一种限制急性心肌缺血后微血管损伤的方法

摘要

本发明鉴定了一种新的配体-受体系统，proNGF和p75NTR/SorCS2，已发现其与心脏的微血管功能有关。本发明提供了一种基于给予该新鉴定的系统的拮抗剂限制急性心肌缺血后微血管损伤的方法，从而促进心肌的恢复。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年6月15日申请的美国临时申请号61/397,663的优先权，其全部内容 通过引用并入本申请。

关于联邦政府资助研究或开发的声明

本发明在由美国国立卫生研究院提供的政府资助下完成，基金号为PO1HL04603和R01 NS030687。美国政府对本发明享有一些权利。

发明领域

本发明涉及鉴定与心脏微血管功能相关的配体-受体系统，以及通过操控该系统预防或限 制急性心肌缺血后微血管的功能异常或损伤，从而促进心肌的恢复。

背景技术

对急性心肌缺血的治疗主要集中于限制缺血持续时间和使用血管成形术或血栓溶解以建 立再灌注。然而，即使使大血管再通，还是有很大一部分患者表现出梗死组织的微血管损 伤，其导致组织纤维化、心脏收缩力受损、并且最终导致死亡率升高（Eltzschig et al.,Brit. Med.Bulletin,70:71-86(2004)）。到目前为止，在心脏缺血后介导微血管障碍或凋亡的特定 促炎性细胞因子还是未知的，对这些局部产生的因子进行鉴定将为限制微血管障碍，以及促 进再灌注后的心肌恢复提供重要的潜在治疗靶点。

在啮齿动物心脏缺血再灌注后迅速诱导产生神经生长因子（NGF）的mRNA（Hiltunen et  al.,Journal of Pathology,194(2):247-253(2001);Hasan et al.,Brain Research,1124(1):142-154 (2006)）。神经营养因子家族的原型成员NGF还包括衍生自脑的神经营养因子（BDNF）， 和神经营养因子-3（NT-3），其与受体酪氨酸激酶TrkA结合，以介导细胞存活和分化 （Reichardt,Philos Trans R Soc Lond B Biol Science,361(1473):1545-1564(2006)）。神经营养 因子最初作为前体或神经生长因子前体而被合成，其可以被蛋白水解裂解以释放C-末端结构 域，或成熟的神经生长因子。最近的研究显示，proNGF并不是无活性前体，而是不同于其 成熟形式的用于介导神经细胞死亡的信号配体（Lee,Science,294:1945-48(2001)，以及 Hempstead的综述，Neurotoxicity Research,16:255-60(2009)）。ProNGF的促凋亡作用要求 表达编码细胞内死亡结构域的特定受体p75NTR和共受体分拣蛋白（Nykjaer et al.,Nature, 427(6977):843-848(2004);Jansen et al.,Nat Neuroscience,10(11):1449-1457(2007)）。

在心血管系统中，已建立相关神经营养因子BDNF和NT-3在促进血管完整性和调节心 脏隔膜方面的功能（Donovan et al.,Nat Genet,14(2):210-213(1996);Donovan et al.,American  Journal of Pathology,147(2):09-324(1995);以及Caporali et al.的综述,Physiol Review, 89(1):279-308(2009)）。但是，尚未很好地鉴定出心脏NGF的作用。NGF由心肌细胞和心脏 血管平滑肌细胞合成，其促进交感神经的支配作用（Glenbova and Ginty,J.Neurosci24:743 (2004)）。此外，衍生自肌细胞的NGF能够部分地通过改变神经元的放电性质（Luther et al., Journal of Neurophysiology,96(2):946-958(2006)）而敏锐地调节交感神经元和心脏肌细胞之 间的突触传递（Lockhart et al.,Journal of Neuroscience,17(24):9573-9582(1997)）。确实， NGF缺陷型（NGF^-/-）小鼠在围产期的死亡是由于假定的神经分布缺陷造成的，而非明显的 心血管系统畸形（见Caporali et al.的综述，Physiol Review,89(1):279-308(2009)）。

在大多数成年组织中，ProNGF和p75NTR的表达量低至不可检测水平，但在急性损伤和 凋亡启动后被迅速诱导，其在中枢和周围神经系统中的研究最好（见Hempstead的综述， Neurotox Research,16(3):255-260(2009)）。尽管还没有研究对心脏缺血后proNGF的水平进 行评估，但是在心脏缺血/再灌注后数小时内，NGF mRNA的水平升高，且升高的蛋白水平 在回落至基线值前维持数天（Hiltunen et al.,Journal of Pathology,194(2):247-253(2001)）。 此外，急性主动脉损伤后，内皮细胞和血管平滑肌细胞中p75NTR的局部表达增加 （Donovan et al.,American Journal of Pathology,147(2):09-324(1995)），并且p75NTR活化 促进血管平滑肌细胞凋亡（Wang et al.,Am J Pathology157:1247-58,2000）和内皮细胞凋亡 （Kim et al.,Journal of Biological Chemistry,279(32):33538-33546(2004)）。p75NTR缺陷型导 致颈主动脉损伤后的血管平滑肌细胞凋亡减少，提示局部产生的神经营养因子在调控该血管 应答方面具有一定作用（Kraemer,Circ Res,91(6):494-500(2002)）。到目前为止，还没有研 究对脉管系统中的分拣蛋白，或分拣蛋白家族的其他成员包括SorCS1、SorCS2、SorCS3进 行考察。

在血管发育过程中，内皮细胞与周细胞形成复合物和相互作用，以及在成熟血管中周细 胞维持微血管的结构和功能（见Gaengel et al.的综述，Arterioscler Thromb Vasc Biol,29:630- 638(2008)）。破坏内皮细胞与周细胞之间的联系会导致血管出血和胚胎死亡，最好的例子 是Pdgfb或Pdgfrb缺陷型小鼠，其无法将周细胞募集至特定的血管床（Lindahl et al.,Science, 277(5323):242-245(1997);Hellstrom et al.,Development126:3047-55(1999)）。在成年小鼠 中，TGFβ和骨形态蛋白在维持周细胞存活和促进微血管完整性方面起重要作用，在平滑肌 细胞中Bmp1a的遗传缺陷导致在缺氧条件下的心脏机能障碍，以及TGFβ阻断导致血管通透 性异常（El-Bizri et al.,Circ Res102(3):380-388(2008);Walshe et al.,PLoS One4(4):1-16 (2009)）。总之，在心脏微血管成熟过程中，内皮细胞：周细胞联系的失调将在随后生命过 程中导致心脏机能障碍。

发明概述

本发明鉴定了一种新的配体-受体系统，proNGF和p75NTR/SorCS2，其与心脏的微血管 功能相关。相应地，本发明提供了一种基于给予该新鉴定的系统的拮抗剂限制急性心肌缺血 后微血管损伤的方法，从而促进心肌的恢复。

本发明的一个方面涉及一种在对象急性心肌缺血后通过给予proNGF拮抗剂以限制微血 管损伤的方法。proNGF拮抗剂可以包括与proNGF特异性结合的中和抗体、适体、寡肽、小 分子化合物、或例如降低proNGF mRNA水平或活性的核酸分子。

本发明的另一个方面涉及一种在急性心肌缺血后通过给予SorCS2拮抗剂以降低微血管障 碍及其相关损伤的方法。SorCS2拮抗剂可以包括抗体、适体、寡肽、小分子化合物、或降低 SorCS2mRNA水平或活性的核酸分子。

在急性心肌缺血（AMI）发生后可以尽快给予对象拮抗剂或拮抗剂混合物。在某些实施 方式中，拮抗剂或拮抗剂混合物在48小时内给予对象。在特定实施方式中，在AMI2-6小 时内给药。

拮抗剂或拮抗剂混合物可以与用于给药的药学上可接受的载体组合，并且可以通过标准 途径给予对象，所述标准途径包括摄食、通过静脉、腹腔、皮下注射、透皮、肌内、鼻内、 或舌下途径，或在经皮介入时、或在开心手术过程中通过导管递送。

附图简述

图1。带有非-弗林蛋白酶突变Ngf-HA等位基因的Ngf靶基因示意图。插图，Southern印 记。

图2。在缺血-再灌注损伤后，proNGF及其受体p75NTR的表达上调。（a）来自未梗死 的LV（左图）和缺血-再灌注wtNGF-HA/+小鼠梗死周围区域（右图）的H&E染色切片。值 得注意的是，与对照切片相比，损伤心肌中的浸润细胞数量增加。（b）抗-HA免疫组化显 示，在心肌细胞和浸润细胞中，NGF-HA的反应性增加（插图）。（c）ProNGF-特异性抗体 的使用确证了HA抗体的结果，并且进一步显示，在损伤的心肌和浸润细胞（箭头所示）中 增加的NGF种类为proNGF，而非成熟的NGF。（d）分拣蛋白在小动脉平滑肌细胞中表 达，其在I/R后不会上调。（e）p75NTR和TH双免疫荧光显示，与在对照未损伤切片中的 正常组织相比，在I/R损伤心脏中交感神经营养不良。（f）p75NTR在I/R-损伤心脏的梗死 周围区域的PDGFRβ+周细胞中表达，但是其不在未损伤心肌的周细胞中表达。（g）SorCS2 在小动脉平滑肌细胞中表达。（h）SorCS2在梗死周围区域的PDGFRβ+周细胞子集中表 达。比例尺：（a）和（b），100μm；（c）40μm；（d）-（g），20μm。

