猪流行性腹泻病毒的套式PCR扩增引物及其应用

摘要

本发明公开了猪流行性腹泻病毒的套式PCR扩增引物及其应用，属于动物病毒学及分子生物学技术领域。本发明的猪流行性腹泻病毒的套式PCR扩增引物，核苷酸序列如SEQIDNO:1~4所示。上述引物可用于制备检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，不但能够检测经典的PEDV，还能精确检测新型的变异毒株，且检测的灵敏度高，对于临床粪便、肠道内容物等样品都能方便、快捷地检测，有利于制定针对性的防控措施，对于改善PEDV防控效果，保证养猪生产平稳进行有较大的作用。

说明书

技术领域

    本发明涉及动物病毒学和分子生物学技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒的套式PCR扩增引物及其应用。

背景技术

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea, PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起的一种急性接触性肠道传染病，主要特征是腹泻、呕吐、脱水以及高死亡率（Pensaert et al., ,A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine. Arch Virol. 1978, 58(3): 243～247.；Ducatelle et al., Pathology of experimental CV777 coronavirus enteritis in piglets. I. Histological and histochemical study. Vet Pathol. 1982, 19(1):46～56.）。PEDV 是冠状病毒属的一个成员，未断奶仔猪最易感，且这段日龄猪群的致死率可以达到95%。

PEDV 属于冠状病毒属 I 群，是 RNA 病毒，基因组为单股正链，不分节段。基因组包含 6个开放读框(ORF)，从5′到3′顺序依次为ORF1（20346 nt）；S 基因（4152 nt）；ORF3 基因（675 nt）；E 基因（231 nt）；M 基因（681 nt）和 N 基因（1326 nt）（Kocherhans et al., Completion of the porcine epidemic diarrhoea coronavirus (PEDV) genome sequence[J].Virus Genes. 2001, 23(2): 137～144.; Brian et al., Coronavirus genome structure and replication. Curr Top Microbiol Immunol. 2005, 287: 1~30.）。

自2010年以来，一场大规模的PEDV流行在中国大陆发生，给养猪业造成了巨大的损失。有文献对此次流行的PEDV毒株及其基因进行了细致的分析（Pan Y et al., Isolation and characterization of a variant porcine epidemic diarrhea virus in China[J]. Virol J. 2012,Sep 12;9:195.），发现了变异毒株的与早前经典毒株相比S基因有一些不同的基因特征。

但目前还未有可以进行变异和经典猪流行性腹泻病毒鉴别区分的快捷方法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的上述问题，通过对猪流行性腹泻病毒S基因的分析，设计了两对引物，并建立了套式PCR方法，可以对变异和经典猪流行性腹泻病毒进行快捷的鉴别区分。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

本发明提供了猪流行性腹泻病毒的套式PCR扩增引物，核苷酸序列如下：

F1：CACTTAGCCTACCACAAGATGTCA（SEQ ID NO:1），

R1：TCATTATCCCATGTTATGCCGA（SEQ ID NO:2）；

F2：GGTGAAAACCAGGGTGTCAA（SEQ ID NO:3），

R2：TCGCGCAGTAGCATTAGTGTTA（SEQ ID NO:4）。

根据NCBI登陆的猪流行性腹泻病毒基因组序列，登录号：变异毒株（JN825712，JX088695，JX188454，JX489155，JX261936，JX112709，JX524137，JQ282909）和经典毒株（AF353511，EF185992，Z25483，JQ023161，JN547228）提供的信息，经过比对分析，设计了以上套式PCR的引物，使用上述引物进行套式PCR扩增，可以通过电泳鉴别经典株和变异株，省去测序的步骤，节省了时间和成本。

提取待检测样品中的RNA，经反转录后先使用引物F1和R1进行第一轮PCR，产物留一部分进行琼脂糖凝胶电泳，另一部分继续作为模板，以F2和R2为引物进行第二轮PCR，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后观察条带，如果第一轮PCR产物仅有一条458 bp的条带，第二轮没有，则表明待检样品中含有经典PEDV；如果第一轮PCR产物仅有一条467bp的条带，第二轮仅有一条201bp的条带，则表明待检样品中含有变异的PEDV；如果两轮PCR产物均没有条带，表明待检样品中不含PEDV。

