一种检测抗肿瘤药物抑制肿瘤细胞和血小板粘附的活性的方法

摘要

本发明涉及生物化学领域，公开了一种检测抗肿瘤药物抑制肿瘤细胞和血小板粘附的活性的方法。该方法用荧光标记探针标记血小板，然后分别与未经抗肿瘤药物处理的肿瘤细胞和经抗肿瘤药物处理的肿瘤细胞孵育，于流式细胞仪上采用FL1通道检测肿瘤细胞荧光率获得对照组荧光率和药物处理组荧光率，将两者进行显著性差异分析获得检测结果。本发明采用悬浮状态的肿瘤细胞和未活化的血小板进行检测，符合真实的肿瘤细胞与血小板粘附过程，在粘附实验前通过细胞计数调整细胞密度保证加药处理的细胞与对照组细胞密度一致，且通过流式分析软件设定检测细胞数目，保证不同预处理组检测的细胞数目一致，避免不同预处理对肿瘤细胞数目的影响，结果更加准确。

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种检测抗肿瘤药物抑制肿瘤细胞 和血小板粘附的活性的方法。

背景技术

肿瘤的侵袭和转移是一个复杂的多步骤多因素过程，包括肿瘤细胞分泌 酶解周围基质，从原发灶解离，进入血液循环，在血流中存活并穿出血管壁， 继而形成转移灶的一系列过程。肿瘤细胞在血液循环中不可避免地与血液中 的成分相互作用，而血液中的免疫细胞可清除肿瘤细胞，但血小板则能促进 肿瘤细胞的转移。有研究发现，肿瘤患者常伴有血小板升高，抗血小板治疗 可抑制肿瘤转移。

肿瘤细胞与血小板的相互作用在肿瘤转移过程中的作用主要体现在以下 几方面：1、血小板粘附于肿瘤细胞表面，遮挡由血流剪切力引起的机械损伤， 并帮助肿瘤细胞逃避机体免疫系统的攻击，从而促进肿瘤细胞在血流中存活； 2、粘附于肿瘤细胞表面的血小板，可同时粘附血管内皮细胞并导致血管内皮 细胞收缩，从而促进肿瘤细胞在远隔部位的血管中停留下来，并穿出血管到 达转移部位；3、血小板可释放血小板衍生生长因子、血管内皮细胞生长因子 等细胞因子，可刺激肿瘤细胞的生长，以及肿瘤血供的形成。

因此，检测抗肿瘤药物对肿瘤细胞与血小板的粘附能力的影响程度对于 评价其是否具有抑制肿瘤细胞转移和侵袭能力至关重要。目前常用的方法主 要是，将肿瘤细胞种于细胞培养板中，待细胞完全贴壁，并完全融合后用待 检测的抗肿瘤药物处理，将荧光或同位素标记过的血小板加入培养板中，孵 育一定时间后，漂洗去除未粘附于肿瘤细胞的血小板，加入裂解液裂解细胞 和血小板后，检测培养板中的荧光或同位素水平相对于未经抗肿瘤药物处理 的荧光或同位素水平是否有所降低，反映待检测药物是否具有抑制肿瘤细胞 与血小板粘附的活性，从而评价其在抑制肿瘤细胞侵袭和转移中的作用。

但目这种检测技术存在一定的局限性，主要体现在以下几方面：⑴无法 模拟肿瘤细胞与血小板粘附的真实过程，肿瘤细胞处于贴壁状态，而在体内 的血流环境中，肿瘤细胞处于悬浮状态，因此该方法不能反应真实的肿瘤细 胞与血小板粘附过程；⑵实验操作复杂，需预先将细胞种于培养板，并使细 胞生长至完全融合，实验周期较长；⑶难以定量检测，某些抗肿瘤药物能够 杀死肿瘤细胞或使肿瘤细胞无法贴壁，如此造成药物处理组和对照组的肿瘤 细胞数目不一致，无法真实反映是否是由于抑制肿瘤细胞和血小板粘附而达 到的效果；⑷采用放射性同位素进行检查，造成辐射伤害和环境污染。因此 需要开发一种准确、简便、安全，并能模拟真实体内粘附过程的实验技术。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测抗肿瘤药物抑制肿瘤细胞和 血小板粘附的活性的方法，使所述方法更加安全、准确、简便。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种检测抗肿瘤药物抑制肿瘤细胞和血小板粘附的活性的方法，其特征 在于，包括以下步骤：

步骤1、将荧光标记探针与富血小板血浆孵育，然后离心并吸取底层的血 小板沉淀用血小板洗涤液洗涤，然后用血小板悬浮液重悬洗涤后的血小板， 接着向血小板重悬液中加入CaCl₂，然后调整血小板浓度为10-100×10⁶个/mL 以及CaCl₂浓度为1mM备用；