图3。（a）来自293T细胞的IP-WB显示，proNGF与分拣蛋白和SorCS2之间发生了相 互作用。值得注意的是，proNGF与分拣蛋白和SorCS2免疫共沉淀。（b）proNGF或NGF 表达的免疫共沉淀-Westerm印记分析。左图，P0NGF+/+和proNGF-HA/+心脏的裂解物（每 条泳道为三个心脏的混合物）显示，在proNGF-HA/+而非NGF+/+心脏中存在proNGF-HA （~32kD）而非成熟NGF（~13kD）。右图，成体脑裂解物显示，在wtNGF-HA/+脑提取物 中检测到成熟NGF-HA，而非proNGF-HA，然而在proNGF-HA/+脑提取物中proNGF-HA是 丰度最高的同型物。

图4。Prongf-HA基因靶向示意图。DT，白喉毒素表达盒。黑线表示Southern印记探针 序列和预计产物的尺寸。插图，替换的Prongf-HA等位基因阳性的胚胎细胞的Southern印记 分析。

图5。更年长的proNGF-HA/+心脏表现出心肌变薄和扩张、纤维化、和组织细胞浸润。 （a-f）8mo NGF^+/+（a,d）、NGF^+/-（b,e）、和proNGF-HA/+（c,f）心脏的H&E染色切 片。（g-l）8mo NGF^+/+（g）、NGF^+/-（h）、和proNGF-HA/+（i）心脏的Masson三色染色 分析。红色，心肌。黑色，核。蓝色，胶原基质。值得注意的是，在大部分细动脉周围观察 到的蓝色胶原沉积是正常的。但是，在proNGF-HA/+心脏中，蓝色胶原广泛沉积于肌细胞组 织。6mo NGF^+/+（j）、NGF^+/-（k）、和proNGF-HA/+（l）心脏的CD68免疫荧光分析显 示，组织细胞包括单核细胞和巨噬细胞的浸润增加。比例尺，（a-c），2mm；（d-l），100 μm。

图6。4mo NGF^+/+、NGF^+/-、和proNGF-HA/+心脏的TEM成像。这一阶段的proNGF- HA/+心肌出现了很多的坏死区域，这可能是由于血管的小梗死造成的。然而，NGF^+/+和 NGF^+/-心肌组织仍表现为正常。箭头，正常内皮细胞。箭号，带有细胞膜碎片的被破坏的内 皮细胞。比例尺，2μm。

图7。NGF^+/+、proNGF-HA/+、和p75^-/-；proNGF-HA/+小鼠的超声心动图分析。（a）2 mo（左）和4mo（右）NGF^+/+（上图）、proNGF-HA/+（中图）、和p75^-/-；proNGF-HA/+ （下图）心脏的M-型痕迹举例。（b）与正常NGF^+/+（蓝色菱形）小鼠相比，在proNGF- HA/+小鼠（实心红色方块）中出现了进行性心脏机能障碍。***，P<0.005，t-检验。在p75^-/-；proNGF-HA/+小鼠中，proNGF受体p75的遗传删除挽救了心脏缺陷（空心红色方块）。 NS，与NGF^+/+小鼠相比无显著性差异。分拣蛋白删除不能挽救扩张的心肌病表型（实心绿 色三角）。#，与NGF+/+相比，种类^-/-；proNGF-HA/+P<0.05，t-检验。%FS，短轴缩短率 （见正文）。蓝色和红色实线，以及红色和绿色虚线为各表型随时间变化的线性回归曲线。 N_（NGF+/+）=18。N_{(proNGF-HA/+)}=31。N_{(p75-/-;proNGF-HA/+)}=10。N_{(sort-/-;proNGF-HA/+)}=10。（c） NGF^+/+和proNGF-HA/+小鼠随小鼠年龄变化的Kaplan-Meier存活曲线图。

图8。年轻的proNGF-HA/+心脏微血管内皮细胞表现为活化的表型。（a-c）1mo NGF^+/+（a）、NGF^+/-（b）、和proNGF-HA/+（c）心脏的H&E组织学。（d-f）1mo NGF^+/+（d）、NGF^+/-（e）、和proNGF-HA/+（f）心脏的透射电子显微镜检测结果显示，在 proNGF-HA/+心脏微血管中存在活化的内皮细胞。箭头，带有包盖了血浆或红细胞的光滑细 胞膜的正常内皮细胞。箭号，带有含多个空泡的增厚的和丝状细胞膜的活化的内皮细胞。在 proNGF-HA/+心肌膜中，发现了广泛（已检查血管的~50%）活化的微血管内皮细胞以及水肿 性区域，在此处血管没有与相邻的心肌接触（星号；与图（e）所示的切片对应）。值得注 意的是，在该时间点，所有表型心肌的外观均正常和健康。比例尺，（a-c），100μm；（d- f），2μm。

图9。在NGF+/pro小鼠心脏血管的成熟过程中出现微血管内皮细胞活化和异常的血小板 沉积。（a-c）对血小板/巨核细胞标记物CD41的检测发现，与P9心肌中的NGF^+/+（a）相 比，proNGF-HA/+（b）心脏中出现大量血小板聚集。p75^-/-；proNGF-HA/+血管并不捕获血 小板（c）。（d-f）在P9中ICAM-1上调表明在proNGF-HA/+（e）血管中内皮活化，而 NGF^+/+（d）或p75^-/-；proNGF-HA/+（f）血管中未出现这一现象。（g-i）p75-丧失（i）挽 救了proNGF-HA/+心肌（h）中的FITC-葡聚糖（70kD）蓄积和外渗，FITC-葡聚糖（70 kD）蓄积表明血管清除大分子的能力丧失，外渗表明微血管水肿和完整性丧失。（j-k） CD41和ICAM-1的免疫荧光定量。比例尺，100μm。

图10。在导致最终心脏微血管障碍的发育过程中，proNGF受体的表达。分析E17.5或 P0胚胎的p75NTR和SorCS2的免疫反应性。同工凝集素B4+内皮细胞（a）不表达 p75NTR，但是PDGFRβ+周细胞（b）亚群表达。（c）PDGFRβ-免疫阳性周细胞的小亚群表 达SorCS2。（d）仅少量E20周细胞共表达p75NTR和SorCS2。比例尺，10μm。

图11。人心脏左心室壁或心肌梗死死亡3天内个体的梗死周围区域的解剖切片。通过红 棕色反应产物检测与指示抗体的免疫反应性。该图显示，在死于心脏病发作的患者的解剖标 本中，proNGF明显上调，但死于其他原因的患者中未见这一现象。此外，小动脉周细胞和 血管平滑肌细胞中的p75上调。

图12。来自相关动物模型的proNGF原结构域：人（SEQ ID NO:1）、猕猴（SEQ ID  NO:2）、猪（SEQ ID NO:3）、犬（SEQ ID NO:4）、大鼠（SEQ ID NO:5）、和小鼠 （SEQ ID NO:6）。

图13。人神经营养因子原结构域。人proNGF、proBDNF、proNT-3和proNT4的原结构 域分别见SEQ ID NO：1、7、8和9所示。

发明详述

本发明鉴定了一种与心脏微血管功能相关的新配体-受体系统，其可以用于在急性心肌缺 血后阻止缺血心脏的微血管障碍或限制微血管损伤，从而促进心肌的恢复。

更特别地，发明人确定了在梗死的小鼠心脏中诱导proNGF配体及其受体p75NTR和分 拣蛋白家族成员SorCS2。发明人制备了敲入小鼠，其具有一个在内源性Ngf启动子的调控下 表达抗裂解形式proNGF的等位基因，以及另一个表达NGF的非靶向等位基因（称为 proNGF-HA/+小鼠）。这些小鼠是能够存活的，但其在早期成年期发展成扩张性心肌病，导 致其在6至8月龄死亡。发明人发现，在胚胎发育的晚期阶段，包围了周细胞的心脏微血管 表达p75NTR和SorCS2，但不表达分拣蛋白。发明人还发现，表达proNGF且缺乏p75NTR 的动物不会发展成心肌病，而表达proNGF且缺乏分拣蛋白的动物无法从该表型中被挽救。 此外，发明人证实在proNGF-HA/+小鼠中内皮细胞被活化，导致血管通透性增加。

无意于被任何特定理论所限制，相信在proNGF-HA/+小鼠的心脏中诱导proNGF和 p75NTR，其作用于周细胞以促进微血管内皮细胞的功能障碍，导致内皮活化和后续的心肌 病；并且与proMGF结合的SorCS2作为p75NTR的共受体以改变周细胞的功能。

依据本发明公开的内容，发明人新鉴定的配体-受体系统（proNGF-p75NTR/SorCS2）可 以用于降低、限制或阻止急性心肌缺血后的心脏微血管障碍和微血管损伤。

