一种用于烟草防病促生的复合微生物肥料菌剂及其应用

摘要

本发明公开了用于烟草防病促生的复合微生物肥料菌剂及其应用。该菌剂是促进烟草生长和/或防治烟草病害的菌剂，其活性成分由里氏木霉（Trichoderma ressei）ACCC 30150和黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021组成。本发明的菌剂对环境友好，可抑制病害病原的耐药和抗药性发展，有利于绿色食品和有机农业的推广，并且成本低、无污染、对烟草作物安全。在土壤中引进拮抗微生物，通过生物防治可以有效地防治真菌、细菌性病害并可以有效的改善环境，维持农业生态系统平衡，为走烟草可持续发展道路提供强劲的后盾。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于烟草防病促生的复合微生物肥料菌剂及其应用。

背景技术

烟草是中国重要的经济作物，其品质好坏与生产效益密切相关。烟草品种、气候 条件、栽培措施、土壤与施肥、加工工艺等对烤烟品质均有重要影响，施肥技术是影 响烤烟品质最重要的因素之一。长期以来，我国烤烟生产中普遍存在着重施无机化肥 而轻视有机肥的现象，由于长期大量施用化肥和有机肥用量逐年减少，造成土壤生态 环境恶化、肥料利用率低及烟叶品质变劣、可利用性降低，成了当今质量效益型烤烟 生产的主要限制因子之一。近年来,随着中国烟叶生产的迅速发展，栽培技术不断革新， 烟草种植制度逐渐形成，烟草营养研究显得尤为重要，平衡施肥技术成为优质烟生产 的核心技术。为加强烟草生产的可持续发展,不断提高烟叶质量,烤烟生产逐年加大 了有机肥的推广施用。不少研究表明,有机肥与无机肥配合施用有利于烤烟的生长发 育。

我国烟草专用微生物有机肥开发历史不长，但专用肥的使用对提高我国烟叶生产 水平和烟叶质量发挥了重要作用。进入新世纪，我国烟草工业迅速发展壮大，对优质 烟叶的需求也越来越大。提高中式卷烟在国际上的竞争力需要优质烟叶作保障。因此， 优质烟叶的生产对烟草专用肥提出了更高要求。优质堆肥是很好的有机肥料和土壤改 良剂，腐熟堆肥不是简单地指经过长期的堆肥化处理使大部分有机质被分解而几乎没 有有机能量和生物学活性的堆肥，而是指在堆肥制作中易分解的有机质被降解,农田 施用后不给土壤和作物生长带来不利影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种促进烟草生长和/或防治烟草病害的菌剂和微生物有机 肥及其在防治烟草病害和促进烟草生长中的应用。

本发明所提供的促进烟草生长和/或防治烟草病害的菌剂，其活性成分由里氏木霉 （Trichoderma reesei）和黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）组成；所述里氏 木霉（Trichoderma reesei）为里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150，所述 黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）为黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus） ACCC 40021。

在本发明的一个实施例中，所述里氏木霉（Trichoderma reesei）和黄赭色链霉 菌（Streptomyces silaceus）的集落形成单位数目比为1:1。

所述菌剂还可包括载体，优选农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述 载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、植物材料或高分子化合物； 所述矿物材料为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少 一种；所述植物材料为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物为聚乙 烯醇和/或聚二醇。所述液体载体为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂为 癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，所述活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵 液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述活细胞可为分生孢子、 厚垣孢子、菌丝或含有分生孢子和菌丝的菌丝体的形式，优选为分生孢子或厚垣孢子 的形式。所述组合物的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、 可湿性粉剂或水分散粒剂。

根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂（如吐温20、吐温80等）、粘合剂、 稳定剂（如抗氧化剂）、pH调节剂等。

本发明的制剂中的里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150和黄赭色链霉菌 （Streptomyces silaceus）ACCC 40021的孢子数量随剂型和施用的方法而变化。固 体制剂中，分生孢子的数量为（1×10⁵）-（1×10⁸）个孢子/克，优选（1×10⁶）-（1 ×10⁷）个孢子/克。对于液体制剂，稀释后的喷洒液中分生孢子的含量通常为（2.0× 10⁴）-（5.0×10⁷）个孢子/mL，优选10⁷个孢子/mL。

所述制剂可以与其它适合的化学农药配合使用，从而降低化学农药剂的用量，减 少对环境的污染。

本发明所提供的促进烟草生长和/或防治烟草病害的微生物有机肥，由上述促进烟 草生长和/或防治烟草病害的菌剂和有机肥组成。

上述促进烟草生长和/或防治烟草病害的菌剂或含有所述菌剂的微生物有机肥在 促进烟草生长和/或防治烟草病害中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述菌剂可施入土壤中，所述菌剂的用量为每平方米土壤施入3× 10⁹-4.5×10⁹cfu所述菌剂，如每平方米土壤施入3×10⁹cfu所述菌剂。在本发明的一 个实施例中，所述菌剂的用量为每平方米土壤施入1.5×10⁹cfu所述黄赭色链霉菌 （Streptomyces silaceus）ACCC 40021和1.5×10⁹cfu里氏木霉（Trichoderma reesei） ACCC 30150。

上述应用中，所述菌剂可施入育苗基质中，所述菌剂的用量为每克育苗基质加入 2×10⁸-4.5×10⁸cfu所述菌剂，如每克育苗基质加入3×10⁸cfu所述菌剂。在本发明的 一个实施例中，所述菌剂的用量为每克育苗基质施入1.5×10⁸cfu所述黄赭色链霉菌 （Streptomyces silaceus）ACCC 40021和1.5×10⁸cfu里氏木霉（Trichoderma reesei） ACCC 30150。

上述菌剂、上述微生物有机肥和上述应用中，所述促进烟草生长可为a1-a7中的 7种、6种、5种、4种、3种、2种或1种：

a1、促进烟苗生长；

a2、提高烟草的烟叶产量；

a3、缩短烟草到达旺长期的时间；

a4、提高圆顶期烟草顶叶的叶长；

a5、提高圆顶期烟草顶叶的叶宽；

a6、提高圆顶期烟草腰叶的叶长；

a7、提高圆顶期烟草腰叶的叶宽；

所述烟草病害可为烟草青枯病、烟草赤星病和烟草黑胫病中的3种、2种或1种。

进一步，所述促进烟苗生长可为下述b1-b7中的全部或部分：

b1、促进烟苗根系的生长；

b2、促进烟苗茎的生长；

b3、促进烟苗叶的生长；

b4、提高烟苗茎叶重；

b5、提高烟苗根系重；

b6、提高烟草的出苗率；

b7、缩短烟草成苗时间。

更进一步，所述促进烟苗根系的生长体现为c1-c4中的全部或部分：

c1、提高烟苗根系表面积；

c2、提高烟苗根系体积；

c3、提高烟苗根系平均直径；

c4、提高烟苗总根长；

所述促进烟苗茎的生长体现为提高烟苗茎高和/或茎围；

所述促进烟苗叶的生长体现为提高烟苗叶长和/或叶宽和/或叶片数。

上文中，所述烟草具体可为云烟87或烤烟K326。

上文中，含有所述菌剂的微生物有机肥可由所述菌剂和包含有机肥的吸附基质组 成。在本发明的一个实施例中，包含有机肥基质材料由腐熟鸡粪、食用菌渣和糖厂甘 蔗渣混合而成。

