一种利用发根农杆菌获得矮化早金甜橙再生植株的方法

摘要

本发明公开了一种利用发根农杆菌获得矮化早金甜橙再生植株的方法，根据发根农杆菌转化再生的植株通常具备株型矮化的特点，利用发根农杆菌MSU440转化多胚品种早金甜橙，诱导出毛状根后通过毛状根生芽及再生芽生根途径获得完整再生植株，最终培育出适合省力栽培的矮化品种，从而提高了果园劳动效率，降低了劳动消耗。本发明转化受体材料为早金甜橙无菌苗上胚轴，由于甜橙为多胚品种，因此再生植株可以保留亲本的优良品质。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用发根农杆菌获得矮化早金甜橙再生植株的 方法。

背景技术

柑橘是世界重要果树，具联合国粮农组织统计（FAO），2009年世界柑橘种植面积达到 871.9万公顷，总产量约1.24亿吨；同期我国柑橘种植面积约为200万公顷，产量达0.25 亿吨，均居世界第一位。然而，随着我国城镇化建设的发展，农村劳动力大量转移，柑橘生 产劳动力成本提高，影响果农生产积极性；此外，橘园劳动者日趋老龄化，只有发展简化栽 培的模式才适合农村柑橘产业发展。

培育矮化栽培品种，可方便果实采收及日常栽培管理，减少劳动强度，为柑橘简化栽培 提高资源。发根农杆菌为革兰氏阴性菌，可通过侵染植物伤口将Ri质粒上T-DNA整合入宿 主核基因组，并诱发毛状根的产生；由毛状根再生的植株通常具有节间短缩和植株矮化的表 型，这在苹果砧木山定子的毛状根再生植株中已经得到证实（武姣等.2008.发根农杆菌介导 山定子遗传转化及发根再生植株.园艺学报，35（7）：959－966.）。发根农杆菌应用于柑橘遗 传改良的研究报道较少，利用发根农杆菌诱导柑橘产生毛状根，建立柑橘中毛状根植株再生 方法，培育出矮化品种，可为新形势下农村柑橘生产简化栽培和省力栽培模式的发展提供品 种资源上的支持。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种利用发根农杆菌获得矮化早金甜橙再生植株的方法。 本发明主要针对我国柑橘生产劳动力不足、劳动力成本较高，而柑橘价格却徘徊不前的现状， 根据发根农杆菌转化再生的植株通常具备株型矮化的特点，提出利用发根农杆菌MSU440 转化多胚品种早金甜橙，诱导出毛状根后通过毛状根生芽及再生芽生根途径获得完整再生植 株，最终培育出适合省力栽培的矮化品种，从而提高了果园劳动效率，降低了劳动消耗。本 发明转化受体材料为早金甜橙无菌苗上胚轴，由于甜橙为多胚品种，因此再生植株可以保留 亲本的优良品质。

为了达到上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种利用发根农杆菌获得矮化早金甜橙再生植株的方法，包括以下步骤：

1.早金甜橙无菌苗准备：

早金甜橙果实中取出种子，自来水冲洗干净后于1M NaOH溶液中浸泡10min，流水冲 洗去除果胶；采用3％（v/v）的次氯酸钠溶液浸泡消毒15-20min，剥去内外种皮后播种于 MT播种培养基上，24-26℃暗培养4四周后，取出1500－2000lx光照5－7d，待稍转绿后 挑选健壮无菌苗用于转化。

2.发根农杆菌菌液准备：

取-80℃保存的发根农杆菌MSU440菌株在LB固体培养基上划线，28℃暗处倒置培养 36－48h获得活化单菌落，挑取活化的发根农杆菌单菌落，LB固体培养基上再次划线，28℃ 暗培养36－48h，用手术刀片刮取培养好的菌体于MT悬浮培养基中，180rpm、28℃振荡培 养1.5－2h后将菌液OD₆₀₀值调至0.6－0.8后待用。