微血管障碍和损伤

急性心肌缺血（或AMI）通常称为心脏病发作，当心脏中一部分的血液供应中断时，发 生此病。如果一段时间未经治疗，由此产生的氧气不足可能导致心肌组织损伤或死亡（或 “梗死”）。在本发明以前，对急性心肌梗死的治疗主要集中在冠状动脉血液流动的重建。 然而，即使使大血管再通，还是有很大一部分患者表现出梗死组织的微血管损伤，其导致慢 性心脏功能损伤和残疾，以及死亡率升高（Eltzschig et al.,Brit.Med.Bulletin,70:71-86 (2004)）。然而，根据本发明公开的内容，可以通过使用proNGF-p75NTR/SorCS2系统的拮 抗剂阻止或限制微血管障碍或损伤以改善再灌注后心肌的恢复。

本申请使用的术语“微血管”指小血管，如微动脉、毛细血管和微静脉。此类小血管通 常包括两类细胞：内皮细胞和周细胞，内皮细胞形成内血管壁，周细胞形成内皮管周围的外 层（Gaengel et al.,Arterioscler Thromb Vasc Biol29:630-638,2009）。

术语“微血管障碍”指小血管的结构和/或功能异常。可以通过分析血管收缩性、血管通 透性、微血管电镜，以及分析内皮和周细胞标记物（如CD-31、同工凝集素B4、PDGFRβ和 NG2）的水平等等对微血管障碍进行评估和测定。

术语“微血管损伤”指由于微血管障碍而导致小血管的结构完整性和/或功能丧失或损 害。

proNGF-p75NTR/SorCS2配体-受体系统的拮抗剂

如本申请所公开的，给予proNGF-p75NTR/SorCS2配体-受体系统的拮抗剂可以减少或限 制、或甚至完全阻止急性心肌缺血后的微血管障碍及相关损伤。

本申请所使用的术语“拮抗剂”指抑制周细胞中proNGF-p75NTR/SorCS2配体-受体系统 中组分的表达水平的分子（“表达拮抗剂”）；或者，抑制周细胞中表达的proNGF- p75NTR/SorCS2配体-受体系统中组分之间的相互作用或结合（“结合拮抗剂”），从而降 低该配体-受体系统的量、形成、功能、和/或其下游信号。

如果某分子导致组分的表达显著降低（转录或翻译水平），则认为该分子抑制proNGF- p75NTR/SorCS2系统组分的表达水平。类似地，如果某些分子导致组分与形成的配体-受体 复合物之间的结合显著减少，其导致通过配体-受体系统介导的下游信号和功能显著减少，例 如内皮细胞活化和血管通透性增加，则认为该分子抑制proNGF-p75NTR/SorCS2配体-受体系 统成分之间的结合。例如，如果减少至少约25%、以及在某些实施方式中至少约50%、以及 在其他实施方式中至少约90%，则认为减少具有显著性。

结合拮抗剂能够以两种方式发挥作用。结合拮抗剂能够与配体proNGF竞争受体，从而 干扰、阻断或防止proNGF与p75NTR和/或SorCS2结合。此类型的拮抗剂，其与受体结合 但不触发预计的信号转导，也称为“竞争性拮抗剂”，其可以包括，例如基于proNGF序列 设计的寡肽，或针对SorCS2的抗体。或者，结合拮抗剂能够结合至并隔离配体proNGF，其 与配体具有足够的亲和性和特异性，基本上能够干扰、阻断或防止proNGF与p75NTR和/或 SorCS2结合。此类型的拮抗剂也称为“中和拮抗剂”，其可以包括，例如针对proNGF的抗 体或适体，其与proNGF特异性结合。

还可以基于拮抗剂拟拮抗的靶分子确定拮抗剂的特征。例如，proNGF拮抗剂指抑制或减 少proNGF表达；或干扰、阻断或防止proNGF与p75NTR和/或SorCS2相互作用或结合的分 子。另一方面，SorCS2拮抗剂指抑制或减少SorCS2表达；或干扰、阻断或防止SorCS2与 proNGF和/或p75NTR相互作用的分子。

ProNGF拮抗剂

在一个实施方式中，本发明提供了一种通过给予proNGF拮抗剂减轻急性心肌缺血后微 血管障碍及相关损伤的方法。

如本申请所公开的，proNGF拮抗剂可以是proNGF的特异性中和抗体、适体、寡肽、小 分子化合物、或例如能够降低proNGF mRNA的水平或活性的核酸分子。

在一个特定实施方式中，proNGF拮抗剂是proNGF的特异性中和抗体。

在本申请中，proNGF的特异性分子（如抗体或适体）是指与成熟NGF和其他神经营养 因子原相比，与proNGF的结合基本上具有较高亲和性，以及在某些实施方式中，与proNGF 的结合几乎具有排他性的分子。“基本上具有较高亲和性”指分子与proNGF的结合亲和性 （Kd）为分子与成熟NGF或其他神经营养因子原的结合亲和性的至少5倍、10倍、50倍、 100倍、或1000倍或以上。

在一个特定实施方式中，proNGF的特异性抗体指指向proNGF原结构域的抗体。

ProNGF的原结构域与其他神经营养因子的原结构域完全不同（图13），使得指向 proNGF原结构域的抗体不可能与其他神经营养因子或成熟NGF发生交叉反应。在适宜的情 况下，可以采用本领域公知的检测方法确定抗-proNGF抗体的特异性，包括在下文的实施例 中更加详细描述的那些方法。

ProNGF的原结构域在各种属之间高度保守。如图12所示，在人、猕猴、猪、犬、大 鼠、和小鼠的NGF原结构域内存在显著一致的区域，使得能够产生指向原结构域的不同区 域、基序、三级结构、或表位的原结构域的抗体谱。

在一些实施方式中，proNGF特异性抗体特异性地指向原结构域内的基序或表位，包括在 如图12所示的各种属之间高度保守的原结构域内连续的氨基酸序列。

本申请所使用的术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白分子，以及包括与目的抗原特异性 结合的抗体高可变区的分子，其具有或不具有抗体恒定区。高可变区可以包括完整的抗体可 变区。因此，包括抗体高可变区的抗体分子可以是完整的抗体分子、保留完整抗体抗原结合 特异性的抗体片段（包括单链抗体）、以及嵌合和人源化抗体。抗体可以是多克隆的或单克 隆的，并且可以是任何种类的免疫球蛋白，如：IgG、IgM、IgA、IgD或IgE，及其亚类。

可以在非人哺乳动物中生产适宜的抗体，包括例如，家兔、大鼠、小鼠、马、山羊、骆 驼、或灵长类。可以通过下述本领域公知的技术对在非人哺乳动物中生产的单克隆抗体进行 人源化以减少供人使用时的免疫原性。例如，为了将在小鼠中产生的单克隆抗体人源化，一 种方法是制备小鼠-人嵌合抗体，其具有鼠源性mAb的原始可变区，并与人免疫球蛋白的恒 定区相连接。嵌合抗体及其生产方法是本领域的公知常识。参见，例如Cabilly et al.，欧洲 专利申请125023（公开于1984年11月14日）；Taniguchi et al.，欧洲专利申请171496（公 开于1985年2月19日）；Morrison et al.，欧洲专利申请173494（公开于1986年3月5 日）；Neuberger et al.，PCT申请WO86/01533，（公开于1986年3月13日）；其全部内容 通过引用并入本申请。或者，可以通过包括人免疫球蛋白的恒定区，以及使用相应的人框架 残基取代非人抗体可变区的框架残基制备人源化抗体，其可以使非人CDR基本保持完整， 或甚至使用衍生自人基因组的序列取代CDR。参见，例如Maeda et al.,Hum.Antibod. Hybridomas2:124-134,1991，和Padlan,Mol.Immunol.28:489-498,1991。作为另外一种选 择，可以由转基因动物（例如，转基因小鼠）生产人抗体，已改变了这些转基因动物的免疫 系统以便与人免疫系统相对应。此类小鼠的一个例子被称为XenoMouse^TM（Abgenix, Freemont,Calif.），如Green,"Antibody Engineering via Genetic Engineering of the Mouse: XenoMouse Stains are a Vehicle for the Facile Generation of Therapeutic Human Monoclonal  Antibodies,"J.Immunol.Methods10;231(1-2):11-23(1999)所描述的。

在另一个特定实施方式中，proNGF拮抗剂是与proNGF特异性结合的适体。

适体是与特异性靶分子结合的核酸或肽分子。核酸适体通常是短链DNA或RNA，其通 过称为SELEX（指数式富集配体的系统进化技术）的体外选择结合至不同分子靶点的重复循 环设计。可以使用不同系统选择肽适体，最常用的是通过酵母双杂交系统。肽适体一般由可 变肽环（一般包括十至二十个氨基酸）组成，其连接在蛋白支架的两个末端。该双结构限制 极大地增加了肽适体的结合亲和性，使其水平与抗体相当。

