7）：

nt1-714：水母（Aequorea）的YFP（Venus）

nt715-720：接头（Leu-Glu）

nt721-1143：酵母的Rad53基因的FHA1结构域

nt1144-1149：接头（Gly-Thr）

nt1150-1209：EV20接头（序列号：5）

nt1210-1215：接头（Ser-Gly）

nt1216-1239：PKA的底物序列

nt1239-1248：接头（Gly-Gly-Arg）

nt1249-1965：水母的CFP（ECFP）

nt1966-1971：接头（Ser-Arg）

nt1972-2007：核输出信号（NES）

nt2008-2010：终止密码子

（iii）Eevee-PKA-52（3535NES）的制作

用限制性内切酶EcoRI和Asp718I切断Eevee-PKA-20的哺乳细胞 表达载体pEevee-PKA-20，将尺寸大的片段调整为载体。将该 pEevee-PKA-20片段与用EcoRI和Aor3HI切断得到的包含接头的部分 以及将正义引物F_10a.a_linker（序列号：8）和反义引物R_10a.a_linker （序列号：9）进行退火得到的DNA这3者进行连接，制作了 pEevee-PKA-52。说明该碱基序列（序列号：10）和预测的氨基酸序列 （序列号：11）：

nt1-714：水母（Aequorea）的YFP（Venus）

nt715-720：接头（Leu-Glu）

nt721-1143：酵母的Rad53基因的FHA1结构域

nt1144-1149：接头（Gly-Thr）

nt1150-1305：EV52接头（序列号：12）

nt1306-1311：接头（Ser-Gly）

nt1312-1335：PKA的底物序列

nt1336-1344：接头（Gly-Gly-Arg）

nt1345-2061：水母的CFP（ECFP）

nt2062-2067：接头（Ser-Arg）

nt2068-2103：核输出信号（NES）

nt2104-2106：终止密码子

（iv）pEevee-PKA-84（3537NES）的制作

用限制性内切酶EcoRI和Asp718I切断Eevee-PKA-20的哺乳细胞 表达载体pEevee-PKA-20，将尺寸大的片段调整为载体。将该 pEevee-PKA-20片段与用EcoRI和Aor3HI切断的含有接头的部分以及 将正义引物F_10a.a_linker（序列号：8）和反义引物R_10a.a_linker（序 列号：9）进行退火得到的DNA这3者进行连接，制作了Eevee-PKA-84。 说明该碱基序列（序列号：13）和预测的氨基酸序列（序列号：14）：

nt1-714：水母（Aequorea）的YFP（Venus）

nt715-720：接头（Leu-Glu）

nt721-1143：酵母的Rad53基因的FHA1结构域

nt1144-1149：接头（Gly-Thr）

nt1150-1401：EV84接头（序列号：15）

nt1402-1407：接头（Ser-Gly）

nt1408-1431：PKA的底物序列

nt1432-1440：接头（Gly-Gly-Arg）

nt1441-2157：水母的CFP（ECFP）

nt2158-2163：接头（Ser-Arg）

nt2164-2199：核输出信号（NES）

nt2200-2202：终止密码子

（v）pEevee-PKA-116（3536NES）的制作

用限制性内切酶EcoRI和Asp718I切断Eevee-PKA-52的哺乳细胞 表达载体pEevee-PKA-20，将尺寸大的片段调整为载体。将该 pEevee-PKA-52片段与用EcoRI和Aor13HI切断的包含接头的部分以 及将正义引物F_10a.a_linker（序列号：8）和反义引物R_10a.a_linker （序列号：9）进行退火得到的DNA这3者进行连接，制作了 Eevee-PKA-116。说明该碱基序列（序列号：16）和预测的氨基酸序列 （序列号：17）：