本发明还提供了上述猪流行性腹泻病毒的套式PCR扩增引物在制备检测经典猪流行性腹泻病毒和/或新型猪流行性腹泻病毒的试剂中的应用。

本发明还提供了一种检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：

（1）反转录部分：

RT预混液1：随机引物和dNTP mix；

RT预混液2：5倍反转录缓冲液，RNA酶抑制剂，反转录酶，不含RNA酶的双蒸水；

（2）PCR部分：

外套PCR预混液：DNA聚合酶，引物F1和R1，无菌双蒸水；

内套PCR预混液：DNA聚合酶，引物F2和R2，无菌双蒸水。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一组套式PCR的扩增引物，该引物特异性和灵敏度都较高，且能够检测出变异的PEDV，可以对各种临床样品进行检测、鉴别，从而可以快捷的对流行的PEDV毒株进行区分，操作简单、实用。

附图说明

图1：样品检测电泳图，泳道1、2、3、4、5分别为PEDV经典株细胞培养液、PEDV变异株细胞培养液、肠道病料、粪便病料、DMEM。

图2：区分变异和经典猪流行性腹泻病毒的PCR特异性检验电泳图，A为第一轮PCR扩增产物电泳结果，B为第二轮PCR扩增产物电泳结果，泳道1为PEDV经典毒株，泳道2为PEDV变异毒株，泳道3-8分别为猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒。

图3：区分新型和经典猪流行性腹泻病毒的PCR方法灵敏性检验电泳图，图中所示为第一轮PCR扩增产物电泳结果，其中泳道1、2、3、4、5、6、7分别表示待检样品中cDNA含量为1.58μg、0.158μg、0.0158μg、1.58ng、0.158ng、0.0158ng、1.58pg。

具体实施方式

实施例1

（1）待检样品RNA提取：200μL细胞培养液（感染自主分离毒株CHGD-01，该毒株经鉴定为变异的PEDV）、200μL细胞培养液（感染自主分离毒株ShQT，该毒株经鉴定为经典PEDV）、100mg的肠道病料和100mg粪便（病料和粪便未知是否感染病毒）以及DMEM（细胞培养基，不含PEDV）作为待检样品，分别进行以下操作：

加入1mL PBS缓冲液进行充分研磨，-20℃反复冻融3次，8000 rpm 离心10 min，取上清液200μL，加入0.2mL氯仿，震荡混匀15s后在室温下（15℃～30℃）放置2～3min后，12000g（2℃～8℃）离心15min；取上层水相置于新EP管中，加入0.5mL异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10min，12000g（2℃～8℃）离心10min；弃上清，加入1mL 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5min，弃上清；让沉淀的RNA在室温下自然干燥后加入20μL Rnase-Free H₂O溶解，即为RNA模板。提取的RNA放于-80℃保存。

（2）提取的RNA加入到反转录预混反应液中进行反转录，得到cDNA模板。

反转录体系及过程：8μL的RNA与2μL RT预混液1混匀，65℃ 反应5min，然后迅速置于冰上2min。此反应混合溶液再加入到RT预混液2中，混匀后置于PCR仪上，按如下条件反应：30℃ 10min；42℃ 60min；70℃ 15min（无循环）。

其中，RT预混液1：Ramdom 9 mer（50μM）和dNTP mix（10mM）各1μL；RT预混液2：5×PrimeScirpt Buffer 4μL，Rnase Inhibitor(40U/μL) 0.5μL，PrimeScript Reverse Transcriptase（200U/μL）1μL，Rnase free H₂O 4.5μL，均购自大连TaKaRa公司。

（3）将2μL cDNA模板加入到外套PCR预混液中，配制25μL反应体系，并混合均匀。其中，外套PCR预混液：Premix Taq（包含DNA Polymerase1.25U/25μL；Buffer Tris-HCl, pH8.3 20mM，KCl 100mM，MgCl₂ 3mM；dNTP Mixture各0.4mM） 12.5μL，F1和R1（均为20pmol）各0.5μL，无菌双蒸水 9.5μL，均购自大连TaKaRa公司。

（4）将步骤（3）的PCR管置于PCR仪上进行第一轮循环扩增反应。扩增条件为：98℃预变性30s；然后98℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 1min共进行35次循环；最后72℃ 延伸10min。

（5）取2μL第一轮PCR产物作为模板，加入到内套PCR预混液中，配制25μL反应体系，混合均匀。内套PCR预混液：Premix Taq（包含DNA Polymerase1.25U/25μL；Buffer Tris-HCl, pH8.3 20mM，KCl 100mM，MgCl₂ 3mM；dNTP Mixture各0.4mM） 12.5μL，F2和R2（均为20pmol）各0.5μL，无菌双蒸水9.5μL，均购自大连TaKaRa公司。

扩增条件为：98℃预变性30s；然后98℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 1min共进行35次循环；最后72℃ 延伸10min。