实验证明，用活性成分是里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150和黄赭色 链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021的菌剂和吸附基质组成的微生物有机 肥处理的烟草（T3）与用相同的吸附基质处理的烟草（CK）相比，提前11天到达旺长 期，T3的腰叶叶长是CK的1.11倍，T3的腰叶叶宽是CK的1.18倍，T3的顶叶叶 长是CK的1.30倍，T3的顶叶叶宽是CK的1.33倍，T3的烟叶产量是CK的1.23 倍，T3对黑胫病的防治效果为63.5%，对赤星病的防治效果为86.7%，对青枯病的防 治效果为100%。用活性成分为黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021 的菌剂和吸附基质组成的微生物有机肥处理的烟草（T2）与用相同的吸附基质处理的 烟草（CK）相比，提前11天到达旺长期，T2的腰叶叶长是CK的1.07倍，T2的腰 叶叶宽是CK的1.14倍，T2的顶叶叶长是CK的1.30倍，T2的顶叶叶宽是CK的 1.26倍，T2的烟叶产量是CK的1.19倍，T2对黑胫病的防治效果为73.0%，对赤星 病的防治效果为66.7%，对青枯病的防治效果为100%。本发明的促进烟草生长和/或防 治烟草病害的菌剂对环境友好，可抑制病害病原的耐药和抗药性发展，有利于绿色食 品和有机农业的推广，并且成本低、无污染、对烟草作物安全。在土壤中引进拮抗微 生物，通过生物防治可以有效地防治真菌、细菌性病害并可以有效的改善环境，维持 农业生态系统平衡，为走烟草可持续发展道路提供强劲的后盾。

附图说明

图1为里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC30150和黄赭色链霉菌（Streptomyces  silaceus）ACCC 40021的亲和性测定结果。

a.黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021；b.里氏木霉（Trichoderma  reesei）ACCC 30150；c.黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021发酵 液；左图为对峙培养法，右图为牛津杯法。

图2为烟苗根系SOD、POD、CAT和PAL活性。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得 到的。

以下实施例中的定量试验，如无特别说明，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中所用的生防菌里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150和黄赭 色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021均于本申请的申请日前收藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心（简称ACCC），里氏木霉（Trichoderma  reesei）ACCC 30150的收藏日为1991年12月1日，黄赭色链霉菌（Streptomyces  silaceus）ACCC 40021的收藏日为1991年12月1日，自收藏之日起，公众可从中国 微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得这两个菌株。

下述实施例中所用的黑胫病致病菌为寄生疫霉卵菌纲真菌寄生疫霉烟草致病变种 (Phytophthora parasitica var.nicotianae），在中国微生物菌种保藏管理委员会农 业微生物中心的保藏编号为ACCC 38065，收藏日为2011年8月10日，自收藏之日起， 公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株，下述实施例中 均简称为黑胫病菌或烟草黑胫病病菌。

实施例中所用的赤星病致病菌为链格孢（Alternaria alternata），在中国微生 物菌种保藏管理委员会农业微生物中心的保藏编号为ACCC38066，收藏日为2011年8 月10日，自收藏之日起，下述实施例中均简称为烟草赤星病病菌。

实施例中所用的根腐病（猝倒病）致病菌为瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）， 在中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心的保藏编号为ACCC 38064，收藏日 为2011年8月10日，自收藏之日起下述实施例中均简称为烟草猝倒病病菌。

实施例1、里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150和黄赭色链霉菌 （Streptomyces silaceus）ACCC 40021生防菌组合对烟苗生长及其抗病性的影响

本实施例以烟草为试验材料，采用室内拮抗试验和活体筛选试验相结合的方法， 研究了里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150和黄赭色链霉菌（Streptomyces  silaceus）ACCC 40021两种生防菌复配的亲和性和抑菌广谱性，并分析了生防菌组合 对烟苗生长、防御酶活性和黑胫病防效的影响。结果表明：（1）两生防菌株无相互抑 制作用，具有较高的亲和性，并且两菌株本身及其代谢产物对不同生境下的病原菌（黑 胫病、猝倒病和赤星病）均具有较高的抑菌活性和较广的抑菌谱。（2）两菌株组合能 影响根部和地上部的形态建成，促进烟苗根系和茎、叶的生长，可显著增加地下部根 系体积、根系总表面积、根长和根系平均直径以及地上部茎高、茎围、叶长、叶宽和 生物量，具有显著的促生效能，并且生防菌组合的促生效应优于单独接种。（3）生防 菌组合能显著提高烟苗根系SOD、POD和CAT等防御酶活性，对烟草黑胫病的防治效果 达到了69.3%，具有显著的防病效能。本研究表明，里氏木霉（Trichoderma reesei） ACCC 30150和黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021是一个具有较高 亲和性的增效组合，两菌株复配后在防病、促生方面能够发挥协同增效作用，能够更 有效地促进烟苗生长和防治烟草黑胫病造成的伤害。具体实验方法和实验结果如下：

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试作物

烤烟，品种为K326，种子由玉溪中烟种子有限责任公司提供。

1.1.2 供试菌株

生防菌：里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150和黄赭色链霉菌 （Streptomyces silaceus）ACCC 40021。

烟草病原菌：烟草黑胫病病菌、烟草赤星病病菌和烟草猝倒病病菌。

分别取培养好的有烟草黑胫病病原菌孢子层培养皿，用接种环刮取孢子，加入20 mL无菌水，并加入1mL的1%吐温80，将孢子悬液倾入装有石英砂玻璃珠的孢子分散 瓶内，振荡20-30min。将孢子悬液经过灭菌的纱布过滤，用血球计数板测定孢子数， 用无菌水将滤液调至10⁵-10⁶cfu·mL^-1备用。黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus） ACCC 40021和里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150孢子悬浮液的制备同上， 孢子液浓度均为为10⁸-10⁹cfu·mL^-1。其中，黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus） ACCC 40021所用的培养基为高氏一号培养基（同实施例2），里氏木霉（Trichoderma  reesei）ACCC 30150所用的培养基为PDA培养基（同实施例2）。

1.1.3 育苗材料

漂浮育苗所用的基质为商用基质，均购置于中国农业科学院花卉市场，将各种育 苗材料混合均匀后置于121℃下高压灭菌2h后备用。烟草专用育苗肥（四川金叶化 肥有限公司生产），养分含量为N:P₂O₅:K₂O=19:10:20，硝态氮占总氮的60%。育苗池 规格为35.0cm（长）×28.0cm（宽）×20.0cm（高），漂浮盘规格为26.0cm×33.0 cm×6.5cm，70孔。

1.2 试验设计

1.2.1 菌株的相容性测定

用培养皿混合培养法和牛津杯法测定两株生防菌之间互作关系及其亲和性。

1.2.2 抑菌活性测定

对峙培养法：参照EL-Tarabily等（EL-TarabiLy K A,Nassar A H,Hardy G E. St.J,Sivasithamparam K.Plant growth promotion and biological control  of Pythium aphanidermatum,a pathogen of cucumber,by endophytic  actinomycetes.Journal of Applied Microbiology,2009,106(1):13-26）的方法， 将各供试病原菌和生防菌置于25℃黑暗条件下培养3d后，在超净工作台上用无菌打 孔器（5mm）沿其菌落边缘打菌饼，将里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150 分别与烟草黑胫病、猝倒病和赤星病病原菌菌饼接种于PDA培养基上距中心1.5cm 处同一直线上的两点上；在PDA和高氏一号等体积混合培养基上选取两点划线接种黄 赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021，在距离平行线等距离处接种烟草 病原菌菌饼；同时以只接病原菌和生防菌的培养基作为对照，每处理重复3次，28℃ 条件下倒置恒温培养，3d后观察记录。菌丝生长抑制率(%)=(对照菌落直径-处 理菌落直径)/对照菌落直径×100。

牛津杯法：将里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150和黄赭色链霉菌 （Streptomyces silaceus）ACCC 40021分别接种在高氏一号和PDA液体培养基（同 实施例2）中培养2-3d（190rpm，28℃）制成发酵液备用。将培养好的烟草病原菌 制成孢子浓度为1×10⁶cfu·mL^-1的菌悬液，取病原菌菌悬液0.1mL涂于PDA平板上， 然后在每个培养皿正中央摆放1个牛津杯，向其中加入0.2mL的生防菌发酵液，每个 处理重复3次，28℃培养，每24h观察记录抑菌圈半径。

1.2.3 活体筛选试验

本试验于2012年2至5月在中国农业科学院农业资源与农业区划所日光温室进 行。试验设5个处理，对照（CK）：育苗基质中只加等体积的无菌水，不接种烟草黑胫 病菌，也不接种生防菌；T0：育苗基质中只单接烟草黑胫病菌，不接种生防菌；T1： 育苗基质中接种烟草黑胫病菌和里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150；T2： 育苗基质中接种烟草黑胫病菌和单接黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021；T3：育苗基质中接种烟草黑胫病菌和里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150 和黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021。