nt1-714：水母（Aequorea）的YFP（YPet）

nt715-720：接头（Leu-Glu）

nt721-1143：酵母的Rad53基因的FHA1结构域

nt1144-1149：接头（Gly-Thr）

nt1150-1497：EV116接头（序列号：18）

nt1498-1503：接头（Ser-Gly）

nt1504-1527：PKA的底物序列

nt1528-1536：接头（Gly-Gly-Arg）

nt1537-2247：水母的CFP（ECFP）

nt2248-2253：接头（Ser-Arg）

nt2254-2289：核输出信号（NES）

nt2290-2292：终止密码子

（vi）pEevee-PKA-5（3522NES）的制作

单分子型FRET生物传感器pEevee-PKA-5使用PCR等公知的方 法制作，说明该碱基序列（序列号：19）和预测的氨基酸序列（序列 号：20）：

nt1-714：水母（Aequorea）的YFP（Venus）

nt715-720：接头（Leu-Glu）

nt721-1143：酵母的Rad53基因的FHA1结构域

nt1144-170：接头（Gly-Thr-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly）

nt1171-1194：PKA的底物序列

nt1195-1203：接头（Gly-Gly-Arg）

nt1204-1920：水母的CFP（ECFP）

nt1921-1926：接头（Ser-Arg）

nt1927-1962：核输出信号（NES）

nt1963-1965：终止密码子

（vii）pEevee-PKA-180（3597NES）的制作

用限制性内切酶EcoRI和Asp718I切断pEevee-PKA-116，将尺寸 大的片段调整为载体。将该pEevee-PKA-116片段与用EcoRI和Aor3HI 切断的包含接头的部分以及将正义引物F_10a.a_linker（序列号：8）和 反义引物R_10a.a_linker（序列号：9）进行退火得到的DNA这3者进 行连接，制作了Eevee-PKA-180。并将Venus取代为YPet。说明该碱 基序列（序列号：21）和预测的氨基酸序列（序列号：22）：

nt1-714：水母（Aequorea）的YFP（YPet）

nt715-720：接头（Leu-Glu）

nt721-1143：酵母的Rad53基因的FHA1结构域

nt1144-1149：接头（Gly-Thr）

nt1150-1689：EV180接头（序列号：23）

nt1690-1695：接头（Ser-Gly）

nt1696-1719：PKA的底物序列

nt1720-1728：接头（Gly-Gly-Arg）

nt1729-2439：水母的CFP（ECFP）

nt2440-2445：接头（Ser-Arg）

nt2446-2481：核输出信号（NES）

nt2482-2484：终止密码子

（vii）pEevee-PKA-244（3598NES的制作）

用限制性内切酶EcoRI和Asp718I切断pEevee-PKA-116，将尺寸 大的片段调整为载体。将该pEevee-PKA-116片段与用EcoRI和Aor3HI 切断的包含接头的部分以及将正义引物F_10a.a_linker（序列号：8）和 反义引物R_10a.a_linker（序列号：9）进行退火得到的DNA这3者进 行连接，制作了Eevee-PKA-244。说明该碱基序列（序列号：24）和预 测的氨基酸序列（序列号：25）：

nt1-714：水母（Aequorea）的YFP（YPet）

nt715-720：接头（Leu-Glu）

nt721-1143：酵母的Rad53基因的FHA1结构域

nt1144-1149：接头（Gly-Thr）

nt1150-1881：EV244接头（序列号：26）

nt1882-1887：接头（Ser-Gly）

nt1888-1911：PKA的底物序列

nt1912-1920：接头（Gly-Gly-Arg）

nt1921-2631：水母的CFP（ECFP）

nt2632-2637：接头（Ser-Arg）

nt2638-2673：核输出信号（NES）

nt2674-2676：终止密码子

（2）包含EV接头的单分子型FRET生物传感器（Eevee-PKA）在哺 乳类细胞中的表达和由定时荧光显微镜进行的分析

在此，将具有各种长度的EV接头的PKA的生物传感器总称为 Eevee-PKA，将其哺乳细胞表达载体总称为pEevee-PKA。作为哺乳细 胞表达载体使用pCAGGS[Niwa,H.,K.Yamamura,and J.Miyazaki. 1991.Efficient selection for high-expression transfectants with a novel  eukaryotic vector.Gene108:193-200.]。来自宫颈癌的HeLa细胞在含有 10%胎牛血清的DMEM培养基（INVITROGEN公司生产）中培养。使 用293fectin（INVITROGEN公司生产），根据该试剂附加的操作方法 将上述（1）中得到的pEevee-PKA转染HeLa细胞。将转染后的HeLa 细胞在含有10%胎牛血清的DMEM培养基（INVITROGEN公司生产） 中培养，使Eevee-PKA蛋白表达。转染24小时后，通过定时荧光显微 镜观察培养细胞。

