一种鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子复合热保护剂及其应用

摘要

本发明涉及免疫调节剂技术领域，特别涉及一种鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子复合热保护剂，由甘露醇、麦芽糖、壳聚糖、组氨酸、硫酸镁按重量比2:3:1:1:3混合而成。鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子复合热保护剂在鸡传染性支气管炎特异性转移因子制备中的应用。本发明的复合热保护剂，对鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子保护效果好，长期贮存只有很少的有效成分损失；鸡肾型传染性支气管炎转移因子溶液是一类细胞因子制剂，生物活性高，具有广谱增强免疫力、缓解疾病临床症状、提高疫苗免疫效果等作用，比化药类产品例如盐酸左旋咪唑活性高、作用迅速、剂量少、无残留。

说明书

技术领域    

本发明涉及免疫调节剂技术领域，特别涉及一种鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子复合热保护剂，还涉及所述的鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子复合热保护剂在鸡传染性支气管炎特异性转移因子制备中的应用。

背景技术   

鸡肾型传染性支气管炎是由病毒引起的一种急性、高度接触性的呼吸道传染病。其特征是病鸡咳嗽、流鼻液、打喷嚏和气管发出啰音;感染鸡生长受阻，耗料增加、产蛋和蛋质下降，死淘率增加，给养鸡业造成巨大的经济损失。本病是由鸡传染性支气管炎病毒感染引起的。该病毒具有多个血清型，各血清型均感染鸡而不感染其他家禽。各种年龄的鸡都可发病，但雏鸡最为严重，死亡率也高，一般以40日龄以内的鸡多发。本病主要经呼吸道传染，病毒从呼吸道排毒，主要通过空气中的飞沫传给易感鸡;也可通过被污染的饲料、饮水及饲养用具经消化道感染。本病一年四季均能发生，但以冬春季节多发。鸡群拥挤、过热、过冷、通风不良、温度过低、缺乏维生素和矿物质，以及饲料供应不足或配合不当，均可促使本病的发生。感染肾型支气管炎病毒后其典型症状分三个阶段。第一阶段是病鸡表现轻微呼吸道症状，鸡被感染后24~48h开始气管发出啰音，打喷嚏及咳嗽，并持续1~4天，这些呼吸道症状一般很轻微，有时只有在晚上安静的时候才听得比较清楚，因此常被忽视。第二阶段是病鸡表面康复，呼吸道症状消失，鸡群没有可见的异常表现。第三阶段是受感染鸡群突然发病，并于2~3天内逐渐加剧。病鸡沉郁、挤堆、厌食，排白色或水样下痢，粪便中几乎全是尿酸盐，迅速消瘦、饮水量增加。雏鸡死亡率为10%~30%，6周龄以上鸡死亡率在0.5%~1%。本病尚无特异的治疗方法，一般对症治疗效果也不确切。因此只能平时采取严格的饲养管理措施，搞好卫生，加强消毒，减少应激。

兽用细胞因子类产品具有作用剂量小、生物活性高、作用迅速、疗效确实等优点，因此该类产品具有广阔的市场前景。但目前开发研制技术尚未成熟，此类产品开发与研制正处于初始阶段，能在兽医临床大量应用的则更少。 

发明内容   

为了解决以上治疗鸡肾型传染性支气管炎的药物单一和药效不理想的问题，本发明提供了一种鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子（以下简称鸡特异性转移因子）的制备方法，制备的鸡特异性转移因子结合对症综合疗法以提高临床疗效。在2006年山东省30多个鸡场临床试验性治疗，取得了很好的效果。证明此方案能有效地控制鸡肾型传染性支气管炎病情并起到很好的治疗作用。

本发明是通过以下措施实现的： 

一种鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子复合热保护剂，由以下重量配比的原料混合而成：

甘露醇、麦芽糖、壳聚糖、组氨酸、硫酸镁按重量比2:3:1:1:3。

所述的鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子复合热保护剂在鸡传染性支气管炎特异性转移因子制备中的应用，包括以下步骤： 