生防菌接种：将制备好的孢子液（制备方法同1.1.2）与适量育苗基质混匀，使 育苗基质中孢子含量为3×10⁸cfu·g^-1。其中，T1处理中里氏木霉（Trichoderma  reesei）ACCC 30150的接种量为3×10⁸cfu·g^-1，T2处理中黄赭色链霉菌 （Streptomyces silaceus）ACCC 40021的接种量为3×10⁸cfu·g^-1，T3处理中黄 赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021与里氏木霉（Trichoderma reesei） ACCC 30150的接种量各均为1.5×10⁸cfu·g^-1，对照和T0用等量无菌水代替生防 菌液。

病原菌接种：在烟苗生出第6片真叶时采用浸根法接种烟草黑胫病菌，接种量为 每穴5mL，孢子液浓度为3×10⁵cfu·mL^-1，对照用等量无菌水代替病原菌液。每 个育苗盘（70株）为1个重复，每处理重复3次。

1.3 检测项目及方法

1.3.1 植物学性状的测定

在播种5d后开始调查各处理的出苗率及其生育期；成苗后每个处理随机选取生 长整齐且有代表性的10株烟苗，分别测定茎高、有效叶片数、最大叶长、最大叶宽、 茎围、地上部和地下部的干重和鲜重，具体参照烟草农艺性状调查方法(YC /T142-1998)。采用根系扫描仪（Epson Perfection V700 PHOTO）扫描根系样品获取 数字化图像，利用根系分析系统软件（WinRHIZO V2008a，Regent Instrument Inc， Canada）进行分析，获得根系形态参数，包括总根长、根系总表面积、根系体积和根 系平均直径及直径分别为≤0.2mm（细根）、0.2-0.6mm（中等根）和＞0.6mm（粗根） 范围内的根系长度。

1.3.2 防御酶指标测定

从每个处理样品中随机选取有代表性的烟苗根系，取白色根系0.5g放入预冷的 研钵中或加入液氮研磨，其间加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）0.1g，将研磨好的样品转 入10mL离心管，加入4℃预冷的提取液5mL，10,000rpm离心30min，弃沉淀，取 上清用于超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和过氧 化氢酶（CAT）活性测定。其中，SOD活性测定采用氮蓝四唑法[Shanghai Institute of  Plant Physiology of Chinese Academy of Science.Shanghai Society for Plant  Physiology.Modern Experimental Manual of Plant Physiology.Beijing:Science  Press(科学出版社),1999:314-315(in Chinese)]；POD活性测定采用愈创木酚比 色法[Chen J-X(陈建勋),Wang X-F(王晓峰).Experimental guidance of  plantphysiology.Guangzhou:South China University of Technology Press(华南 理工大学出版社),2000:119-122(in Chinese)]；PAL活性的测定参照薛应龙和欧 阳光的方法[Xue Y-L(薛应龙),OU Y-G-C(欧阳光察),AO S-G(澳绍根).Studies on  plantphenylalanine ammonia-lyase(PAL).Journal of PlantPhysiology(植物生理 学报),1993,19(3):301-305(in Chinese)]；CAT活性的测定参照Cakmak[Cakmak  I,Marschner H.Magnesium deficiency and high light intensity enhance  activities of superoxide dismutase,ascorbate peroxidase,and glutathione  reductase in bean leaves.Plant Physiology,1992,98:1222-1227]的方法。

1.3.3 黑胫病发生情况调查

接种黑胫病菌后开始调查黑胫病发生情况，病害分级按照烟草病害分级调查方法 YC/T23222-2008，并计算发病率、病情指数和防治效果。

发病率(%)=(发病株数/调查总株数)×100；

病情指数=[∑(各级病株或叶数×该病级值)]/(调查总株数或叶数×最 高级值)×100；

相对防治效果(%)=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100。

1.4 数据处理

数据经Excel 2007整理后，采用SAS 9.0进行方差分析，采用Duncan新复极差 方法检验不同处理之间的差异显著性（P<0.05），绘图由Excel 2007完成。

2 结果与分析

2.1 里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150和黄赭色链霉菌（Streptomyces  silaceus）ACCC 40021的亲和性测定结果

采用混合培养和牛津杯法测定两菌株相容性，72h后观察两株菌的生长及其互作 情况，结果如图1。从混合培养结果来看，在整个生长过程中两株菌未出现相互拮抗 作用。具体表现为黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021菌丝正常生 长、产孢；里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150菌丝生长迅速，培养3d后 菌丝由白色变为黄绿色，随后开始大量产孢；两株菌接触部分菌丝正常生长，并且在 此部分里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150孢子量有所增加。从牛津杯测定 结果来看，牛津杯内黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021发酵液对 其周围里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150无抑制作用，且里氏木霉 （Trichoderma reesei）ACCC 30150产孢量有所增加。总之，通过比较分析混合培养 和发酵液测定两株菌的生长情况，确定了两株菌不管是菌体本身还是发酵液与菌株之 间均无拮抗作用，说明两株生防菌具有较好的亲和性，可以进行组合。

2.2 里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150和黄赭色链霉菌（Streptomyces  silaceus）ACCC 40021对烟草病原菌的抑菌活性

为了进一步确定两株菌抑菌效果，采用平板对峙培养和牛津杯法测定两株菌对3 种烟草病原菌的拮抗作用，结果见表1。结果表明，两株菌在对峙培养时均能不同程 度地抑制3种烟草病菌菌丝生长，里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150对土 传黑胫病菌抑菌活性较强，黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021则 对土传猝倒病菌抑菌活性较强，两株菌对叶部烟草赤星病菌抑菌活性相当。牛津杯法 测定发现，黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021发酵液抑菌活性总 体大于里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150，两株菌发酵液对3种病原菌的 抑菌活性变化规律与对峙培养时抑菌活性表现基本相同。说明两菌株本身及其代谢产 物对土壤和叶部不同生境下的病原菌均具有较强的抑菌活性和较广的抑菌谱。

表1里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150和黄赭色链霉菌（Streptomyces  silaceus）ACCC 40021对烟草病原菌的抑菌活性

注：表中数据是平均值±标准误。

2.3 生防菌对出苗率及生育进程的影响

试验于播种后开始观察记录出苗率和烟苗进入各生育期的时间，结果见表2。结 果表明，不同生防菌处理与对照相比出苗率和生育进程差异较大。从表2可知，出苗 率表现为接种里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150显著降低了出苗率，其他 生防菌处理出苗率均显著增加，单接黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021出苗率又显著高于混合接种。对烟苗生育进程而言，与对照相比，混合接种和 单接黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021的出苗期均比对照提前1d， 单接里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150出苗期推迟2d；混合接种和单接 黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021的烟苗前期生长速度较快，前 期生育期时间缩短，随着烟苗生长的延续，生育期时间的差异逐渐增大，成苗时间最 大缩短了6d，而单接里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150由于影响出苗期， 其他生长阶段与对照相比均有所推迟，最后成苗时间推迟了2d。由此可知，生防菌 接种育苗基质后主要通过抑制或促进种子萌发影响烟苗出苗率和出苗期，出苗期的提 前或滞后又进一步影响烟苗整个生育进程。

表2 出苗率及烟苗生育进程的影响

处理 出苗率（%） 播种期/月-日 出苗期/月-日 十字期/月-日 生根期/月-日 成苗期/月-日 CK 94.4±0.4c 02-20 02-27 03-08 03-26 04-24 T0 94.3±0.5c 02-20 02-27 03-08 03-26 04-28 T1 93.3±0.4d 02-20 02-29 03-10 03-28 04-26 T2 96.4±0.4a 02-20 02-26 03-05 03-23 04-20 T3 95.4±0.4b 02-20 02-26 03-05 03-22 04-18