该显微镜是具备旋转式荧光激发滤色装置和旋转式荧光发光滤色 装置（LUDL electronic公司生产）、还具备高灵敏度冷却CCD照相机 （NIPPON ROPER公司生产CoolSNAP-HQ）的、具有氙光源的倒置荧 光显微镜（奥林巴斯公司生产，IX81），观察时，该显微镜的控制和观 察结果的分析使用由日本Molecular Devices公司生产的MetaMorph图 像分析软件进行的系统。荧光激发滤色片、荧光发光滤色片、分色镜 从Omega公司购入。

对上述培养细胞照射440nm的激发光，由CCD照相机拍摄在 480nm的CFP供体的荧光波长下的图像，接着，照射在530nm的YFP 受体的荧光波长下的图像。根据两图像数据求出两者的荧光强度比， 作为各测定点的FRET效率的指标。

通过添加作为PKA活化剂的1mM的联丁酰基cAMP并与刺激前 的FRET效率比较，就能够知道Eevee-PKA的增益。如图4所示，由 PKA的活化而变化的增益，通过使用52个氨基酸以上的长度的EV接 头而显著增加。

此外，将YFP供体蛋白设为最适于FRET的物质，例如为YPet， 效果更显著（图6）。但是，该效果在116个氨基酸时几乎饱和，即使 比其更长也没有显著的效果。

为了研究该增益增大的原因，测定了基础状态的荧光曲线（图7A、 B和C）。可知随着EV接头变长，基础状态的YFP供体蛋白质的荧光 减少。即，可知EV接头通过减少基础状态的FRET而得到高的增益。 该效果一直持续直至达到244个氨基酸。

（3）由免疫印迹法分析Eevee-PKA的磷酸化水平

与上述同样在HeLa细胞中表达Eevee-PKA，24小时后，用1mM 的联丁酰基cAMP和50nM花萼海绵诱癌素处理之后，用公知的方法 将细胞可溶化，通过SDS-PAGE进行分离。其中，在蛋白质分离中使 用含有50μM PhosTag（PhosTag企业集团）的6%聚丙烯酸酰胺凝胶。 转印到PVDF膜（Millipore公司生产）之后，与anti-GFP抗体（自家 制）反应，接着，用IRDye800CW标记抗兔抗体（LI-COR公司制造） 检测Eevee-PKA蛋白质。结合的荧光标记抗体通过Odyssey荧光分析 仪（LI-COR公司生产）定量。如图8A和图8B所示，EV接头显著减 少基础状态的磷酸化水平。即，配体结构域通常因与传感器结构域结 合而具有阻碍活化状态的传感器区域返回基础状态的效果，但是EV接 头使得该效果降低，由此使基础状态的FRET降低，这就导致增益的 增大。

（实施例2）

由Eevee-Akt进行的丝氨酸-苏氨酸激酶Akt的酶活性测定

（1）编码用于测定丝氨酸-苏氨酸激酶Akt的酶活性的包含EV接头的 单分子型FRET生物传感器的基因的制作

利用合成引物等制作了将Eevee-Akt-84（3547NES）和 Eevee-Akt-116（3548NES）的PKA底物序列部位取代为适宜Akt的磷 酸化的氨基酸序列的基因。将该序列插入上述Eevee-PKA中，并且在 氨基末端插入Akt的PH结构域，表示由此制作得到的基因 Eevee-Akt-84和Eevee-Akt-116的碱基序列（序列号：27，29）和预测 的氨基酸序列（序列号：28，30）。此外，其结构如图9A和B所示。