在另一个特定实施方式中，proNGF拮抗剂是寡肽或小分子化合物，其与proNGF受体 （即，p75受体和/或SorCS2）结合，从而阻断proNGF与其受体的结合，但是通过proNGF 与p75NTR/SorCS2的结合不会触发下游信号或生物活性。

可以通过本领域公知的方法发现此类小分子和寡肽。一般地，发现此类小分子的过程涉 及提供表达p75NTR和/或SorCS2的细胞，提供拟检测的小分子或寡肽，以及确定拟检测的 小分子或寡肽是否与p75NTR和/或SorCS2结合，以及任选地，获得由proNGF与 p75NTR/SorCS2结合引起的生物活性。如果分子与p75NTR和/或SorCS2结合的亲和性较 高，则其为本方法用于限制微血管损伤的候选物。如果分子与p75NTR和/或SorCS2结合的 亲和性较高且阻断proNGF与p75NTR/SorCS2的结合，则其为更强的候选物。如果除了阻断 结合以外，分子还不会导致p75NTR/SorCS2活化预期的生物活性，例如，活化内皮细胞，则 该分子是临床前或临床试验的候选物。

寡肽具有至少约四个氨基酸残基，并且在某些实施方式中具有至少约五个氨基酸残基， 并且在其他实施方式中具有至少约六个氨基酸残基。氨基酸残基的最大数量并不重要，只要 寡肽具有上文所述的所需性质。寡肽可以是线性的或环状的。

寡肽的某些例子包括：

S/T-P/S-R-V-(Z)z(SEQ ID NO:10)

S/T-P/S-R-V-L/M/V-(Z)z(SEQ ID NO:11)

S/T-P/S-R-V-L/M/V-F/L-(Z)z(SEQ ID NO:12)

S/T-P/S-R-V-L/M/V-F/L-S-(Z)z(SEQ ID NO:13)

其中Z表示任何α氨基酸，并且z表示0至约20之间的任何数值，优选地表示0至约 10、更优选地表示0至约5。这些寡肽中的任何一个可以是环状的。

小分子包括有机化合物、有机金属化合物、有机和有机金属化合物的盐、糖、氨基酸、 和核苷酸。小分子的分子量一般低于约1000道尔顿，在某些实施方式中低于800道尔顿。 小分子包括在自然界中发现的化合物和合成化合物。

在另一个特定实施方式中，给予的proNGF拮抗剂是降低proNGF mRNA的水平或活性 的核酸分子。此类核酸分子包括反义RNA、siRNA、miRNA（或“微型RNA”）或转基 因，其在受体的靶组织中编码并能够表达任何的此类RNA分子。反义RNA指与内源性 mRNA互补并通过与内源性mRNA形成双螺旋而阻止内源性mRNA翻译的RNA分子。 siRNA是小双链RNA（其长度一般为20-25个核苷酸），已知其涉及RNA干扰通路并且干 扰特定基因的表达。当靶基因序列确定后，可以设计siRNA，并通过合成或在内源性引入载 体（例如，质粒）的细胞中制备，以达到对所关注基因的表达的抑制。与siRNA类似， miRNA也是调控基因表达的小RNA分子（一般约21-22个核苷酸）。miRNAs由转录自非 蛋白编码基因的长前体加工得到，并且通过与靶mRNA不精确的碱基配对使翻译中断。可以 使用本领域公知的技术设计miRNA并将其导入细胞或组织，以靶向性抑制所关注基因 （proNGF、SorCS2或p75NTR）的表达。可以通过病毒介导的pro-miRNA或decoymiR的递 送或在血浆中的递送完成miRNA的调变（例如，Cordes KR,et al,Nature460:705(2009); Caporali A,et al.,Circulation123:282,(2011);Castoldi,M,J.,Clin Invest.121:1386(2011); Vickers,KC et al.,Nat Cell Biol13:423(2011)）。

SorCS2拮抗剂

在进一步的实施方式中，本发明提供了一种通过给予SorCS2拮抗剂减轻急性心肌缺血后 的微血管障碍及相关损伤的方法。

如本申请所公开的，SorCS2拮抗剂可以是抗体、适体、寡肽、小分子化合物、或能够降 低SorCS2mRNA的水平或活性的核酸分子。

在一个特定实施方式中，SorCS2拮抗剂是与SorCS2特异性结合并且抑制SorCS2与 proNGF和/或p75NTR相互作用的抗体。SorCS2特异性抗体是指与分拣蛋白家族的其他成员 如分拣蛋白相比，与SorCS2的结合基本上具有较高亲和性，并且在某些实施方式中，与 SorCS2的结合几乎具有排他性的分子。“基本上具有较高亲和性”指抗体与SorCS2的结合 亲和性为抗体与分拣蛋白家族其他成员结合亲和性的至少5倍、10倍、50倍、100倍、或 1000倍或以上。

在一个特定实施方式中，SorCS2特异性抗体指向SorCS2的胞外结构域（人SorCS2的氨 基酸20-1078）。在一些实施方式中，SorCS2特异性抗体特异性地指向胞外结构域的特定基 序或表位，如富含半胱氨酸的结构域（人SorCS2的氨基酸残基611-750），或10个叶片螺 旋桨结构域（氨基酸45-610）。人SorCS2的氨基酸序列见SEQ ID NO:14（登录号 NP_065828）。

与上文所述的proNGF拮抗剂类似，SorCS2拮抗剂不仅限于抗体，还包括与SorCS2特 异性结合并抑制其与proNGF和/或p75NTR相互作用的核酸或肽适体、阻断SorCS2与 proNGF和/或p75NTR相互作用的寡肽或小分子化合物、以及降低SorCS2mRNA水平或活 性的核酸分子（如反义、siRNA、或miRNA）。

拮抗剂混合物

本申请还提供了一种以上拮抗剂分子的混合物，其也适于给药。混合物可以例如包括一 种或多种抗体分子、一种或多种适体分子、一种或多种寡肽或小分子、或其不同组合。混合 物还可以包括一种或多种proNGF拮抗剂与一种或多种SorCS2拮抗剂的组合。

给药

在急性心肌缺血（AMI）发生后尽快给予对象拮抗剂或拮抗剂的混合物。但是，在AMI 发生最迟48h内给予拮抗剂仍有效。在一些实施方式中，在AMI发生后24小时、18小时、 12小时、6小时甚至2小时内给予对象拮抗剂。在一个特定实施方式中，在AMI发生后2-6 小时内开始给予拮抗剂。重复给药或给药的适宜剂量可以由有经验的医师确定。

可以通过任何适宜的和可实施的方法将拮抗剂与药学上可接受的载体组合，如通过混 合、溶解、混悬、乳化、包封、吸收等等，并且可以将其制成适宜于注射、植入、吸入、摄 食等的如片剂、胶囊、粉剂、糖浆、混悬液等制剂。

如本申请所使用的，药学上可接受的载体包括任何及全部溶剂、分散介质、等张剂等 等。除对受体或本申请包含活性剂的效果有害的那些以外，本申请公开的方法可以使用任何 常规的介质、试剂、稀释剂或载体。载体可以是液体、半固体例如糊剂、或固体载体。载体 的例子包括油、水、盐溶液、醇、糖、凝胶、脂质、脂质体、树脂、多孔性材料、粘合剂、 填充剂、包衣剂、防腐剂等等、或其组合。

拮抗剂在制剂中的浓度范围可以为以重量计最低约0.1%至最高15或20%，可以基于所 使用的特定拮抗剂的性质和选定的给药模式在其他备选方案中对其进行选择。这样，典型的 注射用制剂可以制备成至多含1mL磷酸缓冲盐无菌缓冲液和1-1000mg，可能为10-100mg 的拮抗剂，例如基于抗体的拮抗剂。

根据拮抗剂的性质或AMI情况，可以通过标准途径给予对象含有拮抗剂的药物制剂，包 括摄食、静脉注射、腹腔、皮下、透皮、肌内、鼻内、或舌下途径给药，或在经皮介入治疗 或在开心手术时通过导管递送。一般而言，基于抗体或适体拮抗剂可以静脉递送。可以将基 于RNA的拮抗剂直接递送至心脏，例如在经皮介入治疗，或如果需要进行动脉搭桥术治疗 开心手术时通过导管递送。

依据患者的状况（例如，年龄、体重和健康状况）、AMI发生后的时间间隔、和拮抗剂 的性质确定给予拮抗剂的有效量。有经验的医师可以确定拮抗剂的精确有效量。

实施例

通过下述实施例对本说明书进行进一步解释，在任何情况下不应将其解释为对本发明的 限定。所有引用的参考文献（包括本申请中引用的文献、授权专利、和公开的专利申请）的 内容均明确地通过引用并入本申请。