注：表中数据是平均值±标准误，同列数值不同字母表示差异性达5%显著水平。 下同。

2.4 生防菌对烟苗植物学性状和生物量的影响

2.4.1 烟苗地上部植物学性状

为了明确接种生防菌对烟苗地上部生长的影响，于成苗时测定烟苗的茎高、茎围、 叶长和叶片数等植物学性状，结果见表3。结果表明，单接黄赭色链霉菌（Streptomyces  silaceus）ACCC 40021和混合接种对烟苗茎部、叶部生长和叶片发育均有促进作用， 但前者效果不如后者，而接种里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150与对照相 比无明显的促进作用。从表3可知，与对照相比，混合接种的茎高和茎围分别提高16.0% 和17.0%，叶长、叶宽和叶片数分别提高28.0%、15.0%和19.0%，且均存在显著差异； 单接黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021各项生长指标均显著高于 对照，单接里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150与对照无显著差异。从茎部 和叶部增加的比例来看，单接黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021 和混合接种烟苗横向和纵向生长平衡性好，有利于烟苗移栽后茎基部萌发形成大量不 定根系，加快烟苗的分化与发育速度。由此可知，单接黄赭色链霉菌（Streptomyces  silaceus）ACCC 40021和混合接种有利于烟苗茎部和叶部素质的提高和培育壮苗。

表3 烟苗地上部植物学性状

处理 茎高（cm） 茎围（cm） 叶长（cm） 叶宽（cm） 叶片数

            CK 10.4±0.3b 1.86±0.08cd 9.7±0.3c 5.3±0.1c 7.5±0.2b T0 9.5±0.4c 1.75±0.04d 8.9±0.4d 5.2±0.2c 6.8±0.3c T1 10.6±0.4b 1.90±0.02bc 9.9±0.4c 5.5±0.2bc 7.7±0.3b T2 11.5±0.6a 1.99±0.08b 10.8±0.5b 5.7±0.1b 8.5±0.5a T3 12.1±0.5a 2.17±0.11a 12.4±0.4a 6.1±0.3a 8.9±0.4a

2.4.2 烟苗地下部植物学性状

培育健壮烟苗是烟草生产的首要环节，而发达的根系是壮苗的标准之一。烟苗成 苗时，测量各处理烟苗的根系形态学参数，结果见表4、表5。结果表明，生防菌组合 接种能够促进烟苗的根系生长，增加总表面积和体积和促进根系横向增粗和纵向伸长， 单独接种促生效果不如混合接种。从表4可知，就烟苗根系体积和总表面积而言，与 对照相比，单接黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021和混合接种均 显著增加，而单接里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150与对照无显著差异； 单接里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150、单接黄赭色链霉菌（Streptomyces  silaceus）ACCC 40021和混合接种的总根长分别提高了20.0%、74.0%和161.0%，显 著高于对照；从根系平均直径来看，接种生防菌的处理均显著高于对照。可见，生防 菌组合对烟苗的促生作用主要是通过增加根系长度和根系直径来实现的，这也提高了 烟苗的总吸收面积和根系活跃吸收面积，优化了根系的表面特性，促进了烟苗地下部 的生长发育和形态建成，将缩短移栽后的还苗期。

表4 烟苗地下部植物学性状

处理 根系表面积（cm²） 根系体积（cm³） 总根长（cm） 根系平均直径（mm） CK 85.2±2.1c 0.5±0.02c 561.7±23.8d 0.31±0.02cd T0 49.8±1.8d 0.3±0.02d 460.1±20.5e 0.29±0.01d T1 91.3±3.3c 0.4±0.02cd 675.3±29.0c 0.34±0.01c T2 140.5±3.4b 1.7±0.08b 975.8±40.3b 0.42±0.02b T3 176.4±5.3a 1.9±0.13a 1465.9±70.2a 0.51±0.02a

不同直径范围的根系，其吸收能力存在差别，一般认为细根的吸收能力强于粗根。 本研究将不同直径范围根系的长度进行了分析见表5。结果表明，生防菌组合能显著 增加中等根和细根的长度及其在总跟长中的比例；在促进侧根（细根和中等根）发育 的情况下，还能进一步促进根系的横向生长，从而增加粗根的长度。就直径≤0.2mm 的细根长度而言，与对照相比，接种生防菌在直径≤0.2mm的细根长度均显著增加， 此部分根系长度占总根长比例最高；从直径0.2～0.6mm范围内中等根长度来看，单 接黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021和混合接种显著增加了中等 根长度在总根长中所占比例，单接里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150与对 照无显著差异；混合接种直径﹥0.6mm范围内中等根长度显著增加，但效果不如单接 黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021，而里氏木霉（Trichoderma  reesei）ACCC 30150抑制了粗根的生长。可见，混合接种对增加细根和中等根长度明 显，有利于增大中等根的分配比例，这将增强根部对养分的吸收和运输能力，有利于 协调地下部与地上部的生长。

表5 不同直径范围内根系长度分布

2.4.3 烟苗生物量及根冠比

烟苗的生物量和根冠比是衡量壮苗的重要指标，为了更全面的评估生防菌的促生 效果，于成苗时测定了烟苗地下部和地上部烟苗鲜重和干重，计算了根冠比和干鲜比， 结果见表6。就鲜重而言，混合接种比对照显著增加了地上部鲜重，其余单接生防菌 处理烟苗地上部鲜重差异不明显，接种生防菌根系鲜重与对照均存在显著差异。在干 物质积累量方面，单接黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021和混合 接种地上部干重显著增加，而单接里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150与对 照无显著差异，但接种生防菌地下部根系干物质量均显著高于对照。就根冠比和干鲜 比来看，接种生防菌干鲜比和根冠比均高于对照，且根冠比均大于0.2，符合烟草壮 苗的标准。

表6 烟苗生物量及根冠比

处理 茎叶鲜重（g） 根系鲜重（g） 茎叶干重（g） 根系干重（g） 干鲜比 根冠比 CK 3.46±0.12b 0.795±0.032b 0.42±0.01b 0.076±0.003d 0.116 0.181 T0 3.14±0.18c 0.571±0.044c 0.38±0.02c 0.054±0.004e 0.116 0.143 T1 3.47±0.08b 0.917±0.044a 0.43±0.02b 0.088±0.004c 0.118 0.205 T2 3.55±0.12b 0.974±0.040a 0.48±0.03a 0.095±0.004b 0.127 0.201 T3 3.98±0.18a 0.924±0.042a 0.51±0.02a 0.103±0.005a 0.124 0.205

2.5 生防菌对烟苗抗病性的影响

2.5.1 烟苗防御酶活性

防御酶活性是表征植株抗病性强弱的主要参数，能够反映生防菌诱导烟苗抗性的 能力。于成苗时测定了各处理的防御酶活性，结果见图2。结果表明，生防菌组合处 理烟苗后防御酶(SOD,POD,CAT和PAL)活性均显著增加。SOD酶活性除单接放线菌 与发病对照无显著差异外，其余处理均存在显著差异，混合接种比发病对照提高70%； 混合接种比发病对照的POD、CAT和PAL活性分别提高40%、92%和104.0%，均存在显 著差异；混合接种和单接里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150的PAL和CAT 两种酶活性无显著差异，而SOD和POD两种酶活性存在显著差异，但四种酶活性均显 著高于单接黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021的处理。可见，生 防菌组合能够诱导烟苗的信号系统，启动植株体内防御酶系的表达，反映了生防菌在 增强烟苗抗病性的潜力，但不同生防菌处理相同酶表达量存在差异。

2.5.2 黑胫病防治效果

接种生防菌后每天观察记录烟苗病害发生情况，结果见表7。结果表明，接种生 防菌显著降低了烟草黑胫病发病率和病情指数，提高了防治效果，生防菌组合较单个 菌的防效均有显著的提高，单接里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150防效显 著高于单接放线菌。从表6可知，各处理中混合接种的防效最好，为69.3%，单接里 氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150优于单接黄赭色链霉菌（Streptomyces  silaceus）ACCC 40021防效，且存在显著差异。黑胫病发病率和病情指数计算结果显 示，生防菌组合的发病率和病情指数分别比发病对照降低了50.7%和52.7%，且均存在 显著差异。通过比较单接生防菌防效发现，单接里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150防效好于单接黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021，这可能是 生防菌不同生防机制的菌株作用于相同的病原菌发挥生防作用强弱不同。可见，里氏 木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150与黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus） ACCC 40021对防治烟草黑胫病是一个增效的组合。