Eevee-Akt-84（3547NES）

nt1-453：Akt蛋白的AH结构域

nt454-462：接头（Glu-Phe-Gly）

nt463-1176：水母（Aequorea）的YFP（YPet）

nt1177-1182：接头（Leu-Glu）

nt1183-1605：酵母的Rad53基因的FHA1结构域

nt1606-1611：接头（Gly-Thr）

nt1612-1863：EV84接头

nt1864-1869：接头（Ser-Gly）

nt1870-1902：PKA的底物序列

nt1903-1911：接头（Gly-Gly-Arg）

nt1912-2622：水母的CFP（ECFP）

nt2623-2628：接头（Ser-Arg）

nt2629-2664：核输出信号（NES）

nt2665-2667：终止密码子

Eevee-Akt-116（3548NES）

nt1-453：Akt蛋白的AH结构域

nt454-462：接头（Glu-Phe-Gly）

nt463-1176：水母（Aequorea）的YFP（YPet）

nt1177-1182：接头（Leu-Glu）

nt1183-1605：酵母的Rad53基因的FHA1结构域

nt1606-1611：接头（Gly-Thr）

nt1612-1959：EV116接头

nt1864-1965：接头（Ser-Gly）

nt1870-1998：PKA的底物序列

nt1903-2007：接头（Gly-Gly-Arg）

nt1912-2718：水母的CFP（ECFP）

nt2623-2724：接头（Ser-Arg）

nt2629-2760：核输出信号（NES）

nt2665-2763：终止密码子

（2）包含EV接头的单分子型FRET生物传感器（Eevee-Akt）在哺乳 类细胞中的表达和由定时荧光显微镜进行的分析

采用实施例1-（2）记载的方法进行分析，但是细胞使用COS7细 胞。如图10所示，116个氨基酸的EV接头能够显著降低基础状态。

（实施例3）

由Eevee-ERK进行的ERK的酶活性测定

（1）编码用于ERK的酶活性测定的包含EV接头的单分子型FRET生 物传感器Eevee-ERK（3550NES）的基因的制作

（i）利用PCR和合成引物制作了将Eevee-PKA-116的底物序列部位和 磷酸化蛋白质识别序列取代为ERK的底物序列的质粒。制作得到的质 粒命名为Eevee-ERK，说明该碱基序列（序列号：31）和预测的氨基 酸序列（序列号：32）：

nt1-714：水母（Aequorea）的YFP（YPet）

nt715-720：接头（Leu-Glu）

nt721-882：Pin1基因的WW区域

nt1144-888：接头（Gly-Thr）

nt1150-1236：EV116接头

nt1498-1242：接头（Ser-Gly）

nt1504-1272：ERK的底物序列

nt1528-1281：接头（Gly-Gly-Arg）

nt1537-1992：水母的CFP（ECFP）

nt2248-2004：接头（Gly-Arg-Ser-Arg）

nt2254-2040：核输出信号（NES）

nt2290-2043：终止密码子

（ii）也同样制作了在ERK底物中添加特有的锚定序列的载体，命名 为Eevee-ERK-DS（3560NES）。说明该碱基序列（序列号：33）和预 测的氨基酸序列（序列号：34）：

nt1-714：水母（Aequorea）的YFP（YPet）

nt715-720：接头（Leu-Glu）

nt721-882：Pin1基因的WW结构域

nt883-888：接头（Gly-Thr）

nt889-1236：EV116接头

nt1237-1242：接头（Ser-Gly）

nt1243-1272：ERK的底物序列

nt1273-1284：接头（Ala-Lys-Leu-Ser）

nt1285-1296：锚定序列（Phe-Gln-Phe-Pro）

nt1297-1305：接头（Gly-Gly-Arg）

nt1306-2016：水母的CFP（ECFP）

nt2017-2028：接头（Gly-Arg-Ser-Arg）

nt2029-2064：核输出信号（NES）

nt2065-2067：终止密码子

（2）包含EV接头的单分子型FRET生物传感器（Eevee-ERK）在哺 乳类细胞中的表达和由定时荧光显微镜进行的分析

采用实施例1-（2）记载的方法进行分析。即，在HeLa细胞中表 达Eevee-ERK，用EGF刺激。如图11A、B、C和D所示，具有EV 接头的生物传感器（3560NES）比包含Gly接头的生物传感器 （EKAR-1667nes）具有更大的增益。该效果的原因之一是起因于基础 状态的FRET降低。