3.外植体侵染与毛状根诱导：

切取上胚轴切段在农杆菌菌液中侵染20-30min，灭菌滤纸上吸干，转至MT共培养基上， 21℃暗处共培养3d，将外植体用无菌水漂洗3次，滤纸吸干后转接于含400μg/L头孢霉素 的MT基本培养基上24-26℃暗处诱导毛状根并除菌。本发明中毛状根诱导培养基中不添加 激素。

4.毛状根继代培养：

毛状根伸长至2cm左右时，切下1-1.5cm带根尖切段继代至含400mg/L头孢霉素的MT 基本培养基上，20d左右继代1次，24-26℃暗处连续继代培养2-3次后基本可脱除残留的 农杆菌。

5.毛状根生芽：

将毛状根切成1cm左右切段，转至生芽培养基上，24-26℃，每日16h光照（1500－2000lx） 8h暗处理条件下下诱导生芽。在生芽培养基上毛状根首先形成致密胚状体，之后发育出丛 生芽。

6.再生芽伸长：

再生芽体生长至0.5－1cm时，转至芽伸长培养基上，以促进芽体的迅速伸长。

7.再生芽生根：

芽体生长至1.5cm左右时，单独切离转至MT生根培养基诱导生根。两周左右可见切口 发出不定根。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明的有益效果是：选取的无菌苗上胚轴是发根农杆菌良好受体，毛状根再生芽时会 产生大量丛生芽，从而可获得大量无性系后代;再生芽生根容易，且根系发达，练苗后移栽 容易存活;由于毛状根通常为单细胞起源，因此再生植株不存在嵌合体，遗传稳定；此外， 发根农杆菌转化再生的早金甜橙植株矮化明显，毛状根再生植株移至温室六个月后株高（茎 尖至根茎交界处）平均为5.1cm，而对照（同时期非转化再生植株）株高平均为10.1cm；毛 状根再生植株叶片形态正常，生长健壮;‘早金’甜橙为多胚品种，因此毛状根再生矮化植 株可以保留亲本的优良品质，可作为矮化育种的资源。

附图说明

图1为一种毛状根诱导示意图。

a为未侵染对照；b发根农杆菌侵染后产生的毛状根。

图2为一种毛状根切段再生丛生芽示意图。

图3为一种丛生芽伸长示意图。

图4为一种再生芽生根示意图。

图5为一种再生植株根系比较CK为未转化对照示意图。

T为转化毛状根再生植株

图6为一种再生植株株形比较a为侧面，b为正面示意图。

CK为非转化对照；T为转化毛状根再生植株

具体实施方式

现对本发明方法各步骤进一步详细描述如下：

实施例1：一种利用发根农杆菌获得矮化早金甜橙再生植株的方法，包括以下步骤：

1.外植体准备：

早金甜橙果实采自华中农业大学柑橘育种中心。柑桔果实中取出种子，自来水冲洗干净 后于1M NaOH溶液中浸泡10min，去除果胶后蒸馏水冲洗干净；超净台上3％（v/v）的次 氯酸钠溶液浸泡20min，灭菌蒸馏水清洗3次，每次5min；消毒后的种子在超净工作台上 用无菌手术刀和镊子剥去内外种皮后播种于MT播种培养基上，24-26℃暗培养4W后，取 出光照5－7d，待稍转绿后挑选健壮无菌苗将上胚轴切成1.5cm左右，待用；

2.发根农杆菌菌液准备：

取－80℃保存的发根农杆菌MSU440（Limpens E等，RNA interference in Agrobacterium  rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula.J Exp Bot.2004 May;55(399):983-92）菌株在LB固体培养基上划线，28℃暗处倒置培养36－48h获得单菌 落，挑取单菌落于新的LB固体培养基上再次划线，同样条件下培养36－48h，用手术刀片 刮取所有菌体于MT悬浮培养基中，180rpm，28℃振荡培养1.5－2h后将菌液OD₆₀₀值调整 至0.6－0.8后待用。

