一种通过检测血清中骨钙素含量来预测优秀冰雪运动员身高的分子生物学方法

摘要

本发明公开了一种预测优秀冰雪运动员身高的分子生物学方法。本发明通过酶联免疫吸附技术检测并比较了优秀冰雪运动员和普通人血液中骨钙素的表达量，骨钙素通过对成骨细胞的作用进而影响人的身高，因此，骨钙素的表达水平可以间接地预测优秀冰雪运动员的最适身高。结果显示，通过酶联免疫吸附技术检测优秀冰雪运动员血清中骨钙素浓度为1.50±0.76nmol/L相对普通人血清中骨钙素浓度1.48±0.58nmol/L较高。说明血清中相对较高的骨钙素含量可以作为衡量优秀冰雪运动员的最适身高。本发明为建立该项目运动员潜能的早期预测、评定、选材和育材的科学体系打下坚实的理论和技术基础，提升选材的成功率，突破一次性选材的理论和技术难关。

说明书

技术领域

本发明涉及一种预测优秀冰雪运动员身高的分子生物学方法。适合于优秀冰雪运动员在 蛋白水平上的早期选材，属于体育科学与生命科学交叉的学科领域。

背景技术

运动员的成长过程中伴随着身体形态的变化，对运动员身体形态尤其是身高的研究 是体育科学研究中基础而又重要的一个环节。我国优秀冰雪运动员身高特征的研究结 果，将有助于完善、系统的科学研究体系的建立，同时对构建科学、系统的我国优秀冰 雪运动员的高模型起到积极作用，并为今后的身体机能、技战术、心理以及形成系统的 研究体系奠定一定的理论基础。

自1998年长野冬季奥运会短道速滑由表演项目正式获准成为比赛项目以来，该项目 的6枚金牌倍受冰雪强国瞩目。短道运动员的选材和育材也理所当然的受到关注。身高 作为身体形态的一个主要方面，有哪些特点，顶尖选手和非顶尖选手之间的身高是否有 差别，根据项目的特点，究竟哪种身高更为适宜，此前曾有过专门研究，但随着时间的 推移，该项目水平的提高，运动员的身高又有哪些新的特点，需要我们进一步做出更科 学的研究和推断，探讨当今世界优秀冰雪运动员的身高特征会对我国的该项目的选材和 育材方面有一定的参考价值。

由于我国对优秀冰雪运动员最适身高的研究起步比较晚，而且冰雪运动员的育材和 选材大部分都是靠经验，没有建立在生命科学的基础上。近些年来，随着体育科学和生 命科学的飞速发展及两者在理论、方法、技术和手段上的相互交叉和渗透，强有力地推 动者冰雪运动员早期选材向着科学化和系统化的方向转型和发展。因此，有必要建立一 套完善的、科学的、系统的分子生物学方法，从分子水平上有效地预测优秀冰雪运动员 的最适身高。

骨钙素(Osteocalcin)又名骨谷氨酸蛋白(Bone gla protein，BGP)，BGP主要由骨和牙 齿中的成骨细胞合成并分泌，是体内最丰富的非胶原骨基质蛋白，经肝脏和肾水解，最后由 肾排除。1975年，科学家们分别从鸡和牛骨骼中首先提取到BGP后，人们在其他脊椎动物 上如猴、犬、马、硬骨鱼等骨骼中也发现了BGP。各种属BGP具有很高的保守性，由49～ 51个氨基酸组成，在21、24和27位有3个γ-羧基谷氨酸(γ-carboxyglutamic acid，Gla)， 分子量小，约6ku，具有3个Gla。BGP具有特殊的翻译后修饰，其基因首先翻译合成骨钙 素原蛋白，去除信号肽后，骨钙素原蛋白在维生素K羧基化酶作用下，3个γ-谷氨酸(glutamic  acid，Glu)羧基化为γ-羧基谷氨酸，羧基化后的BGP与羟基磷灰(hydroxyapatite，HA)具有很 强的吸附作用，既可沉积于骨骼，又可分泌入血液。在骨吸收发生时，分泌的酸性物质又使 羧基化的骨钙素脱羧释放入血液。因此，血液中含有多种骨钙素，包括完全羧基化骨钙素(total  carboxylated BGP)，未羧基化骨钙素或脱羧后骨钙素(uncarboxylated BGP)，降解的骨钙素片 段(small fragment osteocalcin)。BGP表达具有组织特异性，最初研究表明，BGP的mRNA 仅见于骨组织，由成熟的骨细胞合成并分泌，后来研究表明在骨髓巨核细胞和外周血小板也 可表达BGP。BGP的表达还具有发育阶段特异性，成骨细胞的成熟过程分为三个阶段，即成 骨细胞增殖期、细胞外基质成熟期及基质矿化期。只有在基质矿化期开始后，BGP基因才被 诱导表达。研究认为，BGP的主要功能是维持骨的正常矿化速率，抑制异常羟基磷灰石的形 成，抑制生长软骨矿化的速度，BGP与骨矿化同时出现，并随骨骼生长、羟磷灰石沉积而增 加。体外研究显示：BGP为成熟成骨细胞的标志物，BGP的产生随着矿化和成骨细胞分化而 增加。近期研究还提示：BGP能趋化、激活破骨细胞，BGP的羧化末端对破骨细胞的前体有 化学诱导作用，可调节骨吸收。BGP基因敲除的小鼠表现为骨形成和骨量增加，而骨吸收和 骨矿化并未受到影响，提示BGP可能抑制成骨细胞活性，成骨细胞上可能表达有BGP受体， 现已证实人成骨细胞上确实可表达BGP受体，并发现它属于G-蛋白偶联受体超家族成员， 与抑制性G-蛋白偶联，BGP通过与成骨性谱系细胞的BGP素受体结合而抑制成骨细胞的活 性。