（实施例4）

由包含EV接头的单分子型FRET生物传感器Picchu-734进行的酪 氨酸激酶活性测定

（1）用于测定酪氨酸激酶活性用的包含EV接头的单分子型FRET生 物传感器Picchu-734的制作

（i）将包含CrkII蛋白的SH2结构域的区域由PCR扩增并插入由XhoI 和Asp718I切断Eevee-PKA-116（3536NES）得到片段中。并取代底物 序列部位，制作了Picchu-734的基因。说明该碱基序列（序列号：35） 和预测的氨基酸序列（序列号：36）：

nt1-714：水母（Aequorea）的YFP（YPet）

nt715-720：接头（Leu-Glu）

nt721-1332：CRKII基因的SH2结构域

nt883-1338：接头（Gly-Thr）

nt889-1686：EV116接头

nt1237-1692：接头（Ser-Gly）

nt1243-1719：CRKII的酪氨酸磷酸化底物序列

nt1273-1728：接头（Ala-Lys-Leu-Ser）

nt1306-2439：水母的CFP（ECFP）

nt2017-2451：接头（Gly-Arg-Ser-Arg）

nt2029-2487：核输出信号（NES）

nt2065-2490：终止密码子

（2）用于测定酪氨酸激酶活性的包含EV接头的单分子型FRET生物 传感器Picchu-734在哺乳类细胞中的表达和由定时荧光显微镜进行的 分析

采用实施例3-（2）记载的方法进行分析。如图12所示，可知包 含EV接头的Picchu生物传感器（Picchu-734）与不含该接头的Picchu 生物传感器（Picchu-730）[Kurokawa,K.,N.Mochizuki,Y.Ohba,H. Mizuno,A.Miyawaki,and M.Matsuda.2001.A pair of FRET-based  probes for tyrosine phosphorylation of the CrkII adaptor protein in vivo.J. Biol.Chem.276:31305-31310.]相比具有更大的增益。

（实施例5）

由Raichu-Rac1进行的Rac1活性测定

（1）用于测定Rac1活性的含有EV接头的单分子型FRET生物传感器 Raichu-Rac1（2246X）的制作

（i）使用PCR等，以已知的Raichu-Rac1（1011X）（非专利文献5） 为基础制作了测定Rac1活性的单分子型FRET生物传感器Raichu-Rac1 （2241X）。说明该碱基序列（序列号：37）和预测的氨基酸序列（序 列号：38）：

nt1-714：水母（Aequorea）的YFP（YPet）

nt715-720：接头（Leu-Glu）

nt721-969：Pak蛋白的CRIB结构域

nt883-996：甘氨酸接头

nt1237-1527：Rac1

nt1273-1536：接头（Arg-Gly-Arg）

nt1306-2247：水母的CFP（Turquoise）

nt1273-2253：接头（Ser-Arg）

nt2017-2313：KRas蛋白的C末端结构域

nt2065-2316：终止密码子

（ii）以Raichu-Rac1（2241X）为基础，通过替换接头而制作了测定 Rac1活性的包含EV接头的单分子型FRET生物传感器Raichu-Rac1 （2246X）。说明该碱基序列（序列号：39）和预测的氨基酸序列（序 列号：40）：

nt1-714：水母（Aequorea）的YFP（YPet）

nt715-720：接头（Leu-Glu）

nt721-969：Pak蛋白的CRIB结构域

nt970-1332：EV116接头

nt1333-1860：Rac1

nt1861-1869：接头（Arg-Gly-Arg）

nt1870-2580：水母的CFP（Turquoise）

nt2581-2586：接头（Ser-Arg）

nt2587-2646：KRas蛋白的C末端结构域

nt2647-2649：终止密码子

（2）用于测定Rac1活性的包含EV接头的单分子型FRET生物传感器 Raichu-Rac1在哺乳类细胞中的表达和由定时荧光显微镜进行的分析

采用实施例3-（2）记载的方法进行分析。如图13A和图13B所 示，具有EV接头的Raichu生物传感器（Raichu-2246X）比具有通常 的接头的Raichu生物传感器（Raichu-2241X）在基础状态下的FRET 降低，EGF刺激下观察到的上升，即灵敏度大幅上升。