步骤2、将未经待检测抗肿瘤药物处理的肿瘤细胞设为对照组，经待检测 的抗肿瘤药物处理后的肿瘤细胞为药物处理组，两组细胞分别经胰酶消化处 理后用PBS洗涤，然后用肿瘤细胞悬浮液重悬得到对照组肿瘤细胞重悬液和 药物处理组肿瘤细胞重悬液，调整两组肿瘤细胞密度为5×10⁶个/mL备用；

步骤3、将步骤2得到的两组肿瘤细胞重悬液分别和步骤1得到的血小板 重悬液孵育，用多聚甲醛固定后于流式细胞仪上采用FL1通道检测肿瘤细胞 荧光率获得药物处理组荧光率以及对照组荧光率；

将试验组荧光率和对照组荧光率进行统计学显著性差异分析得到检测结 果。

其中，步骤1所述血小板浓度优选为30×10⁶个/mL。

本发明所述将试验组荧光率和对照组荧光率进行统计学显著性差异分析 得到最终结果，是指两者进行显著性差异分析，如果药物处理组的荧光率降 低且相对于对照组荧光率具有显著性差异则说明待测抗肿瘤药物具有抑制肿 瘤细胞和血小板粘附的活性，能够抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。

本发明所述肿瘤细胞在未经待测抗肿瘤药物处理前和对照组肿瘤细胞一 样按照正常的培养方法培养，所述处理是向肿瘤细胞培养液中加入药物，这 属于本领域公知处理方式。

本发明步骤1所述富血小板血浆（PRP）可按照常规方法从血液中提取， 在本发明实施例中按照如下方法提取：

抽取静脉血10mL，置于质量百分数为3.8%枸橼酸三钠抗凝剂（抗凝剂 与血样的体积比为l：9）的试管中。在室温下离心1000rpm、10min。待离心 机自然停止后取出，小心吸取上层血浆即为富血小板血浆（PRP）。

针对现有检测技术无法真实模拟肿瘤细胞和血小板粘附过程以及检测过 程中易出现较大误差的缺陷，本发明采用悬浮状态的肿瘤细胞和未活化的血 小板进行粘附实验，并通过流式细胞仪检测技术消除因肿瘤细胞的杀伤作用 导致的试验组和对照组细胞数量不一致的问题，符合真实的肿瘤细胞与血小 板粘附过程。

优选地，所述血小板洗涤液由以下方法制备获得：

3.60g NaCl，1.90g柠檬酸三钠，3.00g葡萄糖，溶于500ml双蒸水中，溶 解后调整pH值至6.5即得。

优选地，所述血小板悬浮液由以下方法制备获得：

血小板悬浮液原液5ml，1M HEPES125μL，20%葡萄糖250μL，1M MgCl₂50μL，0.05g BSA，用双蒸水定溶至50ml，溶解后调整pH值至7.4即得；

所述血小板悬浮液原液由8.00g NaCl，1.02g NaHCO₃，0.195g KCl溶于 100ml双蒸水中配制而成。

优选地，所述荧光标记探针为10μM的CFDA-SE、5-10μM的DiI、0.1-5μM 的Calcein-AM或3μM的BCECF-AM，更优选为10μM的CFDA-SE。为方便 配制，CFDA-SE可溶于二甲基亚砜（DMSO）配成10mM母液，在实际应用 中在再进行稀释使用，其他荧光标记探针均可以如此。

本发明采用CFDA-SE标记血小板，相对荧光抗体或同位素标记血小板的 技术，CFDA-SE的价格远比抗体和同位素低廉，而且CFDA-SE标记操作方 便。如果采用抗体标记血小板，需在洗涤血小板制备完成后再进行抗体标记， 抗体标记后需再次洗涤以去除多余的抗体，避免抗体直接结合肿瘤细胞。而 采用CFDA-SE标记血小板，标记的步骤在洗涤血小板之前，在洗涤血小板的 同时将多余的CFDA-SE去除，无需增加洗涤次数，简化了实验步骤，减少了 过多操作导致血小板活化的可能性。另外，CFDA-SE标记时间短，仅需5-10min 即可完成荧光标记，避免标记时间过长导致的血小板活化。同时CFDA-SE无 毒，避免同位素标记造成的环境污染。

作为优选，本发明所述肿瘤细胞悬浮液由以下方法制备获得：

1M CaCl₂50μL，1M MgCl₂50μL，0.05g BSA，用RPMI-1640培养液定溶 至50ml，溶解后调整pH值至7.4即得。

优选地，步骤1和步骤3所述孵育的时间均为10-15min。

优选地，步骤2所述PBS由以下方法制备获得：

称取8.00g NaCl，0.20g KCl，1.44g Na₂HPO₄，0.24g KH₂PO₄溶于1000ml 双蒸水中，溶解后调整pH值至7.4，高压灭菌后即得。