（1）对每羽份健康家禽采用鸡传染性支气管炎活疫苗28/86株10倍剂量进行免疫，每个剂量病毒含量不低于1500ELD₅₀，7天后，再用鸡肾型传染性支气管炎活疫苗W93株20倍剂量肌注加强免疫，每个剂量病毒含量不低于2000ELD₅₀，同时用鸡肾型传染性支气管炎油乳剂灭活苗1.5mL皮下注射免疫，病毒含量为10^3.8TCID₅₀/0.1mL，10天后，再用鸡肾型传染性支气管炎油乳剂灭活苗1.5mL皮下注射免疫加强一次，病毒含量不低于10^3.8TCID₅₀/0.1mL，10-15天后测量抗体水平，当AGP法检测抗体水平达16以上后，剖杀动物采取新鲜脾脏、肾脏或法氏囊，组织粉碎、匀浆后在零下20℃-30℃反复冻融8次以上，每次冻16h、融8h一个循环共需24h，4000rpm离心，取上清，分子筛过滤，取分子量小于3000道尔顿部分；

（2）得到的分子量小于3000道尔顿的部分中，浓缩至水分含量为99wt%，每mL中加入0.2mg稳定剂山梨酸钾和0.3mg权利要求1所述的鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子复合热保护剂复合热保护剂，混匀后除菌，即得。

本品采用以鸡特异性转移因子为主要成分研制开发的新型生化类免疫增强剂。本品剂量小、生物活性高、能够有效提高畜禽的免疫力，同时能够提高疫苗的免疫水平、最大可能地消除免疫应激反应。而且本品为生化产品，无毒副作用、无残留，是一种高效无毒的绿色兽药。适用于防治鸡肾型传染性支气管炎；适用于畜禽免疫力低下，提高免疫力；适用于病毒病高发期，降低感染率及死亡率；适用于疫苗免疫效果不理想，能使疫苗免疫水平整齐、抗体高、有效抗体维持时间长；适用于应激反应，减少疫苗引起的呼吸道疾病等。 

用法与用量：混饮、口服、点眼或喷雾。每10ml用于1000羽家禽。 

有效期：4℃保存2年，-20℃冷冻保存5年。常温保存6个月。 

本发明的有益效果： 

1、本发明的鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子复合热保护剂，对鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子保护效果好，长期贮存只有很少的有效成分损失；

2、鸡肾型传染性支气管炎转移因子溶液是一类细胞因子制剂，生物活性高，具有广谱增强免疫力、缓解疾病临床症状、提高疫苗免疫效果等作用，比化药类产品例如盐酸左旋咪唑活性高、作用迅速、剂量少、无残留；比中药类作用迅速、使用方便、便于运输，为小分子物质，使用途径多，饮水、口服、点眼、滴鼻、注射等均可。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。 

实施例1：

一种鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子复合热保护剂，由以下重量配比的原料混合而成：

甘露醇、麦芽糖、壳聚糖、组氨酸、硫酸镁按重量比2:3:1:1:3。

鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子复合热保护剂在鸡传染性支气管炎特异性转移因子制备中的应用，包括以下步骤： 

（1）对每羽份健康家禽采用鸡传染性支气管炎活疫苗28/86株10倍剂量进行免疫，每个剂量病毒含量不低于1500ELD₅₀，7天后，再用鸡肾型传染性支气管炎活疫苗W93株20倍剂量肌注加强免疫，每个剂量病毒含量不低于2000ELD₅₀，同时用鸡肾型传染性支气管炎油乳剂灭活苗1.5mL皮下注射免疫，病毒含量为10^3.8TCID₅₀/0.1mL，10天后，再用鸡肾型传染性支气管炎油乳剂灭活苗1.5mL皮下注射免疫加强一次，病毒含量不低于10^3.8TCID₅₀/0.1mL，10-15天后测量抗体水平，当AGP法检测抗体水平达16以上后，剖杀动物采取新鲜脾脏、肾脏或法氏囊，组织粉碎、匀浆后在零下20℃-30℃反复冻融8次以上，每次冻16h、融8h一个循环共需24h，4000rpm离心，取上清，分子筛过滤，取分子量小于3000道尔顿部分；

（2）得到的分子量小于3000道尔顿的部分中，浓缩至水分含量为99wt%，每mL中加入0.2mg稳定剂山梨酸钾和0.3mg鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子复合热保护剂复合热保护剂，混匀后除菌，即得。4℃冷藏或-20℃冷冻保存。

动物实验

一、鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子促进雏鸡细胞免疫实验

1试验材料

1.1试验动物：3日龄健康雏鸡200只。

1.2试验药品：鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子溶液，规格为10ml/瓶，含有鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子50mg。 

1.3饲料：雏鸡全价配合饲料。 

1.4化学试剂：淋巴细胞分离液、2.5%戊二醛、副品红溶液、4%亚硝酸钠溶液、六偶氮副品红溶液、醋酸萘酯溶液、磷酸盐缓冲液、甲基绿染色液等，均购自有关单位或自行配制。 