3.外植体侵染与毛状根诱导：

上胚轴切段在农杆菌菌液中侵染20-30min，期间摇匀2-3次；侵染结束后将外植体在灭 菌滤纸上吸干，转至MT共培养培养基上，21℃暗处共培养3d后将外植体用无菌水漂洗3 次，滤纸吸干后转至含400μg/L头孢霉素的MT基本培养基（Murashige T,Tucher DPH.Growth  factor requirement of citrus tissue culture.Proc1st Int Citrus Symp1993,3:1155-1169）上，24-26℃ 暗处诱导毛状根并除菌:。对照材料用不含农杆菌的MT悬浮培养基侵染，其余处理相同。 因毛状根本身可合成激素，可在未添加激素的MT基本培养基上自主生长，因此本发明中毛 状根诱导培养基不添加激素。

发根农杆菌MSU440侵染早金上胚轴切段8-10d后，从切口处产生白色愈伤组织并陆续 发出白色毛状根，毛状根多数从上胚轴切段的基部（形态学下端）发出，未侵染对照无毛状 根发出（图1）。

4.毛状根继代：

毛状根伸长至2cm左右时切下1-1.5cm带根尖切段继代至含400mg/L头孢霉素的MT 基本培养基上，部分毛状根可继续伸长；选取生长良好的毛状根，20d左右继代1次，24-26℃ 暗处连续继代培养2-3次后基本可脱除残留的农杆菌。

5.毛状根生芽：

将毛状根切成1cm左右切段，转至生芽培养基上，24-26℃，每日16h光照（1500－2000lx） 8h暗处理条件下下诱导生芽。毛状根切段暴露在光照条件下一周左右可转绿，约20d左右 陆续出现绿色芽点，并形成丛生芽（图2）。通过毛状根生芽的方式可以产生大量无性系转 化克隆，为后续研究提供大量遗传背景一致的材料。

6.再生芽伸长：

当丛生芽生长至0.5－1cm时，切取分离丛生芽转至芽伸长培养基上，以促进芽体的迅 速伸长（图3a、b）。

7.再生芽生根：

再生芽伸长至1.5cm左右时将芽体单独切离转至MT生根培养基诱导生根，约20d左右 可见切口出发出不定根。

8.再生植株培育：

当再生植株根系较为发达，植株生长健壮时（图4），取出植株，洗净附着的培养基以 免后续练苗出现霉菌污染（图5），24-26℃，每日16h光照（1500－2000lx）8h暗处理条件 下蒸馏水中练苗7d左右，转至灭菌后基质，室内基质练苗3天左右移至温室。毛状根再生 植株与对照比较表现为根系更为发达、侧根增多（图5）、节间短缩、株形矮化等特征，但 叶片形态正常（图6a、b）。

所述的基质为蓓蕾培养基质（江苏镇江蓓蕾有机肥有限公司生产）

实验中用到的培养基如下，其中MT培养基pH值均为5.85；LB溶解后可不调pH值：

MT播种培养基：MT+25g/L蔗糖+8g/L琼脂

MT悬浮培养基：MT+0.5g/L麦芽提取物+1.5g/L谷氨酰胺+40g/L蔗糖+20mg/L乙酰丁 香酮

MT共培养培养基：MT+40g/L蔗糖+8g/L琼脂+20mg/L乙酰丁香酮

毛状根诱导培养基：MT+40g/L蔗糖+8g/L琼脂+400mg/L头孢霉素

毛状根生芽培养基：MT+40g/L蔗糖+8g/L琼脂+1mg/L BA

芽伸长培养基：MT+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+0.1mg/L BA+0.1mg/L IAA+0.25mg/L GA₃

MT生根培养基：1/2MT+25g/L蔗糖+8g/L琼脂+0.5mg/L NAA+0.1mg/L IBA+0.5g/L活 性炭

LB固体培养基：酵母提取物5g/L，胰化蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L。