优选地，步骤2所述胰酶为质量百分比为0.25%的胰酶溶液。

优选地，所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞。

优选地，步骤3所述肿瘤细胞重悬液和血小板重悬液的体积比为1:4。

在准确度对比试验中，按照现有技术检测的药物处理组荧光值与对照组 荧光值无明显差异，通过荧光显微镜的观察可见培养板中出现了一些没有细 胞的空隙，这些空隙处在光镜下可见到血小板，表明现有技术检测的结果出 现误差，而采用本发明检测方法检测，细胞与血小板孵育后于流式细胞仪检 测，可见加抗肿瘤药物处理组细胞的荧光率下降，说明粘附于细胞上的血小 板减少。

本发明采用悬浮状态的肿瘤细胞和未活化的血小板进行粘附实验，符合 真实的肿瘤细胞与血小板粘附过程，由于采用悬浮状态细胞进行粘附实验， 可在粘附实验前通过细胞计数调整细胞密度，能保证加药处理的细胞与对照 组细胞密度一致，且通过流式分析软件设定检测细胞数目，保证不同预处理 组检测的细胞数目一致，避免不同预处理对肿瘤细胞数目的影响，结果更加 准确。同时，本发明在检测过程中无需培养板，细胞也不需要生长至完全融 合，检测周期大大缩短，所采用的荧光标记探针相对放射性同位素更加安全。

附图说明

图1所示为实施例1的流式细胞仪检测图谱；

其中，图1-A为对照组流式细胞仪检测图谱；图1-B为整合素α₂β₁封闭 性抗体处理组流式细胞仪检测图谱；图谱左上角为荧光率数值；

图2所示为实施例2的流式细胞仪检测图谱；

其中，图2-A为对照组流式细胞仪检测图谱，图2-B为药物处理组（斑 蝥素处理组）流式细胞仪检测图谱；图2-C为药物处理组（去甲斑蝥素处理 组）流式细胞仪检测图谱；图谱左上角为荧光率数值；

图3所示为实施例3现有技术荧光镜检图；

其中，图3-A为对照组荧光镜检图，图3-B为药物处理组（20μM斑蝥素 处理组）光学显微镜镜检图；图3-C为药物处理组（斑蝥素处理组）光学显 微镜镜检图矩形框放大部分；图3-D为药物处理组（200μM去甲斑蝥素处理 组）光学显微镜镜检图；图3-E为药物处理组（去甲斑蝥素处理组）光学显 微镜镜检图矩形框放大部分；

图4为实施例3本发明所述方法的流式细胞仪检测图谱；

其中，图4-A为对照组流式细胞仪检测图谱，图4-B为药物处理组（20μM 斑蝥素处理组）流式细胞仪检测图谱；图4-C为药物处理组（200μM去甲斑 蝥素处理组）流式细胞仪检测图谱；图谱左上角为荧光率数值；

图5为实施例3本发明所述检测方法不同药物处理后的肿瘤细胞荧光率 柱形图（基于图4结果获得）；

其中柱形1为对照组，柱形2为20μM斑蝥素处理组，柱形3为200μM 去甲斑蝥素处理组。

具体实施方式

本发明公开了一种检测抗肿瘤药物抑制肿瘤细胞和血小板粘附的活性的 方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需 要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的， 它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法及试剂盒已经通过较佳实施例 进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所 述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

以下就本发明所提供的一种检测抗肿瘤药物抑制肿瘤细胞和血小板粘附 的活性的方法做进一步说明。

实施例1：检测整合素α₂β₁封闭性抗体抑制乳腺癌细胞MCF-7和血小板 粘附的活性

为了验证本发明检测方法对抗肿瘤药物抑制血小板和肿瘤细胞粘附的活 性的结果准确性，本实施例选用整合素α₂β₁封闭性抗体对于重悬后的肿瘤细 胞处理来验证（整合素α₂β₁封闭性抗体与抗肿瘤药物处理肿瘤细胞的阶段不 同，其是在肿瘤细胞重悬后加入处理，而抗肿瘤药物是在肿瘤细胞培养时加 入处理，这是试剂本身性质带来的差异，仍是基于本发明检测方法的核心原 理）。

1、相关试剂配制

肿瘤细胞悬浮液：1M CaCl₂50μL，1M MgCl₂50μL，0.05g BSA，用 RPMI-1640培养液定溶至50ml，溶解后调整pH值至7.4即得

血小板洗涤液：3.60g NaCl，1.90g柠檬酸三钠，3.00g葡萄糖，溶于500ml 双蒸水中，溶解后调整pH值至6.5即得；

血小板悬浮液：血小板悬浮液原液5ml，1M HEPES125μL，20%葡萄糖 250μL，1M MgCl₂50μL，0.05g BSA，用双蒸水定溶至50ml，溶解后调整pH 值至7.4即得；