1.5主要仪器：血球计数板、六位数分类计数器、双目生物显微镜等。 

2试验方法 

2.1试验分组：将试验用鸡随机分成A、B、C、D、E五个组，每组40只。A、B为试验组，C、D对照组，E组为空白对照组。A组每只鸡注射0.05毫升鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子溶液，B组每只鸡口服0.05毫升的鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子溶液，C组口服0.05毫升的生理盐水，D组注射0.05毫升的生理盐水，E组不作任何处理。

2.2试验方法：A、B、C、D、E五组7日龄免疫前12小时按照分组分别使用本发明制备的鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子和生理盐水， 分别于第14天、21天时采血进行细胞计数，并求其平均值。具体方法参见有关免疫学试验方法（ANAE法）。 

3试验结果：T、B淋巴细胞计数结果见表1。从表中可以看出，14日龄雏鸡的外周血TC值，A、B、C、D、E组的平均TC值分别为57.189%、53.368%、34.337%、35.201%、33.327%。经统计处理表明，各试验组TC值与对照组相比提高显著（t＞1.96，P＜0.05）。 

   21日龄雏鸡的外周血TC值，A、B、C、D、E组的平均TC值分别为66.115%、61.489%、38.372%、39.481%、36.236%。经统计表明各试验组TC值与对照组相比提高非常显著（t＞2.57，P＜0.01）。 

表1鸡血液中T、B淋巴细胞比例统计表（ANAE染色法） 

注：本结果为重复试验时测得，试验重复为6采取的是随机区组试验的新复极检验。数字后标注字母表示显著性检验结果：凡有相同字母者，差异不显著；大写字母表示0.01显著水平；小写字母表示0.05显著水平。

4结论与讨论 

4.1本试验结果显示，两个试验组与对照组T淋巴细胞百分率差异显著（P＜0.05），证明鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子溶液对T细胞值具有明显的提高作用。鸡肾型传染性支气管炎转移因子溶液中含有生物活性的小肽，当其进入机体内能够提高免疫系统的功能，而T淋巴细胞作为免疫细胞的一种，也得到一定程度的提高，因此试验组T细胞百分率较对照组高，且差异显著。

4.2注射组和口服组T细胞比例相差不显著，证明注射和口服鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子溶液的效果相同。由于该溶液含有小肽，通过注射途径其被机体吸收的速度较快作用于机体，因此注射组会促进T细胞比例升高。小肽分子量较小（低于10000道尔顿），能够不被胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、DNA酶和RNA酶等分解，因此当其进入体内时会能够快速被肠道吸收，进入血液循环，从而作用于免疫系统，所以口服组T细胞比例也会升高。注射与口服途径吸收利用有效成分的速度均较快，因此在临床上表现为两者促进免疫的效果相当，差异不显著，因此该免疫增强剂使用较为方便。 

4.3鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子溶液具有较高生物活性，其作用机理与化学类免疫增强剂（例如盐酸左旋咪唑等）存在较大差异。鸡肾型传染性支气管炎转移因子溶液为动物机体内正常存在的物质，正常状态下其浓度较低，当浓度提高后，其生物活性表现相当显著，能够在较短时间内提高机体免疫应答反应的强度及速度，因此生物活性优势较传统化学类免疫增强剂很显著，是很具有发展前途的生物免疫增强剂。 

二、鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子对鸡肾型传染性支气管炎的治疗实验

1材料与方法

1.1材料

1.1.1鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子，本研究室制备，冷冻保存。

1.1.2鸡转移因子，购于市场，天津瑞普动物保健品有限公司生产，冷冻保存。 

1.1.3盐酸多西环素可溶性粉、口服补液盐、干扰素等购于市场。 

1.1.4供试鸡的选择供试鸡分别选择自然发病第二天鸡群的商品鸡病鸡，随机选择病鸡、死鸡，解剖和实验诊断均符合病理变化特征的鸡群为供试鸡。分为3组，每组均为500只，饲养管理环境条件相似。 

1.2方法 

1.2.1将鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子及鸡转移因子取出，按照10mg/ml浓度稀释，无菌分装，4℃保存备用。

1.2.2诊断：根据临床症状和病理剖检变化，并结合实验室诊断，可确认此病为鸡肾型传染性支气管炎。 

1.2.3治疗试验：试验分3组， 

第1组治疗方案为选用家禽基因工程干扰素进行治疗，配合使用盐酸多西环素可溶性粉等抗生素药物控制继发感染。同时，使用复方口服补液盐补充机体内钠、钾损失和消除肾脏炎症或饮水中添加复合多维等，提高禽只抵抗力，连用3天。