（6）两轮PCR各取5μL反应产物在1%（质量比）的琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定。

（7）结果判定：第一轮PCR产物大小458bp（经典株）或467bp（变异株），第二轮PCR产物大小201bp。两轮PCR产物电泳同时有两条产物467 bp和201bp条带出现的即为变异株流行性腹泻病毒，有一条458 bp条带出现的为经典猪流行性腹泻病毒，无条带出现的为阴性。检测结果见图1和表1。

表1 待检样品检测结果

待检样品电泳条带扩增结果序列鉴定细胞培养液（感染毒株CHGD-01）467bp和201bp变异株细胞培养液（感染毒株ShQT）458bp经典株肠道病料467bp和201bp变异株粪便467bp和201bp变异株DMEM细胞培养基无扩增条带无

实施例2 特异性检验

  以存在流行性腹泻病毒的经典株（毒株ShQT）、变异株（毒株CHGD-01）的病料作为阳性对照，猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒的培养液进行特异性检测，使用实施例1的方法与引物，结果除阳性对照外均未能扩出任何条带，阳性病料经过两轮PCR分别扩出两个条带和一个条带，见图2。其序列分别为SEQ ID NO:5（变异株第一轮PCR扩增产物）、SEQ ID NO:6（经典株第一轮PCR扩增产物）和SEQ ID NO:7（变异株第二轮PCR扩增产物）。

实施例3 灵敏度检验

  用实施例1中经典株（毒株ShQT）提取得到的cDNA用灭菌双蒸水做10倍的梯度稀释，cDNA含量分别为1.58μg、0.158μg、0.0158μg、1.58ng、0.158ng、0.0158ng、1.58pg作为模板，每个稀释度各取2 μL作为模板，按实施例1 方法进行检测，观察阳性条带，以出现阳性预期条带所用模板量的最高稀释度计算其敏感性，结果表明最小检出量为0.16 ng，见图3。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  广东温氏食品集团股份有限公司

 

<120>  猪流行性腹泻病毒的套式PCR扩增引物及其应用

 

<130> 

 

<160>  7    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

cacttagcct accacaagat gtca                                            24

 

 

<210>  2

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

tcattatccc atgttatgcc ga                                              22

 

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

ggtgaaaacc agggtgtcaa                                                 20

 

 

<210>  4

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

tcgcgcagta gcattagtgt ta                                              22

 

 

<210>  5

<211>  467

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

cacttagcct accacaagat gtcaccaggt gctcagctaa cactaatttt aggcggttct     60

 

tttcaaaatt taatgttcag gcgcctgcag ttgttgtact gggcggttat ctacctattg    120

 

gtgaaaacca gggtgtcaat tcaacttggt actgtgctgg ccaacatcca actgctagtg    180

 

gcgttcatgg tatctttctt agccatatta gaggtggtca tggctttgag attggcattt    240

 

cgcaagagcc ttttgaccct agtggttacc agctttattt acataaggct actaacggta    300

 

acactaatgc tactgcgcga ctgcgcattt gccagtttcc cagcattaaa acattgggcc    360

 

ccactgctaa taatgatgtt acaacaggtc gtaactgcct atttaacaaa gccatcccag    420

 

ctcatatgag tgaacatagt gttgtcggca taacatggga taatgat                  467

 

 

<210>  6

<211>  458

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

cactcagcct accacaagat gtcactaggt gccagtctac tactaacttt aggcggttct     60

 

tttcaaaatt taatgttcag gcacctgccg tcgtcgtttt gggtggttac ctacctagta    120

 

tgaactcttc tagctggtac tgtggcacag gcattgaaac tgctagtggc gttcatggta    180

 

tttttctcag ctacatcgat tctggtcagg gctttgagat tggcatttcg caagagccgt    240

 

ttgatcctag tggttaccag ctttatttac ataaggccac taatggtaac actaatgcta    300

 

ttgcacgact gcgcatttgc cagtttcccg ataataaaac attgggccct actgttaatg    360

 

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gaaaagatat tgttgtcggc ataacatggg ataatgat                            458

 

 

<210>  7

<211>  201

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

ggtgaaaacc agggtgtcaa ttcaacttgg tactgtgctg gccaacatcc aactgctagt     60

 

ggcgttcatg gtatctttct tagccatatt agaggtggtc atggctttga gattggcatt    120

 

tcgcaagagc cttttgaccc tagtggttac cagctttatt tacataaggc tactaacggt    180

 

aacactaatg ctactgcgcg a                                              201