BGP由成骨细胞合成和分泌，其大部分沉积在骨基质中，约20％进入血液循环，成骨细 胞活性以及成骨细胞合成和分泌BGP的能力，直接影响血清BGP水平。血清骨钙素(S-BGP) 是评估骨转换率及骨形成的特异性指标，其表达水平间接影响着冰雪运动员的身高。因此， 可以通过检测优秀冰雪运动员血清中BGP的含量来预测优秀冰雪运动员的最适身高，为冰雪 运动员选材提供一个最适的分子生物学标准。

目前已建立的BGP测定方法主要有：放射免疫法、化学发光免疫分析法、酶联免疫吸附 分析法(Enzyme linked immunosorbent analysis，ELISA)、亲和素-生物素酶免疫分析法和酶免 疫荧光法等。其中以放射免疫法应用最普遍，该方法灵敏度与特异性均较理想，批内、批间 变异小，回收率高，检测线性范围宽。化学发光免疫分析法、酶联免疫吸附分析法、亲和素- 生物素酶免疫分析法等方法操作简单、快速、微量、无放射性同位素污染与标记物蜕变等优 点，缺点是特异性较差，溶血或脂血对测定有干扰，定量不够准确。酶免疫荧光法(Pharmacia  CAP系统)测定灵敏度为0.5μg/L，特异性100％，适合临床推广。采用Elecsys2010测定血清 BGP、N-MID片段，是目前最先进的免疫分析法，它是由电化学和免疫学(双抗体夹心法)测定 相结合的产物。其产生的光子通过检测仪器测定光信号强度，光强度与待测物质浓度呈线性 关系，据此可测出BGP的含量。其优点为特异性强，灵敏度高，检测线性可达7个数量级；重 复性好；无放射性核素的污染；操作简单、快速。

骨是骨干和骨骺的积聚物，骺软骨区形成成骨细胞，然后由软骨变成骨头，身体因 此变高。骨钙素(osteocalcin)是成骨细胞的特异性表面标记物，通过ELISA技术对血液 中骨钙素进行检测，从而推断出软骨组织分泌骨钙素水平的差异情况，从分子生物学水 平上预测基因表达与身高的联系。

发明内容

本发明提供了一种在分子生物学水平上预测优秀冰雪运动员身高的方法。

本发明从分子生物学水平上预测了优秀冰雪运动员的最适身高，通过ELISA技术 检测血清中骨钙素含量比较和预测与身高的联系。方法简单，易操作。

具体实施方式

下面以优秀冰雪运动员血清中的分子标记骨钙素为例，通过检测其相对水平来详细 说明本发明的具体实施。

实施例：检测优秀冰雪运动员血清中的分子标记骨钙素的水平。

选取5名优秀冰雪运动员，每名静脉取血5ml，于抗凝管中备用(抗凝管编号为 01-05，设为5个重复)，设为实验组；选取5名普通人进行静脉取血，每名5ml，于抗 凝管中备用(抗凝管编号为06-10，设为5个重复)，设为对照组。

ELISA定量检测血清中骨钙素，具体方法如下：

1)上述骨钙素蛋白用PBS配成100μg/ml的溶液，按100μl/每孔加入96孔酶标 板，4℃过夜吸附；

2)次日将过夜包被的酶标板中未吸附的蛋白溶液倒掉，以PBS洗3次。加入3％ (质量百分比)BSA(用PBS配制不含Tween20)封闭，100μl/每孔，37℃，1.5h；

3)用PBS彻底洗2)中的沉淀4次后加入实验组血清或对照组血清(用PBS按体 积比为1∶100、1∶500、1∶2500、1∶12500或1∶62500稀释)，100μl/每孔，37℃，1.5h；

4)用PBS洗3)中的沉淀4次，加二抗(兔抗人IgG用PBS按体积比为1∶10000 稀释)，100μl/每孔，37℃，1h；

5)用PBS洗4)中的沉淀4次，加AP显色液P-NPP(2mg/ml)，80μl/每孔，避 光反应，加等体积0.2M NaOH终止反应；

6)取100μl5)中终止反应后的溶液100μl，用酶标仪测定405nm下的OD值， 并根据标准曲线，求出血清中BGP的含量。

实验组和对照组的测定结果比较其差异，并取实验组结果的平均值作为实验结果。 实验组测定结果显示，实验组血清中的BGP浓度为1.50±0.76nmol/L相对对照组血清 中BGP浓度1.48±0.58nmol/L较高。