第2组为在第1组方案的基础上+鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子，鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子使用剂量为每1000只鸡使用10ml。 

第3组为在第1组方案的基础上+鸡转移因子，鸡转移因子每1000只鸡使用10ml。 

2结果 

从试验结果可以看出，各试验组对鸡肾型传染性支气管炎有较好的治疗作用，在用药的第二天就能显效，第三天内就基本控制了病情，病鸡停止死亡，其中第二组存活率达93.6%，第三组存活率达90.2%，第一组存活率为82.2%，差异显著(P<0.05)，见表2。

表2对鸡肾型传染性支气管炎的治疗效果

组别试验鸡发病日龄发病后5天内死亡数存活数治愈率第1组500羽16天89羽41182.2%第2组500羽16天32羽46893.6%第3组500羽16天49羽45190.2%

3临床扩大治疗效果

根据试验结果，采用鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子方案对临床暴发的鸡肾型传染性支气管炎进行扩大试验，据统计治疗32126只，治疗康复29681只，治愈率达92%以上。用药后第二天就可以控制死亡，第三天就可以好转，第四天后能渐渐恢复食欲，一周后基本可以康复。

4分析与讨论 

4.1鸡肾型传染性支气管炎是一种免疫抑制性、高度接触性传染病，多年来一直困扰着养鸡业，给养鸡业带来致命性危害。雏鸡的肾脏受到侵害时，机体产生免疫抗体的能力减退或消失，代谢物排出存在问题，从而导致免疫抑制，使幼鸡群对疫苗接种的免疫应答反应下降，患病鸡容易并发感染其它病毒病或细菌病，如鸡新城疫、马立克氏病、大肠杆菌病、沙门氏菌病和球虫病等，给养鸡业造成巨大的经济损失。所以，平时一定要加强对该病的预防和控制。

4.2根据本病致病的原因是因为损害肾脏，所以首要问题是要从缓解肾脏衰弱，化解、排除有形物质，疏通尿路，控制死亡着手。因为鸡鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子对病理组织不但具有再生与修复作用，还能提高机体全方位的免疫力，所以使用该制剂后具有迅速控制病鸡死亡，病程短、恢复快等特点，充分显示出生化产品防治动物疾病的优势。 

4.3鸡鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子具有增强机体免疫作用，对鸡肾型传染性支气管炎的症状具有选择性和针对性的作用。药理学研究证明，鸡鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子是一种免疫活性物质，能提高免疫原性能，具有增强机体网状内皮系统的吞噬功能，此外，还能提高免疫器官的重量，提高白细胞总数及淋巴细胞数，增强抗体形成能力。因此，在生产实际中有很好的推广应用价值。 

三、贮存稳定性实验

产品的稳定性是保证用药安全有效的基本条件，尤其是多肽氨基酸类产品，在水中有效含量下降较快，因此稳定性试验是该课题研究的一个重要课题。影响制剂稳定性的因素，除其处方、工艺等因素外，还有温度、光、湿度等因素。因此，对该产品进行了影响因素试验、加速试验、室温长期留样考察试验。

1.1样品：选择符合鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子溶液质量标准的三批样品作为稳定性的样品；对照品为甘露醇：麦芽糖：壳聚糖（重量比2:3:1）保护的鸡肾型传染性支气管炎特异性转移因子样品。 

1.2贮存时间及条件 

1) 影响因素试验：

A.高温高湿试验：将上述样品与对照品分别置于市售包装中置温度40±2℃，相对湿度75%条件下3个月，每一个月检测一次。

B.光照试验：将上述样品与对照品分别放置于光照箱内，设置光照度4500±500Lx，温度为25℃条件下10天，分别于第1天、3天、5天、10天取样检测一次。 

2）长期实验：将上述样品与对照品分别置于市售包装中置温度25±2℃，相对湿度60％条件下8个月，分别于0、2、4、6、7、8个月取样检验一次，以确定药物有效期。 

1.3测定指标及方法： 

检验项目：外观；Folin酚法测定多肽含量。

1.4、试验结果： 

1）影响因素试验结果：

表3在高温高湿实验条件下贮存结果统计表

表4在光照实验条件下贮存结果统计表

2）长期试验结果

表5在常温实验条件下长期贮存结果统计表

1.5  试验结论：

样品与对照品经影响因素试验、加速试验、室温长期留样考察试验观察，样品质量稳定，外观性状、含量均符合要求，而对照品质量稳定性稍差。