实施例-1。

本实施例描述了实施例2所述实验中使用的材料和方法。

错表达proNGF的诱导性敲入小鼠的产生。

使用标准的斑点印迹技术（(Osoegawa et al.,Genome Research,10(1):116-128(2000)）从 购自UK HGMP MRC Geneservice（Cambridge,UK）的129/SvevTACfBR雌性脾文库中鉴定 基因组PAC克隆RPCI21-494-C12。通过在终止密码子前框内的定点突变加入血凝素（HA） 表位标签。通过定点突变（Stratagene）将弗林蛋白酶识别位点由KR突变为AA。将经修饰 的新霉素抗性表达盒，由frt-loxp-engrailed剪接受体-pGK-neo^r-终止密码子-frt-loxp序列组成 （5'至3'），插入起始密码子上游350bp处。使用白喉毒素表达盒进行阳性选择。靶向效率 为约4%。将三个独立来源的表达Prongf-HA（在本申请中称为proNGF-HA/+）的阳性克隆 进行扩增并显微注射至C57Bl/6小鼠的胚胎。通过该方法获得三个独立品系的proNGF-HA 小鼠。采用相同方法产生两个品系的Ngf-HA敲入小鼠（称为wtNGF-HA/+），在该构建中 未对弗林蛋白酶裂解位点进行突变。采用标准技术进行Southern印迹分析。使用PCR通过 扩增HA表位标签：5'-TGA AGC CCA CTG GAC TAA ACT T-3'（SEQ ID NO:15）和5'- AAT CTG GAA CAT CGT ATG GG-3'（SEQ ID NO:16）将敲入等位基因从野生型等位基因 中鉴定出来。使用另外一对PCR引物：5'-GAG ATC CAC TAG TTC TAG CCT CGA G-3' （SEQ ID NO:17）和5'-CCC ACA CAC TGA CAC TGT CAC AC-3'（SEQ ID NO:18）确定 是否存在新霉素抗性表达盒。

小鼠繁育和组织处理。

所有方法均经过威尔康奈尔医学院IACUC批准。使用β-肌动蛋白-cre删除品系以除去 neo-抗性表达盒并且能够使敲入的等位基因表达。使用下述引物对来鉴定是否存在cre-重组 酶等位基因：5'-TTA TAA CAC CCT GTT ACG TAT AGC C-3'（SEQ ID NO:19）和5'-TAT  CTC TGA CCA GAG TCA TCC TTA G-3'（SEQ ID NO:20）。p75NTR^-/-小鼠购自Jackson  Laboratories，在进行proNGF-HA/+遗传抢救性繁殖前，其已在C57Bl/6背景下回交>G8。其 他对照品系包括NGF^+/-（Crowley et al.,Cell,76(6):1001-1011(1994)）和分拣蛋白^-/-（Jansen et  al.,Nat Neuroscience,10(11):1449-1457(2007)）小鼠。

供免疫组化分析时，将胚胎干和成熟心脏在OCT:30%蔗糖（1:1;Sakura）中速冻。供蛋 白和RNA分析时，在处理前将心脏在-80°C保存。

将FITC-葡聚糖（70kDa;Sigma）通过尾静脉注射至3月龄小鼠（Camelleri1983）。灌 注10分钟后，处死动物、收集并处理心脏以供免疫荧光分析。

免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）。

将冰冻切片立即在丙酮或4%PFA中固定。进行IHC时，将切片在–20°C条件下在0.1% H₂O₂/甲醇中放置15min后，使用PBS洗涤切片、封闭（5%二抗血清/0.1%Triton x- 100/PBS），并使用一抗在4°C条件下孵育过夜。使用的一抗为：HA（Sigma,1:400）、 p75NTR（ECD:R&D,1:1000;ICD:Promega,1:500）、分拣蛋白（R&D,1:400）、SorCS2 （ICD:通过使用偶联至KLH的huSorCS2aa1138-1159免疫家兔制备，1:1000；或ECD: R&D,1:100）、活化的caspase-3（Cell Signaling,1:200）、酪氨酸羟化酶（Jackson  Immunological,1:100）、磷酸化-cJun（Cell Signaling;1:100）、CD31（BD Biosciences, 1:100）、CD41（BD Biosciences,1:100）、纤维蛋白（原）（偶联-FITC,Dako,1:250）、 CD68（偶联-TRITC,Serotec,1:100）、Iba1（Wako,1:400）、ICAM（eBioscience,1:100）。 生物素化的二抗偶联至ABC试剂，使用VIP试剂盒对其进行检测（Vector Labs）。按照基 本上如上文所述的方法进行IF。使用偶联Alexa的二抗（Invitrogen）检测一抗。使用Zeiss LSM510或LSM700激光扫描显微镜进行共聚焦显微镜分析。

免疫沉淀/Western印迹。

在裂解液（0.1M Tris pH7.4/1%Triton x-100/0.1%NP-40/0.05%SDS/10%甘油/蛋白酶抑制 剂混合物[Sigma]）中将冷冻的心脏和脑匀浆。在4°C条件下使用抗-HA抗体（Sigma）沉淀 HA-标记的蛋白。加入蛋白A-琼脂糖（Sigma-Aldrich）捕获免疫复合物，充分洗涤，在 SDS-PAGE上样缓冲液中将其煮沸。使用HA.11单克隆抗体（Covance）检测蛋白斑点，使 用ECL（Amersham）显色。见图3b。使用相同方法对转染的293T细胞裂解物进行免疫沉淀 和Western-印迹分析。见图3a。使用兔-抗-myc抗体（Covance）对myc-标记的分拣蛋白或 SorCS2蛋白进行检测。

RT-PCR。

采用标准方法和试剂（Invitrogen）进行RT-PCR。使用上文所述的HA引物以及β-肌动 蛋白：5'-AAA GAG AAG CTG TGC TAT GTT GCT C-3'（SEQ ID NO:21）和5'-GCA TAG  AGG TCT TTA CGG ATG TCA A-3'（SEQ ID NO:22）进行PCR检测。

ELISA。

按照生产厂商的说明，使用NGF Emax试剂盒（Promega）进行所有的ELISA检测。

经胸廓超声心动图。

本研究使用配有14Hz探头的Accuson Sequoia临床超声设备（K.Hajjar,CUWMC惠 赠）。使用阿佛丁将各只小鼠麻醉，将其置于设定为较低温度的热板上至少20分钟使其恢 复至基线心率，并备皮。将探头头部应用于小鼠胸部的超声凝胶层，使用1cm凝胶补偿扩 大其范围，通过左心室乳头肌定位对心脏中线进行检测。一旦确定中线，将探头延心脏的尾 部-头部轴上下扫过，以确保在左心室最宽的部分观察，然后使探头保持稳定1min，在VHS 纸带上记录。进行M模式的输出，以便于使用下述公式计算短轴缩短率（%FS）：

%FS=[(LVEDD-LVESD)/LVEDD]x100

其中LVEDD=左心室舒张末期内径，以及LVESD=左心室收缩末期内径。所有统计学 分析均采用Student's t-检验。

缺血-再灌注研究。

通过吸入4%异氟烷并持续给予2%异氟烷诱导麻醉。然后对小鼠进行插管和机械通气。 使用直肠探针监测核心体温并将其维持在37°C，使用导联II配置和PowerLab数据采集系统 在整个手术过程中监测ECG。在第4肋间隙进行左侧开胸手术并将心包剪开。使用8-0号缝 合线将冠状动脉左前降支（LAD）双向结扎40分钟，然后通过解开结扎进行再灌注。通过 ECG的ST段升高、局部发绀、和室壁运动异常确认阻塞。通过结扎远端心肌颜色恢复和ST 升高消失确认再灌注。将缝合线留在伤口处以确定结扎位置，逐层关闭胸腔和皮肤。手术 后，将动物送回各笼，在处死和收集组织前给予常规食水48h。根据需要给予Buprenex（0.1 mg/kg）以确保动物在手术过程中舒适。所有手术过程均在无菌条件下进行。

电子显微镜检查法。

所有试剂均购自Electron Microscopy Sciences。从小鼠中取下心脏，使用冷PBS充分洗 涤，并在Karnovsky固定液（含2.5%戊二醛、4%多聚甲醛、0.02%苦味酸的0.1M PBS）中 浸泡过夜。将1cm小块在1%四氧化锇/1.5%铁氰化钾中后固定，使用1.5%的乙酸铀酰染 色，并使用乙醇逐级脱水。在Spurr树脂中包埋后，在RMC MT-7000超薄切片机上使用 Diatome金刚石刀将其切成55-60nm厚的切片。使用柠檬酸铅将切片显影并于80kV条件下 将其置于JSM100CX-II电子显微镜下观察。在Kodak4489电子成像胶片上记录图像，然后 在900dpi下将其数字化输出。

实施例-2。

本实施例描述的实验证明了在小鼠心脏缺血/再灌注损伤后能够迅速诱导产生proNGF和 p75NTR。本实施例还描述了proNGF敲入小鼠的产生，并显示了proNGF作用于表达 p75NTR的周细胞，导致内皮细胞活化，使血管通透性增强和微血管损伤，其使得成年 proNGF敲入小鼠出现致死性的扩张性心肌病。此外，本实施例描述了证明在晚期胚胎发生 过程中插入心脏微血管的周细胞表达p75NTR和SorCS2而非分拣蛋白，确立了与proNGF结 合的SorCS2的功能为与p75NTR一并改变周细胞功能的共受体。