表7 黑胫病防治效果

处理 发病率(%) 病情指数 防治效果(%) T0 74.3±3.1a 76.1±2.5a ----- T1 32.7±4.9c 34.3±5.9c 54.9±8.6b T2 45.0±5.3b 49.0±6.4b 35.8±7.5c T3 23.6±2.4d 23.4±2.9d 69.3±3.8a

国内外对生防菌组合的研究主要集中在真菌与真菌、真菌和细菌、细菌与酵母等 方面的复配研究，大多数的研究表明生防菌复配后提高了生物防治的效果，然而，也 有不少报导指出混配制剂并未导致生物防治效果的提高。其中，菌株间的不亲和性是 复配不成功的重要原因(Saldajeno M G B,Chandanie W A,Kubota M,Hyakumachi  M.Effects of interactions of arbuscularmycorrhizal fungi and beneficial  saprophytic mycoflora on plant growth and disease protection.Mycorrhizae: Sustainable Agriculture and Forestry,2008,pp.211-226)。本研究针对研究较 少的真菌与放线菌复配，利用混合培养和牛津杯法，测定了两株生防菌之间的相互作 用，确定了两者是一个亲和性组合。亲和性是生防菌复配的前提，复配后能不能发挥 协同增效作用与菌株自身的抑菌能力、抑菌机制和抑菌谱范围联系密切。本研究以来 自土壤和植物叶部两种不同生境下不同传播途径的多种病原菌为标靶，分析了两菌株 本身及其代谢产物的抑菌活性和抑菌谱。结果表明，黄赭色链霉菌（Streptomyces  silaceus）ACCC 40021发酵液对烟草猝倒病菌抑菌作用较强，而里氏木霉（Trichoderma  reesei）ACCC 30150菌丝对烟草黑胫病菌的抑菌作用尤为突出，推测可能与黄赭色链 霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021产抗生素和里氏木霉具有多种拮抗作用 机制有关。虽然这些存在不同作用机制且具有亲和性的生防菌组合能拓宽抑菌谱，但 这并不意味着组合的结果一定是增效。在田间环境下多菌协同防病更不是简单的加性 效应(Huang B(黄兵),Liu N(刘宁),Ying H(黄英),et al.Coculture of  actinomycetes with Bacillus subtilis and its effecton the bioactive secondary  metabolites.Chinese Journal of Biotechnology(生物工程学报),2009,25(6): 932-940(in Chinese))，生防菌复配时还必须考虑作物的生境、防治的对象和传播途 径等多方面因素，才能实现生防菌组合增效的目的。

本研究发现接种黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021对烟苗纵 向（茎高、叶长、根长）和横向（茎围、叶宽、根平均直径）方面具有促生和协调物 质分配作用，尤其是烟苗根系和茎平均直径的增加可保证其营养物质和水分运输，从 而协调地下部和地上部生长。

黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021和里氏木霉（Trichoderma  reesei）ACCC 30150混合培养时无相互拮抗作用，表现出较高的亲和性；平板对峙和 牛津杯法测定结果表明两菌株对不同生境下和传播途径的烟草黑胫病、猝倒病和赤星 病菌具有明显的皿内拮抗作用，其产生的发酵滤液均能够不同程度地抑制病原菌的菌 丝生长。两株生防菌单接与混接时均能不同程度地促进烟苗地上地下部分生长，显著 提高其SOD，POD，CAT等防御酶活性，从而增强烟苗的抗病能力，显著降低烟苗黑胫 病的发病率和病情指数；混合接种烟苗各项生长指标和防御酶活性较单独接种均有所 提高，而单接放线菌各项生长指标又要优于单接木霉，但单接木霉防御酶活性较单接 防线菌的处理均有显著提高。说明黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021 和里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150不仅能提高烟苗防御酶活性，而且还 能促进烟苗的生长发育，复配后是一个增效的组合，更有利于发挥互补优势与协同作 用，防病促生效果优于单一生防菌。

实施例2、烟草防病促生菌剂及微生物有机肥的制备

1、发酵里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150

产孢子培养基：KH₂PO₄2.0g/L、NH₄NO₃ 1.0g/L、FeSO₄.7H₂O 0.005g/L、MnSO₄0.0016g/L、CaCl₂ 0.3g/L、NaCl 1.0g/L、MgSO₄.7H₂O 0.3g/L、玉米秸秆粉（过40mm 筛）10g/L。PH 6.0。115℃条件下灭菌20分钟。

将里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150接种于放有PDA培养基的平皿中， 培养5天后，用灭菌的0.5cm打孔器打取10个培养后的菌饼，转接到内有100ml培养 液的250ml的三角瓶（装有PDA液体培养基）中，放入摇床中30℃培养3天。然后按 照10％（体积百分含量）的接种量接种到上述产孢子培养基中，30℃摇床培养（摇床 转速250转/分）至里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150的发酵液中孢子的 含量为4.5×10⁸cfu/ml，收集里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150的发酵液。

PDA培养基：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，pH值 7.0-7.2。

液体PDA培养基是将PDA培养基中的琼脂去除得到的液体培养基。

2、发酵黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021

产孢子培养基：KH₂PO₄2.0g/L、NH₄NO₃ 1.0g/L、FeSO₄.7H₂O 0.005g/L、MnSO₄0.0016g/L、CaCl₂ 0.3g/L、NaCl 1.0g/L、MgSO₄.7H₂O 0.3g/L、玉米秸秆粉（过40mm 筛）10g/L。PH 6.0。121℃条件下灭菌20分钟。

将黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021接种于装有高氏一号培 养基的平皿中，培养5天后，用灭菌的0.5cm打孔器打取10个培养后的菌饼，转接到 内有100ml培养液（液体高氏一号培养基）的250ml的三角瓶中，放入摇床中30℃培 养3天。然后按照10％（体积百分含量）的接种量接种到上述产孢子培养基中，30℃ 摇床培养（摇床转速250转/分）至黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021 的发酵液中孢子的含量为4.5×10⁸cfu/ml，收集黄赭色链霉菌（Streptomyces  silaceus）ACCC 40021的发酵液。

其中，高氏一号培养基：K₂HPO₄ 0.5g，NaCl 0.5g，KNO₃ 1.0g，FeSO₄·7H₂O 0.01g,MgSO₄·7H₂O 0.5g，可溶性淀粉20g，琼脂20g，水1000ml；pH 7.2-7.4。121℃ 湿热灭菌30分钟。

液体高氏一号培养基是将高氏一号培养基中的琼脂去除得到的液体培养基。

3、烟草防病促生菌剂及微生物有机肥的制备

在相同条件下制备下述1）-3）的烟草防病促生的固体微生物有机肥。其中，所 用的吸附基质均为将腐熟鸡粪、食用菌渣和糖厂甘蔗渣按照2：4：4的质量比混合， 制成100目的粉料，121℃高温灭菌4小时后冷却，得到用于制备烟草防病促生固体微 生物有机肥的吸附基质，其含水量小于等于10%。

将步骤1的里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150的发酵液用硅藻土吸附 干燥得到里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150固体菌剂。将步骤2的黄赭色 链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021的发酵液用硅藻土吸附干燥得到黄赭 色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021固体菌剂。

1）含有活性成分由里氏木霉（Trichoderma reesei）和黄赭色链霉菌 （Streptomyces silaceus）组成的菌剂的烟草防病促生固体微生物有机肥A的制备