（3）稳定表达Raichu-Rac1（2246X）的细胞株的建立

将Raichu-Rac1（2246X）的基因插入pPB质粒中。将该质粒和转 座酶表达载体（pCMV-mPBase）[Yusa,K.,R.Rad,J.Takeda,and A. Bradley.2009.Generation of transgene-free induced pluripotent mouse  stem cells by the piggyBac transposon.Nat.Methods6:363-369.]同时转染 C6细胞，2天后，添加10μg/ml浓度的Blasticidine（杀稻瘟菌素），继 续培养2周。之后，在96孔培养皿中进行克隆。其结果，成功建立了 稳定表达生物传感器的培养细胞株。使用该细胞株能够长时间监控 Rac1活性。（图14A、B、C和D）。

（实施例6）

由Raichu-Cdc42（2253X）进行的Cdc42活性测定

（1）用于测定Cdc42活性的包含EV接头的单分子型FRET生物传感 器Raichu-Cdc42（2253X）的制作

（i）使用PCR等，以已知的Raichu-Cdc42（1054X）为基础制作了测 定Cdc42活性的单分子型FRET生物传感器Raichu-Cdc42（2253X）。 说明该碱基序列（序列号：41）和预测的氨基酸序列（序列号：42）：

nt1-714：水母（Aequorea）的YFP（YPet）

nt715-720：接头（Leu-Glu）

nt721-969：Pak蛋白的CRIB结构域

nt970-1332：EV116接头

nt1333-1857：Cdc42

nt1858-1866：接头（Arg-Gly-Arg）

nt1867-2577：水母的CFP（Turquoise）

nt2578-2583：接头（Ser-Arg）

nt2584-2643：KRas蛋白的C末端结构域

nt2644-2646：终止密码子

（2）用于测定Cdc42活性的包含EV接头的单分子型FRET生物传感 器Raichu-Cdc42在哺乳类细胞中的表达和由定时荧光显微镜进行的分 析

采用实施例3-（2）记载的方法进行分析。如图15A到图15C所 示，该生物传感器也观察到基础状态下低的FRET，迄今为止难以检测 的EGF刺激依赖性Cdc42的活化能够以高灵敏度检测出来。

（实施例8）

由Raichu-HRas（3705X）进行的HRas活性测定

（1）用于测定HRas活性的含有EV接头的单分子型FRET生物传感 器Raichu-HRas（3705X）的制作

（i）使用PCR等，以已知的Raichu-HRas[Mochizuki,N.,S.Yamashita, K.Kurokawa,Y.Ohba,T.Nagai,A.Miyawaki,and M.Matsuda.2001. Spacio-temporal images of growth factor-induced activation of Ras and  Rap1.Nature411:1065-1068.]为基础制作了测定HRas活性的单分子型 FRET生物传感器Raichu-HRas（3705X）。说明制作的基因Raichu-HRas （3705X）的碱基序列（序列号：43）和预测的氨基酸序列（序列号： 44）：

nt1-714：水母（Aequorea）的YFP（YPet）

nt715-720：接头（Leu-Glu）

nt721-1236：HRas蛋白质

nt1237-1602：EV116接头

nt1603-1845：Raf蛋白的RBD结构域

nt1846-1854：接头（Gly-Gly-Arg）

nt1855-2565：水母的CFP（Turquoise）

nt2566-2571：接头（Ser-Arg）

nt2584-2631：KRas蛋白的C末端结构域

nt2632-2634：终止密码子

（2）用于测定HRas活性的包含EV接头的单分子型FRET生物传感 器Raichu-HRas在哺乳类细胞中的表达和由定时荧光显微镜进行的分 析

通过实施例3-（2）记载的方法进行分析。图16A和B表示定时 FRET成像的数据。可知相比于原型的HRas[Mochizuki,N.,S. Yamashita,K.Kurokawa,Y.Ohba,T.Nagai,A.Miyawaki,and M. Matsuda.2001.Spacio-temporal images of growth factor-induced  activation of Ras and Rap1.Nature411:1065-1068.]，能够在更期检测出 更强的活性。