心肌缺血再灌注诱导proNGF和p75NTR的表达。

产生的敲入小鼠的Ngf编码外显子被C-末端添加血凝素（HA）标签的等位基因取代，以 便于将所有形式的NGF删除（wtNGF-HA/+小鼠）。这种策略增强了对NGF蛋白的删除， 使其在心脏中表达的浓度在纳摩以下。对wtNGF-HA/+小鼠进行分析后发现其表达敲入等位 基因的方式无法与内源性等位基因相区分（见下文和图1）。将成年wtNGF-HA/+小鼠的冠 状动脉左前降支夹闭处理40分钟（图2a），再灌注48小时后（I/R损伤）对损伤或假手术 心脏中诱导产生proNGF或成熟NGF的情况进行评估。在未损伤心脏的切片中，在心脏的肌 细胞中检测到弥散性存在的水平较低的总NGF，但proNGF的免疫反应性低于检测敏感性 （分别使用HA或proNGF-特异性抗体；图2b和c，左图）。但是，在再灌注48小时后， 在梗死周围区域的心肌细胞和浸润细胞中观察到I/R损伤诱导产生HA免疫反应性（图2b和 c，右图）。在这种损伤类型中，最可能上调的NGF种类为proNGF，因为使用针对proNGF 结构域原的特异性抗血清时，梗死区域的肌细胞显示出免疫反应性（Harrington et al.,2004； 图2c）。此外，被I/R损伤募集至梗死周围区域的细胞对proNGF为免疫阳性（图2b和c， 右图，箭头）。为评估是否协同诱导了proNGF受体，我们采用免疫荧光法对正常和I/R损 伤的心脏中p75NTR、分拣蛋白、和亦与proNGF结合的分拣蛋白家族成员SorCS2的表达 （图3）进行评估。在α-平滑肌肌动蛋白阳性血管平滑肌细胞中表达的分拣蛋白在未损伤和 I/R损伤心脏中相当（图2d）。与此前的研究结果一致，在未损伤的心肌中，交感神经纤维 排他性地表达p75NTR，其对酪氨酸羟化酶具有免疫反应性（图2e，左图）。但是，在I/R 损伤心脏的梗死周围区域中，p75NTR在营养不良的轴突（图2e，右图）以及浸润细胞亚群 （数据未列出）表达。令人惊讶的是，在梗死周围区域的PDGFRβ-阳性周细胞中也诱导 p75NTR表达（占周细胞群的~10%；图2f，插图），但是在内皮细胞中不表达（数据未列 出）。下面评估在分拣蛋白和SorCS2中的表达。未损伤心肌大部分小动脉中的血管平滑肌 细胞（图2g）以及造血细胞亚群（数据未列出）中也表达SorCS2。在I/R损伤心脏中，梗死 周围的平滑肌细胞保持了SorCS2免疫反应性（图2），其在定居巨噬细胞和浸润细胞中也可 以检测到（数据未列出）。最后，在梗死周围区域PDGFRβ-免疫阳性周细胞亚群中诱导产生 SorCS2（占所有周细胞的~10-20%；图2h）。总而言之，这些结果表明在缺血-再灌注损伤 后，协同诱导产生了proNGF及其受体p75NTR。

proNGF在体内的表达增加。

为阐明proNGF在心脏中的病理生理作用，制备Ngf编码外显子被突变等位基因取代使 弗林蛋白酶裂解位点受损的敲入小鼠（aa-K¹²⁰R¹²¹突变为AA）。此外，在C-末端加入血凝 素（HA）表位标签以便于删除（Prongf-ha）（图4）。鉴定表达一个等位基因Prongf-ha和 一个内源性等位基因的三个独立产生的小鼠品系（proNGF-HA/+小鼠），以及表达一个等位 基因Ngf-ha和一个内源性等位基因的两个独立产生的小鼠品系（wtNGF-HA/+小鼠）。 wtNGF-HA/+小鼠可存活、能够繁殖并且与其NGF^+/+野生型同窝小鼠无法通过肉眼辨别。尽 管在混合背景（129+C57Bl/6）proNGF-HA/+幼崽中观察到的胚胎致死率为30-50%，在完全 C57Bl/6背景的小鼠中，存活的幼崽能够发育成熟并在成年后具有繁殖能力。因为wtNGF- HA/+和proNGF-HA/+小鼠均表达一个内源性等位基因Ngf，对单体型机能不全NGF^+/-小鼠 （Crowley1994）进行平行分析，并将其作为评估proNGF获得功能表型的对照。

对胚胎或新生动物心脏组织进行RT-PCR检测，对Prongf-ha mRNA和Ngf-ha mRNA的 表达进行确证。由于在包括心脏在内的靶器官内NGF的表达在纳摩水平以下（Lommatzsch 2005），因而发明人无法在未受损的新生或成年心脏切片中检测HA的免疫反应性 （proNGF-HA或wtNGF-HA）（数据未列出和见图2）。但是，在wtNGF-HA/+脑中检测到 了HA的免疫反应性，其中NGF的水平比心脏约高2倍，且NGF的表达集中在神经元亚集 中。使用检测成熟结构域以及proNGF和成熟NGF的抗体进行ELISA分析，结果表明，在 proNGF-HA/+小鼠中总NGF蛋白的表达水平与其NGF^+/+同窝接近（NGF^+/+脑：141.0+/-8.16 ng/g[平均值+/-SEM]；proNGF-HA/+脑：152.5+/-3.8ng/g；NGF^+/+心脏：85.2+/-1.8ng/g； proNGF-HA/+心脏：84.5+/-5.3ng/g）。为了分别确证在proNGF-HA/+或wtNGF-HA/+小鼠 中proNGF或成熟NGF的表达情况，使用HA表位标签对心脏或脑裂解物中所有的NGF亚 型进行免疫沉淀。在wtNGF-HA/+小鼠的脑裂解物中仅观察到了成熟的NGF-HA（~14kDa= ~13.5kDa成熟NGF+~0.7kDa HA）。尽管可检测到某些裂解为成熟的NGF（约占总水平的 10%），但是ProNGF-HA（~35kDA=~34kDa proNGF+~0.7kDa HA）仍为在proNGF- HA/+脑裂解物中观察到的丰度最高的表达形式。在proNGF-HA/+心脏裂解物中，在P0时仅 可以检测到proNGF。见图3b。这些结果证实了成熟NGF是在wtNGF-HA/+小鼠的细胞中以 及由细胞分泌的最主要的亚型，而在proNGF-HA/+小鼠中引入抗裂解proNGF外显子显著消 除proNGF裂解为成熟的NGF。

成年期的ProNGF-HA/+小鼠表现出心室扩张。

为分析proNGF在心脏中表达的作用，对成年proNGF-HA/+小鼠进行检查。与年龄匹配 小鼠的NGF^+/+心脏相比，在8月龄（mo）的proNGF-HA/+小鼠中观察到了明显的心脏两心 室扩张（图5a，c）。NGF^+/-（图5b）和wtNGF-HA/+（数据未列出）小鼠的心腔还是正常 的，提示该表型反映了proNGF的表达，而非成熟NGF的单体型机能不全或靶向该等位基因 的无意识后果。在更高的放大倍数下（图5d-f），观察到了浸润细胞和肌原纤维脱落病灶增 加，其主要出现在proNGF-HA/+而非NGF^+/+或NGF^+/-心肌的心内膜下方区域。这些浸润细 胞表达组织细胞标记物CD68+（图5g-i）或，不太常见地，将其与肥大细胞标记物FITC-亲 和素共标记（数据未列出）。Masson三色染色评估发现，在8月龄时，proNGF-HA/+小鼠的 心内膜下方区域出现了广泛的纤维化区域，而其未见于对照动物中（图5j-l）。该表型是心 肌炎和扩张性心肌病（DCM；见综述Chihakova2008）患者中可见的陈旧性损伤。

为了确证在proNGF-HA/+小鼠中的心脏纤维化，使用透射电镜显微镜检查法对4月龄小 鼠心脏的超微结构进行检查（图6）。NGF^+/+和NGF^+/-心脏的外观是健康的，其心脏的肌细 胞表现为Z线完整、线粒体形态正常、和具有脂滴。而相反地，proNGF-HA/+小鼠出现了肌 原纤维损伤和带有异常嵴的肿胀线粒体，以及内皮细胞的细胞质减少同时偶见明显破裂且处 于管腔外的红细胞。这些观察结果确证了利用光学显微观察到的组织学结果，并且证实了在 proNGF-HA/+心肌的早期成年期出现血管表型。