将上述用于制备烟草防病促生的固体微生物有机肥的吸附基质和上述里氏木霉 （Trichoderma reesei）ACCC 30150固体菌剂以及上述黄赭色链霉菌（Streptomyces  silaceus）ACCC 40021固体菌剂均匀混合,使含水量小于等于10%，并使里氏木霉 （Trichoderma reesei）ACCC 30150的孢子含量为1.0×10⁷cfu/g，黄赭色链霉菌 （Streptomyces silaceus）ACCC 40021的孢子含量为1.0×10⁷cfu/g，粉碎成100目， 得到烟草防病促生固体微生物有机肥A。该烟草防病促生固体微生物有机肥A中的里 氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150的孢子含量为1.0×10⁷cfu/g，黄赭色链 霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021的孢子含量为1.0×10⁷cfu/g。

2）含有活性成分为黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）的菌剂的烟草防病 促生固体微生物有机肥B的制备

将上述用于制备烟草防病促生的固体微生物有机肥的吸附基质和上述黄赭色链霉 菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021固体菌剂混合，使含水量小于等于10%，并 使黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021的孢子含量为2.0×10⁷cfu/g， 粉碎成100目，得到烟草防病促生固体微生物有机肥B。该烟草防病促生固体微生物 有机肥B中的黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021的孢子含量为2.0 ×10⁷cfu/g。

3）含有活性成分为里氏木霉（Trichoderma reesei）的菌剂烟草防病促生的固体 微生物有机肥C的制备

将上述用于制备烟草防病促生的固体微生物有机肥的吸附基质和上述里氏木霉 （Trichoderma reesei）ACCC 30150固体菌剂混合,使含水量小于等于10%，并使得里 氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150的孢子含量为2.0×10⁷cfu/g，粉碎成100 目，得到烟草防病促生固体微生物有机肥C。该烟草防病促生固体微生物有机肥C中 的里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150的孢子含量为2.0×10⁷cfu/g。

实施例3、实施例2的烟草防病促生固体微生物有机肥促进烟草生长

1.材料与方法

1.1 试验地点

试验安排在四川省凉山州西昌市佑君镇山嘴村，选择前茬作物一致、土壤质地 疏松、地块平整、土壤肥力（表8）中等、灌排方便、交通便利等有代表性的土壤进 行布点。试验地由一户具有较好种植经验的烟农管理，同时采取测土施肥方案。

表8 土壤基础肥力情况记载表

土壤肥力 有机质 碱解氮 速效磷 速效钾 pH 中等 18.3g/kg 26.1mg/kg 50mg/kg 59mg/kg 6.95

1.2 试验品种

供试品种为当地主栽品种云烟87，由四川省公司统一供种。

1.3 试验设计

实验设四个处理，分别为CK、T1、T2和T3。

实验采用随机区组设计，设置三个重复区，每个重复区随机设置四个小区，分别 为CK处理区、T1处理区、T2处理区、T3处理区和T4处理区。每个小区的面积均为 30m²。

1.4 田间管理

除移栽前向土壤中条施有机肥的操作不同外，各处理的其它田间管理均相同。

1.4.1 整地、移栽

在移栽前25天使用旋耕机翻耕土地，移栽前10-15天完成起垄工作；移栽时行距、 株距均按照当地优质烟叶生产技术方案执行；各重复区在同一天内完成移栽，移栽时 浇足移栽水。

每个小区内分别在移栽前向土壤中条施有机肥。其中，CK处理区（对照）按照每 平方米0.15Kg的量条施实施例2步骤3的用于制备烟草防病促生固体微生物有机肥的 吸附基质；T1处理区按照每平方米0.15Kg的量条施实施例2步骤3的烟草防病促生 固体微生物有机肥C，使每平方米土壤施入3×10⁹cfu里氏木霉（Trichoderma reesei） ACCC 30150孢子；T2处理区按照每平方米0.15Kg的量条施实施例2步骤3的烟草防 病促生固体微生物有机肥B，使每平方米土壤施入3×10⁹cfu黄赭色链霉菌 （Streptomyces silaceus）ACCC 40021孢子；T3处理区按照每平方米0.15Kg的量条 施实施例2步骤3的烟草防病促生固体微生物有机肥A，使每平方米土壤施入1.5× 10⁹cfu里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150孢子和1.5×10⁹cfu黄赭色链霉 菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021孢子。

1.4.2 施肥技术

均按照当地常规施肥标准和施肥技术进行。

1.4.3 田间管理

试验育苗、整地、起垄、移栽、田间管理、采收烘烤等环节均严格按照当地烤烟 生产技术规范所规定的烟叶成熟采收、科学烘烤（三段五步式烘烤工艺）严格操作； 按照当地规范化生产的要求进行，各项农事操作及时一致，同一管理措施在同一天内 完成。

表9 中耕除草情况表

时间 田间操作 5月24日 第一次追施硝酸钾 6月4日 第二次追施硝酸钾 6月10日 第三次追施硝酸钾 7月10日 揭膜培土，结合中耕 7月11日 打顶抹杈 7月14日 中耕除草 7月20日 第二次抹杈

表10 统一防统治情况表

时间 药剂名称 防治目的 5月24日 吗呱乙酸铜 防治花叶病 5月30日 霜霉威 防治黑胫病 6月15日 吡虫啉 防治烟蚜 7月10日 粉锈宁 防治白粉病 7月20日 灭牙签 防治烟蚜

1.5 调查分析项目

1.5.1 烟叶圆顶期调查各个处理烟株的农艺性状：腰叶和顶叶的叶长和叶宽、 有效叶片数、节距、茎围等，按照烟草行业颁布的农艺性状调查方法（烟草农艺 性状调查方法，YC/T142-1998）。

1.5.2 烘烤完毕分别取各个处理的B2F、C3F、X2F三个等级的烟叶样品3kg， 用于进行化学成分分析。

1.5.3 烘烤完毕分别取各个处理的B2F、C3F、X2F三个等级的烟样2kg，用 于进行感官质量评吸，寄送烟草研究所，用于烟叶外观质量评价、物理特性测定、 化学成分和香味物质分析、评吸等。样品包装以及水分含量按国标规定执行。

1.5.4 化学成分分析内容：淀粉、总糖、还原糖、蛋白质、烟碱、总氮、总 钾等；

1.5.5 感官评吸内容：香气质、香气量、杂气、刺激性、劲头等；试验样品 的外观质量鉴定、化学成分分析、卷制原烟样品，由技术中心汇同烟草研究所集 中进行原烟感官评价。

1.5.6 统一按国家42级分级标准分级，价格按当地收购价格统计。由中国农 科院烟草研究所统计烤后未经储藏的全部原烟（包括样品）的各个等级比例、重 量、价格等。分别计算亩产量、等级指数、均价、产指、亩产值、上等烟比例、 上中等烟比例等。

2 结果与分析

2.1 不同处理对烤烟主要生育期的影响

烟草的生育期是指烟草从播种出苗到成熟收获的整个生长发育过程所需的时间, 又分为秧田（苗床）生育期和大田生育期，秧田（苗床）生育期是指从出苗到移栽的 天数。烟草整个生育期大致可以分为还苗期（从移栽到成活）、伸根期（从成活到团棵 期）、旺长期（从团棵期到现蕾期）和成熟期（从现蕾期到烟叶采收结束）4个密切联 系的生长发育时期。现蕾期为出现花蕾的日期。成熟期进行及时打顶抹杈，把握成熟 度，适时采收，打顶期为打掉顶部的日期，圆顶期为打顶后15天的日期，始烤期为第 一次采收叶片烘烤的日期，终烤期为最后采收叶片烘烤的日期。

表11 不同处理的生育时期记载表

从表11可以看出，T2、T3到达旺长期的时间最早，比CK早11天，比T1早10 天。

2.2 不同处理对烤烟圆顶期期主要农艺性状的影响

表12 不同处理圆顶期农艺性状记载表

从表12可以看出，T3和T2的腰叶和顶叶叶面积均显著高于CK；T3的腰叶叶 长是CK的1.11倍，T3的腰叶叶宽是CK的1.18倍；T2的腰叶叶长是CK的1.07 倍，T2的腰叶叶宽是CK的1.14倍。T3的顶叶叶长是CK的1.30倍，T3的顶叶叶 宽是CK的1.33倍；T2的顶叶叶长是CK的1.30倍，T2的顶叶叶宽是CK的1.26 倍。除T1外，其余各处理的叶片均在20片以上。