（实施例10）

表达Eevee-ERK（3560NES）和Eevee-PKA（3536NES）的转基因 小鼠的制作

（1）编码用于测定ERK和PKA的酶活性的包含EV接头的单分子型 FRET生物传感器Eevee-ERK（3560NES）和Eevee-PKA（3536NES） 的基因向受精卵的显微注射

将包含实施例1记载的Eevee-PKA（3536NES）或者实施例3记 载的Eevee-ERK（3560NES）基因的哺乳细胞表达质粒插入具有转座 子识别序列的质粒pT2A中。将该质粒和Tol2转座子如已经报道的那 样进行显微注射[Sumiyama,K.,K.Kawakami,and K.Yagita.2010.A  simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection.Genomics 95:306-311.]。

（2）表达生物传感器的转基因小鼠的筛选

出生的小鼠用420nm的LED照射，使用470nm短波长截止滤色 片，用彩色数码照相机拍摄，通过确认绿色荧光能够容易地鉴定出发 生了重组的小鼠。此外，通过以实施例1记载的荧光显微镜对胎儿的 矢状切面的FRET图像进行拍摄，能够研究ERK或者PKA活性的空 间分布（图17）。

（实施例11）

使用表达Eevee-ERK（3560NES）的细胞株的药剂感受性试验

（1）稳定表达编码用于测定ERK的酶活性的包含EV接头的单分子型 FRET生物传感器Eevee-ERK（3560NES）的基因的细胞株的建立

将实施例3记载的包含Eevee-ERK（3560NES）基因的哺乳细胞 表达质粒插入具有转座子识别序列的质粒中。将该质粒与转座子表达 载体如已报告的那样进行转基因，以杀稻瘟菌素（blasticidin）选择生 物传感器表达细胞株[Yusa,K.,R.Rad,J.Takeda,and A.Bradley.2009. Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the  piggyBac transposon.Nat.Methods6(5):363-369]。

（2）用稳定表达生物传感器的细胞株进行FRET测定

在96孔培养皿中接种培养细胞株，加入梯度稀释的抑制剂，之后 用25ng/ml的EGF刺激。30分钟后，如实施例3所记载的那样测定ERK 活性（图18A～图18H）。对30个以上的细胞测定ERK活性，将平均 值制成图表。使用的抑制剂是EGF受体抑制剂（AG1478）、MEK抑制 剂（PD15035、PD184351）、BRAF抑制剂（PLX4720）、磷脂酰肌醇 3-磷酸激酶的抑制剂（LY294002）、RSK的抑制剂（BI-D1870）、JNK 的抑制剂（JNK inhibitor VIII）。结果，在HeLa细胞中，EGF依赖性的 ERK活性被EGE受体（AG1478）和MEK抑制剂（PD153035、PD184352） 有效抑制。使用活细胞能够非常容易地测定EGF依赖性的ERK活性 被这些抑制剂浓度依赖性地抑制。

（实施例12）

使用表达Eevee-PKA（3536NES）的转基因小鼠的药剂感受性试 验

（1）表达Eevee-PKA（3536NES）的转基因小鼠的小肠成像

用异氟醚麻醉实施例10制作的表达Eevee-PKA（3536NES）的转 基因小鼠，用奥林巴斯公司制造的倒置双光子显微镜IX81/FV1000对 小肠进行定时摄影。使用Spectra Physics公司制造的钛宝石脉冲激光系 统Mai Tai DeepSee HP，以840nm激发细胞，通过BA460-500（奥林 巴斯）荧光过滤器取得CFP的荧光，通过BA520-560（奥林巴斯）荧 光滤色片获取YFP的荧光，如实施例3所记载的那样制作了FRET图 像。