P75NTR的遗传删除挽救proNGF介导的心肌病。

为确定在proNGF-HA/+小鼠中功能性损伤的时程，从2月龄（mo）开始对一组小鼠进行 经胸廓的超声心动图检查。与NGF^+/+同窝和wtNGF-HA/+敲入小鼠相比，proNGF-HA/+小鼠 在生命的早期阶段即可观察到功能性心脏损伤（图7a为典型轨迹）。纵向分析表明，与 NGF^+/+和NGF^+/-动物相比，在2月龄时proNGF-HA/+小鼠的收缩功能就明显受损且其表现为 进行性的（图7b，将NGF^+/+[实心蓝色菱形]与proNGF-HA[实心红色方块]比较）。在所有已 分析的年龄中，与NGF+/+小鼠相比，proNGF-HA/+小鼠的短轴缩短率明显受损（P<0.005， Student t-检验）。例如，在2月龄时，proNGF-HA小鼠的短轴缩短率（FS）为44.0%（+/- 11.6，平均值+/-SEM，n=31），而相比之下NGF+/+小鼠为66.2%（+/-5.3，n=18； P<0.002，Student t-检验）。5月龄时，proNGF-HA/+小鼠的短轴缩短率为29.9%（+/-2.9， n=15），而NGF^+/+小鼠为56.9%（+/-3.4，n=14；P<0.002，Student t-检验）。还观察到 proNGF-HA/+小鼠在4-8月龄时死亡。实际上，Kaplan-Meier分析显示与NGF^+/+小鼠相比， proNGF-HA/+小鼠显著损失，在4月龄时其死亡率为50%（图7c）。这样，通过后期在 proNGF-HA/+小鼠中的短轴缩短率异常可能低估心肌病的严重程度，因为大部分proNGF- HA/+动物在8月龄以前死亡。

为确定在proNGF-HA/+小鼠中观察到的心肌病是否是由已确立的proNGF受体、p75NTR 和分拣蛋白活化导致的，发明人对p75NTR（p75NTR^-/-；proNGF-HA/+；n=14）或分拣蛋白 （sort^-/-；proNGF-HA/+；n=15）缺陷的proNF-HA/+小鼠进行了评估。假定如果观察到的扩 张性心肌病由proNGF与p75NTR和/或分拣蛋白的结合导致，则删除针对proNGF的这两个 受体之一就可以阻止该表型。的确，超声心动图检测结果显示，p75删除可以挽救心脏收缩 性过低（图7a，典型轨迹，b空心红色方块）。即使在8月龄时，p75^-/-；proNGF-HA/+的壁 动分数仍与NGF^+/+心脏相当（与NGF^+/+小鼠比较P>0.05，Student t-检验）。伴随着功能上 的挽救，与proNGF-HA/+动物相比（数据未列出），p75NTR^-/-；proNGF-HA/+心脏的生存期 更佳（与NGF^+/+小鼠相同）并且其具有正常的组织学外观。

令人惊讶的是，分拣蛋白缺乏不会挽救proNGF-HA/+小鼠在短轴缩短率或两心室扩张和 心脏纤维化的组织学证据方面的缺陷（图7b，实心绿色三角，数据未列出）。Kaplan-Meier 存活分析显示，50%的sort^-/-；proNGF-HA/+小鼠在4月龄时死亡，其余小鼠中>90%在8月 龄时死亡（数据未列出），这与在proNGF-HA/+小鼠中得到的数据一致（图7c）。这些结 果表明，单独的p75NTR就足以介导proNGF-诱导的心脏障碍，或者另一个分拣蛋白家族成 员是该系统的共受体。通过对杂细胞中表达的蛋白进行免疫共沉淀评估后发现，proNGF与 分拣蛋白和SorCS2的结合程度相当，这表明在鼠源性心脏中SorCS2是p75NTR的共受体 （图3）。对wtNGF-HA/+、sort^-/-、NGF^+/-、和p75NTR^-/-小鼠进行分析的结果显示，在这些 小鼠中心脏壁动无明显异常。因而，proNGF的表达而非成熟NGF缺乏介导了所观察到的心 肌病。

心脏障碍开始于微血管内皮细胞早期。

为鉴定proNGF介导的心脏障碍的机制，对来自于年轻NGF^+/+和proNGF-HA/+小鼠的心 脏进行分析（图8）。在1月龄时，NGF^+/+、NGF^+/-、和proNGF-HA/+心脏之间组织学类似 （图8a-c），其具有完整的肌原纤维以及正常的动脉和静脉（数据未列出）。随后进行投射 电子显微镜检查（TEM）以便对心脏的超微结构进行分析。1月龄NGF^+/+、NGF^+/-、和 proNGF-HA/+小鼠的心脏表现为正常心肌细胞形态，其具有健康的肌原纤维和线粒体。但 是，与NGF^+/+和NGF^+/-小鼠的心脏不同，proNGF-HA/+心脏表现为微血管内皮细胞活化，其 特征为可见大量细胞质空泡和深入管腔的膜片（图8f，箭头）。在对proNGF-HA/+小鼠 （N=2）的评估中发现，左心室已检查的40/75个微血管内皮细胞表现出这些活化指征中的 一个或多个。而相反地，在平行分析的NGF^+/+（N=2）或NGF^+/-（N=2）心脏的微血管内皮 细胞中发现这些异常的为5%以下。此外，我们在proNGF-HA/+血管的管腔中观察到纤维状 的、高电子密度沉积其形态与纤维蛋白链类似，并且在这些心脏中我们观察到纤维蛋白 （原）的免疫反应性增加。最后，在proNGF-HA/+心脏的若干微血管中出现了血管周围水肿 同时伴有内皮细胞在细胞外基质的紧密排列丧失（已检查的血管中为3/16；例如，见图8f， 星号）。这些结果表明在proNGF-HA/+小鼠生命的早期阶段其心脏微血管的内皮即出现异 常，这可能导致其在晚期出现心脏纤维化和扩张性心肌病。

微血管血栓和完整性丧失导致在proNGF-HA/+小鼠中出现扩张性心肌病。

为评估在年轻proNGF-HA/+小鼠中导致其微血管损伤的组织学和电子显微镜检查证据的 潜在机制，使用三个参数对微血管的完整性进行评估。为了评估在proNGF-HA/+动物中是否 是内皮细胞活化导致了血小板捕获和纤维蛋白（原）沉积，对CD41（检测血小板）和纤维 蛋白（原）的免疫反应性进行评估。与野生型同窝相比，在proNGF-HA/+小鼠的微血管中观 察到CD41的免疫反应性增加（图9a和b）和纤维蛋白沉积增加。而相反地，p75NTR^-/-； proNGF-HA/+动物未显示出血小板（图9c）或纤维蛋白（原）（数据未列出）的免疫反应性 增加，表明所观察到的表型依赖于p75NTR的表达。其次，对proNGF-HA/+心脏诱导的作为 内皮细胞活化指示的ICAM免疫反应性与NGF^+/+心脏进行比较（图9d和e），通过p75NTR 丢失可以再次对其进行挽救（图9f），通过半定量分析证明了上述结果（图9j和k）。最 后，为了评估在proNGF-HA/+心脏中是否微血管的通透性改变，使用FITC-葡聚糖（70 kD）在3月龄小鼠中进行了灌注研究。在proNGF-HA/+心脏中FITC-葡聚糖大分子的外渗增 加，而相比之下在NGF^+/+和p75NTR^-/-；proNGF-HA/+心脏中的水平较低（图9g-i）。总 之，这些结果表明proNGF利用p75NTR诱导微血管内皮细胞活化和微血栓。

为了更好地理解在表达proNGF-HA的动物中proNGF:p75NTR信号是如何导致微血管损 伤的，在发育和成熟心脏中对proNGF受体进行了定位。在延伸至成熟NGF^+/+和proNGF- HA/+心脏的酪氨酸羟化酶（TH）表达交感过程中易于对p75NTR受体进行检测（图2d和数 据未列出）。在E17.5胚胎中，当发育心脏的交感侵袭最小时，我们在心脏血管中观察到了 p75NTR的表达。在wtNGF-HA/+和proNGF-HA/+心脏中，在微血管中使用周细胞标记物 PDGFRβ对p75NTR的免疫反应性进行共定位（占周细胞群的~10%；图10b），但是其不能 与异亮氨酸B4-免疫阳性内皮共定位（图10和数据未列出）。在新生儿（数据未列出）和成 年心脏（图2f）中，分拣蛋白被单独免疫定位至小动脉和动脉的平滑肌细胞，而非微血管周 细胞。在新生儿血管周围细胞的亚群中检测到了亦与proNGF结合的SorCS2，在P0时其与 PDGFRβ-阳性周细胞亚群共定位（占周细胞的~10%；图10c），但是使用异亮氨酸B4检测 时未见其与内皮细胞共定位（数据未列出）。尽管周细胞群表达p75NTR和SorCS2，但在 P0时仅少数周细胞共表达这两个受体（图10d，插图）。在成年心脏中，SorCS2特异性定位 于小动脉的平滑肌细胞上（图2g）。总而言之，这些数据表明在晚期胚胎发育阶段，周细胞 亚群表达p75NTR或SorCS2，以及心脏肌细胞表达的proNGF诱导周细胞障碍，进而导致微 血管损伤。这些结果支持了一个模型，即在妊娠晚期和出生后早期支持微血管内皮的周细胞 损伤导致内皮细胞活化、微血管血栓形成和血管完整性丧失。这些效应在微血管缺血和心脏 纤维化中达到顶点，进而导致致死性的扩张性心肌病。