2.3 不同处理对烤烟产量产值的影响

表13 不同处理对烟叶产量产值的影响统计表

表13的结果表明，其中T3的烟叶产量最高，是CK的1.23倍；其中T2的产 量次之，是CK的1.19倍；烟叶的产值最高的是T3，是CK的1.22倍，其次是T2， 其产值是CK的1.22倍。

2.4 不同处理对烤烟对烟叶化学成分的影响

表14 不同处理对烟叶主要化学成分含量的影响

表14的结果表明，T3处理的总糖、还原糖含量最高，促进钾离子的吸收和积 累，糖碱比、钾氯比等派生值更加协调，均在优质烟叶的适宜范围内。

2.5 不同处理对烤烟对烟叶中部叶评吸质量的影响

表15 不同处理对中部叶烟叶评吸质量的影响

对试验样品进行了感官评价。表15结果表明：T3施用对烟叶评吸质量有较大 的影响，以T3的处理表现出质感清晰，香气量，浓度较高，杂刺小。

2.6 不同处理对烤烟对烟叶中部外观质量的影响

表16 不同处理对烟叶外观质量的影响

处理 部位 颜色 成熟度 叶片结构 身份 油份 色度 CK 中 桔黄 成熟 疏松 适中 多- 浓- T1 中 桔黄 成熟 疏松 适中 多- 浓- T2 中 桔黄 成熟 疏松 适中 多- 强+ T3 中 桔黄 成熟 疏松 适中 多- 强+

从烤后烟叶外观质量表现来看：各试验处理外观颜色均为桔黄色，烤后成熟 度表现成熟，叶片组织组织结构、身份和油份无差异；T2、T3的烟叶色度也表现 出较好，总体评价最好（表16）。

实施例4、实施例2的烟草防病促生固体微生物有机肥防治烟草黑胫病和赤星病

1.材料与方法

1.1 试验地点

试验安排在四川省泸州古蔺县。选择前茬作物一致、土壤质地疏松、地块平整、 土壤肥力（表17）中等、灌排方便、交通便利等有代表性的土壤进行布点。试验地由 一户具有较好种植经验的烟农管理，同时采取测土施肥方案。

表17 土壤基础肥力情况记载表

土壤肥力 有机质 碱解氮 速效磷 速效钾 pH 中等 18.3g/kg 68.1mg/kg 24mg/kg 78mg/kg 7.2

1.2 试验品种

供试品种为当地主栽品种云烟87，由四川省公司统一供种。

1.3 试验设计

实验设四个处理，分别为CK、T1、T2和T3。

实验采用随机区组设计，设置三个重复区，每个重复区随机设置四个小区，分别 为CK处理区、T1处理区、T2处理区、T3处理区和T4处理区。每个小区的面积均为 30m²。

1.4 田间管理

除移栽前向土壤中条施有机肥的操作不同外，各处理的其它田间管理均相同。

1.4.1 整地、移栽

在移栽前25天使用旋耕机翻耕土地，移栽前10-15天完成起垄工作；移栽时行距、 株距均按照当地优质烟叶生产技术方案执行；各重复区在同一天内完成移栽，移栽时 浇足移栽水。

每个小区内分别在移栽前向土壤中条施有机肥。其中，CK处理区（对照）按照每 平方米0.15Kg的量条施实施例2步骤3的用于制备烟草防病促生固体微生物有机肥的 吸附基质；T1处理区按照每平方米0.15Kg的量条施实施例2步骤3的烟草防病促生 固体微生物有机肥C，使每平方米土壤施入3×10⁹cfu里氏木霉（Trichoderma reesei） ACCC 30150孢子；T2处理区按照每平方米0.15Kg的量条施实施例2步骤3的烟草防 病促生固体微生物有机肥B，使每平方米土壤施入3×10⁹cfu黄赭色链霉菌 （Streptomyces silaceus）ACCC 40021孢子；T3处理区按照每平方米0.15Kg的量条 施实施例2步骤3的烟草防病促生固体微生物有机肥A，使每平方米土壤施入1.5× 10⁹cfu里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150孢子和1.5×10⁹cfu黄赭色链霉 菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021孢子。

1.4.2 施肥技术

均按照当地常规施肥标准和施肥技术进行。

1.4.3 田间管理

试验育苗、整地、起垄、移栽、田间管理、采收烘烤等环节均严格按照当地烤烟生产 技术规范所规定的烟叶成熟采收、科学烘烤（三段五步式烘烤工艺）严格操作；按照 当地规范化生产的要求进行，各项农事操作及时一致，同一管理措施在同一天内完成。

表18 中耕除草情况表

时间 田间操作 5月4日 烟苗移栽 5月11日 追施硝酸钾 6月15日 揭膜培土，结合中耕 7月15日 打顶 7月28日 采烤

表19 统一防统治情况

时间 药剂名称 防治目的 6月15日 插牙签 蚜虫 7月5日 菌克毒克800倍喷雾 普通花叶病 7月10日 新万生 气候性斑点病

1.5 病害调查

在打顶期调查黑胫病和赤星病发病情况，计算发病率、病情指数和防治效果。

烟草黑胫病以整株为单位进行普查，病害分级标准如下：

0级：无病。

1级：茎部病斑不超过茎围的1/2，或（和）半数以下叶片或顶叶轻度凋萎，可下 部少数叶片出现病斑。

2级：茎部病斑超过茎围的1/2，或（和）半数以上叶片或部分腰叶以上叶凋萎。

3级：茎部病斑环绕茎围，或（和）2/3以上叶片或下二棚以上叶片凋萎。

4级：病株死亡。

烟草黑胫病病情指数＝〔∑（病级数×该级病株数）/（调查总株数×4）〕×100；

烟草黑胫病防治效果（％）＝〔（对照病情指数－处理病情指数）/对照病情指数〕 ×100%；

烟草黑胫病发病率=发病株数/调查总株数×100%。

烟草赤星病以叶片为单位进行普查，病害分级标准如下：

O级：全叶无病；

0.5级：病斑面积占叶片面积的1％以下；

1级：病斑面积占叶片面积的l-5％（不包括1%）；

2级：病斑面积占叶片面积的5.0-10％（不包括5%）；

3级：病斑面积占叶片面积的10.0-20％（不包括10%）；

4级：病斑面积占叶片面积的20％以上（不包括20%）。

烟草赤星病病情指数＝〔∑（病级数×该级病叶数）/（调查总叶数×4）〕×100；

烟草赤星病防治效果（％）＝〔（对照病情指数－处理病情指数）/对照病情指数〕 ×100%；

烟草赤星病发病率=发病叶数/调查总叶数×100%。

根据田间调查的主要病害发生情况，各处理中主要有黑胫病和赤星病发生， T2和T3对黑胫病和赤星病的防治效果均较好，T2和T3对黑胫病的防治效果分别为 73.0%和63.5%，T2和T3对赤星病的防治效果分别为66.7%和86.7%（表20），说明实 施例1步骤3的烟草防病促生固体微生物有机肥A和实施例1步骤3的烟草防病促生 固体微生物有机肥B对烟草黑胫病和烟草赤星病均有较好的防治效果。

表20 不同处理对黑胫病和赤星病的防治效果

实施例5、实施例2的烟草防病促生固体微生物有机肥防治烟草青枯病

1.材料与方法

1.1 试验地点

试验安排在四川省凉山州冕宁县回龙乡石古村。选择前茬作物一致、土壤质地疏 松、地块平整、土壤肥力（表14）中等、灌排方便、交通便利等有代表性的土壤进行 布点。试验地由一户具有较好种植经验的烟农管理，同时采取测土施肥方案。

表21 土壤基础肥力情况记载表

土壤肥力 有机质 碱解氮 速效磷 速效钾 pH 中等 14.8g/kg 67mg/kg 56mg/kg 104mg/kg 6.85

1.2 试验品种

供试品种为当地主栽品种云烟87，由四川省公司统一供种。

1.3 试验设计

实验设四个处理，分别为CK、T1、T2和T3。

实验采用随机区组设计，设置三个重复区，每个重复区随机设置四个小区，分别 为CK处理区、T1处理区、T2处理区、T3处理区和T4处理区。每个小区的面积均为 30m²。