（2）在活小鼠中的药剂效果的可视化

对小鼠分别静脉注射磷酸二酯酶的抑制剂茶碱和环腺苷三磷酸的 类似物布拉地新，测定PKA活性。如图19和20所示，分别在肌间神 经细胞、肠道平滑肌、血管平滑肌中的PKA的活性变化能够实时可视 化。

（实施例13）

如果增长接头的长度，则有可能容易引起蛋白酶的分解。因此， 制作了从接头中减少甘氨酸、增加容易获取α-螺旋的丙氨酸的接头 EV3×8和EV6×4，研究增益。

（1）（i）Eevee-PKA-3×8（3676NES）的制作

与实施例1（1）（iii）同样，用限制性内切酶Asp718I和Aor13HI 切断Eevee-PKA-20的哺乳细胞表达载体pEevee-PKA-20，将尺寸大的 片段调整为载体。合成在对应于EV3×8接头（序列号：45）的DNA 的两端添加有限制性内切酶Asp718I和Aor13HI的酶切位点的DNA。 用Asp718I和Aor13HI切断该DNA，将其作为插入序列使用。将插入 序列与载体连接，制作了pEevee-PKA-3×8。说明该碱基序列（序列号： 47）和预测的氨基酸序列（序列号：48）：

nt1-714：水母（Aequorea）的YFP（YPet）

nt715-720：接头（Leu-Glu）

nt721-1143：酵母的Rad53基因的FHA1结构域

nt1144-1149：接头（Gly-Thr）

nt1150-1551：EV3×8接头（序列号：45）

nt1552-1557：接头（Ser-Gly）

nt1558-1581：PKA的底物序列

nt1582-1590：接头（Gly-Gly-Arg）

nt1591-2307：水母的ECFP

nt2308-2313：接头（Ser-Arg）

nt2314-2349：核输出信号（NES）

nt2350-2352：终止密码子

（1）（ii）Eevee-PKA-6×4（3677NES）的制作

用限制性内切酶Asp718I和Aor13HI切断Eevee-PKA-20的哺乳细 胞表达载体pEevee-PKA-20，将尺寸大的片段调整为载体。合成在对应 于EV6×4接头（序列号：46）的DNA的两端添加有限制性内切酶 Asp718I和Aor13HI的酶切位点的DNA。用Asp718I和Aor13HI切断 该DNA，将其作为插入序列使用。将插入序列与载体连接，制作了 pEevee-PKA-6×4。说明该碱基序列（序列号：49）和预测的氨基酸序 列（序列号：50）：

nt1-714：水母（Aequorea）的YFP（YPet）

nt715-720：接头（Leu-Glu）

nt721-1143：酵母的Rad53基因的FHA1结构域

nt1144-1149：接头（Gly-Thr）

nt1150-1521：EV6×4接头（序列号：46）

nt1522-1527：接头（Ser-Gly）

nt1528-1551：PKA的底物序列

nt1552-1560：接头（Gly-Gly-Arg）

nt1561-2277：水母的ECFP

nt2278-2283：接头（Ser-Arg）

nt2284-2319：核输出信号（NES）

nt2320-2322：终止密码子

（2）与实施例1同样研究增益，可知EV3×8和EV6×4具有与116 个氨基酸相匹敌的增益（图21）。

工业实用性

根据本发明，提供能够非侵袭性地测定丝氨酸-苏氨酸激酶活性、 酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结合蛋白的活性等的EV接头和包含 该EV接头的单分子型FRET生物传感器；编码该EV接头和生物传感 器进行的基因；包含该基因的表达载体；表达上述生物传感器、保持 对非侵袭性测定丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量 GTP结合蛋白的活性有用的上述表达载体的转化细胞和转基因非人动 物；使用上述生物传感器的丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、 低分子量GTP结合蛋白的活性的测定方法；以及丝氨酸-苏氨酸激酶活 性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结合蛋白的活性调节物质的筛选 方法。