讨论

为了揭示proNGF的其他作用，我们制备了在内源性ngf启动子的作用下误表达弗林蛋白 酶抗性proNGF等位基因的敲入小鼠，以阐述多个器官的病理生理学后果。

已鉴定proNGF-HA/+小鼠的心脏收缩性会出现逐渐加重的进行性不足，其反映了 proNGF的功能获得作用，而非成熟NGF减少的功能丧失作用，其已被NGF单体型机能不 全动物的表型缺乏所证实。组织学和超微分析表明微血管内皮的活化引发了心脏收缩性过低 和纤维化，这导致细胞外基质沉积增加和随后形成瘢痕以及促炎性细胞因子浸润。在该组织 损伤级联中proNGF：p75NTR活化的病理学作用已被在p75NTR^-/-小鼠中心脏表型的遗传挽 救所确证。这样，与外周和中枢神经系统一样，心脏利用p75NTR作为proNGF受体复合物 的信号组分。有趣的是，p75NTR和proNGF介导神经元作用的共受体分拣蛋白在该表型中 不发挥作用，因为sort-/-；proNGF-HA/+基因型对该表型无挽救作用。分拣蛋白家族的另一 个成员SorCS2，已在本申请中鉴定为介导本申请中所观察到的心脏表型的p75NTR的共受 体。

已鉴定在胚胎心脏发育过程中p75NTR+周细胞而非内皮细胞在年轻成年小鼠的proNGF 介导的心肌病中提供了令人惊讶的机制。本申请假定由心脏肌细胞分泌的proNGF局部地作 用于p75NTR+周细胞以诱导周细胞障碍，进而导致微血管内皮缺乏营养支持。

实施例-3。

本实施例说明了如何开发和鉴定针对proNGF结构域原的人抗体，以及证明抗体对 proNGF而非相关神经营养因子具有特异性。本实施例还给出了临床前模型，以显示抗- proNGF抗体阻止proNGF诱导的细胞死亡，以及在心肌缺血动物模型中促进心脏保护作用。 本实施例进一步描述了在急性心肌梗死患者中设计的一项小型临床研究，以确立抗-proNGF 抗体的递送限制梗死尺寸和促进心脏恢复。

临床前研究

可以通过重组方法生产ProNGF及其结构域原。可以将重组结构域原作为免疫原，以生 产对该结构域原具有特异性和对proNGF具有特异性的抗体。可以对抗体中和重组proNGF 活性的效力进行分析。

可以生产和鉴定特异性针对结构域原不同区域的高亲和性单克隆抗体。NGF的结构域原 和成熟结构域在各种属间高度保守。如图12所示，在人和小鼠的NGF结构域原内存在显著 一致的区域，使产生指向结构域原不同区域、基序或三级结构的抗体谱成为可能。

已证明特异性针对proNGF结构域原的抗体，不识别其他人神经营养因子原的结构域原 或成熟结构域。ProNGF的结构域原与其他神经营养因子原的那些明确不同（图13），使针 对proNGF结构域原产生的抗体不可能与其他家族成员或成熟NGF发生交叉反应。尽管如 此，可以通过（i）修订的双位点ELISA（ii）免疫共沉淀和（iii）摄取试验对抗-proNGF抗 体的特异性进行验证。

ELISA–鉴定仅与proNGF发生相互作用而不与其他神经营养因子原或已知在心血管细胞 中发挥作用的其他生长因子发生相互作用的proNGF抗体，对商品化的用于NGF、BDNF、 NT-3、NT-4、FGF、和VEGF的ELISA试剂盒进行改良，使用抗-proNGF代替这些三明治 ELISA检测中的包被抗体。该方法是可变的，其适于对候选proNGF抗体的范围进行确定性 鉴定以及排除与其他生长因子之间的交叉反应性。

免疫共沉淀–可以对抗-proNGF单克隆抗体识别人、小鼠、可能是猪或灵长类proNGF 的能力进行评估，以确证其在临床前模型中的作用。可以使用表达其他种属proNGF细胞的 培养基进行该检测，并与候选单克隆抗体进行免疫共沉淀分析。

摄取试验-在对一系列抗-proNGF抗体进行鉴别后，使用共表达p75^NTR和分拣蛋白或 SorCS2的HT1080细胞评估抗体阻断proNGF结合和内化的能力。可以使用Alexa-594标记 重组的proNGF并根据此前的描述进行摄取试验（Feng et al.,J Mol Biol.396:967,2010）。在 proNGF加入前30min，在培养基中加入抗-proNGF抗体。依文献中的记载（Feng et al.,J  Mol Biol.396:967,2010）采用半定量荧光显微镜法于24小时后对内化的Alexa-偶联proNGF 的量进行定量。已将该检测开发为高通量筛选。作为对照，使用Alexa-偶联成熟NGF进行 比较研究。抗-结构域原抗体应将proNGF免疫耗竭，而成熟NGF则不能。

细胞死亡试验–一旦已鉴别抗-proNGF抗体阻断proNGF的摄取，则可以使用共表达p75 和分拣蛋白或SorCS2的HT-1080细胞以及原代颈上神经节（SCG）神经元验证其阻断 proNGF诱导的细胞死亡的作用。后面的模型已广泛应用于神经营养因子原促凋亡性质的文 献中（参见，例如Lee,Science,294:1945-48(2001);Teng et al.,J Neurosci,25:5455(2005); Yano et al.,J Neurosci.,29:14790(2009)）。

拟实施的抗体优化包括亲和性突变和半衰期延长。

对抗-NGF的效能进行临床前分析。在啮齿类动物的心脏缺血/再灌注模型中对抗-proNGF 的潜在生物治疗作用进行研究，随后扩展至猪/犬或灵长类模型中。将目前使用的多克隆抗- proNGF抗体作为对照。

简而言之，对动物插管，通过夹闭冠状动脉左前降支使冠状动脉缺血40分钟，随后进行 再灌注。再灌注后2至6小时开始递送抗-proNGF（与在人体内的递送次数一致）。每日对 动物给药一次（或依据基于药理学研究的最佳方案）。在啮齿类动物中正在进行在缺血/再灌 注损伤后1、3、7、10天对proNGF的水平进行定量的研究，其能够指导治疗的持续时间。 使用三种方法确定效能。第一种，在3或10天处死一组动物，分析血液和心脏组织中的 proNGF水平（通过ELISA和Western印记）、p75和分拣蛋白/SorCS2脱落的外结构域（配 体结合和受体活化的标记物）、以及微血管标记物（Western印记）。第二种，在3或10天 处死一组啮齿类动物，对心脏进行组织学检查。其能够检查梗死尺寸，以及微血管的保护 （形态学评估）。最后一种，在第3天和第10天缺血再灌注后使用多普勒血流超声心动图 对一组啮齿类动物进行成像，以评估递送至壁动异常区域的抗-proNGF的功能性效应（与浓 度相等的同型匹配的非免疫性IgG进行比较）。在更大的哺乳动物（猪）中进行比较研究， 其一般用于心脏保护研究。

作为附加的分析，在proNGF“敲入”小鼠模型中进行了研究。ProNGF的免疫中和将阻 止在该动物中观察到的进行性心肌病。在这些研究中，使用抗-proNGF抗体对一组表达 proNGF的小鼠（2-4个月龄）进行两个月的治疗，进行多普勒成像以记录心脏功能的改善情 况，进行组织学分析以记录微血管的保护和proNGF表达的减少。

转化研究：

评估心肌缺血后人血浆中proNGF的水平。对人血浆中总NGF的水平进行检测，其与此 前的报道一致。利用贮存标本或在威尔医疗中心进行一项前瞻性研究，使用抗-结构域原抗体 开发一种定量ELISA，以确定人MI后诱导产生proNGE的程度。在急诊室中收集血液，在 支架/扩张后立即收集，然后连续4天每24小时收集一次，然后随访1至2周。可以将该分 析扩展至“生物标记物组”以评估p75脱落的结构域水平，将其作为临床试验的直接终点， 以及对心脏损伤进行常规评估（肌钙蛋白）。应注意，p75外结构域在人血浆中的存在水平 较低。在临床前模型中，配体结合后脱落的外结构域增加。

临床方法：

患者选择。仅考虑此前无心肌梗死史的患者（无既往病史，或既往压力测试或心脏成像 正常），以及无其他显著的合并症，且阳性症状出现/持续时间少于6小时（允许范围为2-6 小时）。必须对患者进行心脏插管评估，并且患者同意安装支架或扩张（无禁忌症）。

患者评估和药物递送。利用心脏导管插入术，必须证明患者的射血分数减少至少15%， 并伴有可辨识的冠状动脉损伤，局部壁动异常，无持续性的房性和室性心动过速，以及安装 支架/扩张后血流恢复。理想的，在再灌注后4-8小时内给予药物（抗-proNGF）或对照。

PK/PD研究。在24小时内每6小时评估一次生物标记物，随后连续4天每日一次，然后 在递送后1-2周一次。其包括对血浆中的proNGF（ELISA）和p75的脱落外结构域进行分析 （ELISA）。

效能分析。使用心脏MRI，用于评估功能性壁动异常的超声心动图对患者进行评估，在 递送2至4周后功能恢复。