1.4 田间管理

除移栽前向土壤中条施有机肥的操作不同外，各处理的其它田间管理均相同。

1.4.1 整地、移栽

在移栽前25天使用旋耕机翻耕土地，移栽前10-15天完成起垄工作；移栽时行距、 株距均按照当地优质烟叶生产技术方案执行；各重复区在同一天内完成移栽，移栽时 浇足移栽水。

每个小区内分别在移栽前向土壤中条施有机肥。其中，CK处理区（对照）按照每 平方米0.15Kg的量条施实施例2步骤3的用于制备烟草防病促生固体微生物有机肥的 吸附基质；T1处理区按照每平方米0.15Kg的量条施实施例2步骤3的烟草防病促生 固体微生物有机肥C，使每平方米土壤施入3×10⁹cfu里氏木霉（Trichoderma reesei） ACCC 30150孢子；T2处理区按照每平方米0.15Kg的量条施实施例2步骤3的烟草防 病促生固体微生物有机肥B，使每平方米土壤施入3×10⁹cfu黄赭色链霉菌 （Streptomyces silaceus）ACCC 40021孢子；T3处理区按照每平方米0.15Kg的量条 施实施例2步骤3的烟草防病促生固体微生物有机肥A，使每平方米土壤施入0.15× 10⁹cfu里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150孢子和1.5×10⁹cfu黄赭色链霉 菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021孢子。

1.4.2 施肥技术

均按照当地常规施肥标准和施肥技术进行。

1.4.3 田间管理

试验育苗、整地、起垄、移栽、田间管理、采收烘烤等环节均严格按照当地 烤烟生产技术规范所规定的烟叶成熟采收、科学烘烤（三段五步式烘烤工艺）严 格操作；按照当地规范化生产的要求进行，各项农事操作及时一致，同一管理措 施在同一天内完成。

表22 中耕除草情况表

时间 田间操作 5月4日 烟苗移栽 5月11日 追施硝酸钾 6月15日 揭膜培土，结合中耕 7月15日 打顶 7月28日 采烤

表23 统一防统治情况

时间 药剂名称 防治目的 6月15日 插牙签 蚜虫 7月5日 菌克毒克800倍喷雾 普通花叶病 7月10日 新万生 气候斑

1.5 病害调查

在打顶时期调查青枯病发病情况，计算发病率、病情指数和防治效果。

烟草青枯病以病株为单位进行普查，病害分级标准如下：

0级：全株无病。

1级：茎部偶有褪绿斑，或在有条斑一侧有少数叶片凋萎。

2级：茎部有黑色条斑，但尚未达到顶部，或病侧半数以上叶片凋萎。

3级：茎部黑色条斑到达植株顶部，或病侧三分之二以上叶片调萎。

4级：病株基本枯死。

烟草青枯病病情指数＝〔∑（病级数×该级病叶数）/（调查总叶数×4）〕× 100；

烟草青枯病防治效果（％）＝〔（对照病情指数－处理病情指数）/对照病情 指数〕×100%；

烟草青枯病发病率=发病叶数/调查总叶数×100%。

结果表明，各处理青枯病的发生情况差异较为明显，T1和CK处理较严重，发 病率分别为4.2%和5.2%，T2、T3无青枯病的发生。说明实施例1步骤3的烟草防 病促生固体微生物有机肥A和实施例1步骤3的烟草防病促生固体微生物有机肥B对 青枯病的防治效果非常显著（表24）。

表24 不同处理对青枯病的防治效果

处理 发病率 病情指数 防治效果

CK 5.2% 13.35   T1 4.2% 15.35 -15% T2 0% 0 100% T3 0% 0 100%

实施例6、里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150和黄赭色链霉菌 （Streptomyces silaceus）ACCC 40021的筛选

1、平皿拮抗筛选

在PDA平板中心接种待筛选菌株，在半径2.5cm左右的圆周上，等距离接种3点 等量不同病原菌，将每三种不同的病原菌作为一组，共有三组，每组设三个重复。用 记号笔做好标记菌株编号，以备观察记录。将接种好的培养皿放于28℃的培养箱中培 养7-10d左右。隔日对所做的实验进行拍照，测量病原菌指向待筛选菌的半径R和r。 记录待筛选菌与病原菌之间的形态特征。病菌与待筛选菌交接后，观察病原菌对待筛 选菌菌落的包围、抑制、侵入和占领其营养空间的过程。

筛选被筛选菌株，依据以下原则进行：（1）生长速度明显高于病原菌，能够与病 原菌争夺营养，从而显著抑制病原菌的生长；（2）与病原菌之间有0.2cm左右空隙， 即产生了抑菌带，说明待筛选菌在代谢过程中产生了某种抗生物质。

按照上述筛选方法从182株木霉菌株中筛选得到里氏木霉（Trichoderma reesei） ACCC 30150（简称木霉菌30150），从45株库藏链霉菌中筛选到黄赭色链霉菌 （Streptomyces silaceus）ACCC 40021（简称放线菌40021）。

表25木霉菌30150和放线菌40021与3种病原菌以及二者互作之间平皿对峙记录

菌株编号 烟草黑胫病 烟草赤星病 烟草根腐病 放线菌40021 木霉菌30150 木霉菌30150 +++ +++ +++ - / 放线菌40021 ++ ++ ++ / -

注：对病原菌和放线菌的生长抑制作用，由强到弱，分为+++、++、+、-四个等级。

2、盆栽活体筛选

2.1 材料与方法

（1）菌悬液的制备

将平皿拮抗筛选出的里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150和黄赭色链 霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021活化后分别重新接种于倒有PDA和高氏 一号培养基的平皿上，里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150培养5d左右， 黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021培养7-10d左右长出孢子。分 别用毛笔刷下孢子，各自配成浓度为10⁷cfu/ml的菌悬液。

（2）发酵液的制备

将筛选出里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150和黄赭色链霉菌 （Streptomyces silaceus）ACCC 40021分别接种于PDA和高氏一号培养基的平皿中， 培养5天后，分别用灭菌的0.5cm打孔器打取10个培养后的菌饼，各自转接到内有 100ml培养液的250ml的三角瓶中，放入摇床中30℃培养3天。

（3）促生抗病筛选

将供试里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150、黄赭色链霉菌（Streptomyces  silaceus）ACCC 40021菌悬液（分别简称30150和40021）及二者混合菌悬液（简称 30150+40021）分别按试验浓度配好，在防治烟草根茎部病害时里氏木霉（Trichoderma  reesei）ACCC 30150菌悬液、黄赭色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021 菌悬液、烟草黑胫病致病菌、根腐病致病菌的接种方式采用孢子悬浮液灌根接种，里 氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150菌悬液、黄赭色链霉菌（Streptomyces  silaceus）ACCC 40021菌悬和二者混合菌悬液灌根24h后再接种致病菌，在防治烟草 叶部病害时，里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150菌悬液、黄赭色链霉菌 （Streptomyces silaceus）ACCC 40021菌悬液、赤星病致病菌的接种方式均采用孢 子悬浮液喷雾接种法，待里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150菌悬液、黄赭 色链霉菌（Streptomyces silaceus）ACCC 40021菌悬液和二者混合菌悬液喷雾24h 后再接种致病菌，接种后28℃培养。

（4）筛选结果

促生结果:

表26 里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150和黄赭色链霉菌 （Streptomyces silaceus）ACCC 40021促生筛选

防病结果：

表27 里氏木霉（Trichoderma reesei）ACCC 30150和黄赭色链霉菌 （Streptomyces silaceus）ACCC 40021病害防治筛选

处理 烟草根腐病 烟草赤星病 烟草黑胫病 ACCC 30150 70.327% 72.814% 69.444% ACCC 40021 55.632% 58.660% 55.422%

30150+40021 71.236% 73.120% 70.145% 75%百菌清溶液   79.897%   70%甲基托布津溶液 65.153%     50%烯酰吗啉溶液     94.452%