血小板悬浮液原液：8.00g NaCl，1.02g NaHCO₃，0.195g KCl溶于100ml 双蒸水中配制而成；

CFDA-SE母液：CFDA-SE溶于二甲基亚砜（DMSO）配成10mM母液；

PBS：称取8.00g NaCl，0.20g KCl，1.44g Na₂HPO₄，0.24g KH₂PO₄溶于 1000ml双蒸水中，溶解后调整pH值至7.4，高压灭菌后即得。

2、检测方法

抽取健康志愿者静脉血10ml，所有志愿者两周内均未服用任何抗凝药及 影响血小板功能的药物。置于含3.8%（质量分数）枸橼酸三钠抗凝剂（抗凝 剂与血样的体积比为l：9）的试管中，在室温下离心1000rpm、10min。待离 心机自然停止后取出，小心吸取上层血浆即为富血小板血浆（PRP）。

PRP中加入1000×CFDA-SE母液至终浓度为10μM，室温孵育10min。将 CFDA-SE标记后的PRP以2500rpm、10min再次离心，待离心机自然停止后 取出，小心吸取底层的血小板沉淀，用血小板洗涤液洗涤两次，洗涤过程中 避免血小板活化，动作轻柔。然后将血小板再悬浮于血小板悬浮液中，接着 向血小板重悬液中加入1M CaCl₂，然后调整血小板浓度为30×10⁶个/mL以 及CaCl₂浓度为1mM备用；

取对数生长期乳腺癌细胞MCF-7，0.25%的胰酶溶液消化后PBS洗涤， 肿瘤细胞悬浮液重悬，计数细胞，调整肿瘤细胞密度至5×10⁶个/mL备用。

100μL5×10⁶个/mL浓度肿瘤细胞与30×10⁶个/mL浓度的洗涤血小板 400μL孵育15min作为对照组，100μL5×10⁶个/mL浓度肿瘤细胞重悬液经整 合素α₂β₁封闭性抗体处理后，与30×10⁶个/mL浓度的血小板重悬液400μL 孵育15min作为药物处理组；

分别向药物处理组和对照组中加入500μL4%多聚甲醛（多聚甲醛终浓度 为2%）固定15min。然后分别于流式细胞仪上采用FL1通道检测荧光率，每 组重复3-5次，统计学显著性差异分析两组数据是否具有显著性差异。

3、结果

结果见图1（其他重复结果图略），由图1可知，乳腺癌细胞MCF-7与 血小板重悬液孵育后，带荧光的细胞占41.9%（荧光率）。整合素α₂β₁是肿 瘤细胞表面介导细胞与血小板粘附的关键分子，乳腺癌细胞MCF-7用整合素 α2β1的封闭性抗体处理后，再与血小板重悬液孵育，孵育后带荧光的细胞占 31.8%（荧光率），经显著性差异分析后两者具有显著性差异（P<0.05）。说 明用整合素α2β1的封闭性抗体阻断肿瘤细胞整合素α₂β₁的功能后，肿瘤细胞 与血小板粘附的能力下降，本发明检测结果与预期结果一致，表明本发明检 测方法准确度高。

实施例2：检测斑蝥素以及去甲斑蝥素抑制乳腺癌细胞MCF-7和血小板 粘附的活性

1、相关试剂配制

相关试剂配制参照实施例1。

2、检测方法

抽取健康志愿者静脉血10ml，所有志愿者两周内均未服用任何抗凝药及 影响血小板功能的药物。置于含3.8%（质量分数）枸橼酸三钠抗凝剂（抗凝 剂与血样的体积比为l：9）的试管中，在室温下离心1000rpm、10min。待离 心机自然停止后取出，小心吸取上层血浆即为富血小板血浆（PRP）。

PRP中加入1000×CFDA-SE母液至终浓度为10μM，室温孵育10min。将 CFDA-SE标记后的PRP以2500rpm、10min再次离心，待离心机自然停止后 取出，小心吸取底层的血小板沉淀，用血小板洗涤液洗涤两次，洗涤过程中 避免血小板活化，动作轻柔。然后将血小板再悬浮于血小板悬浮液中，接着 向血小板重悬液中加入1M CaCl₂，然后调整血小板浓度为30×10⁶个/mL以 及CaCl₂浓度为1mM备用；

取对数生长期乳腺癌细胞MCF-7设为对照组，将经斑蝥素以及去甲斑蝥 素处理后的肿瘤细胞为药物处理组，三组细胞分别经胰酶消化处理后用PBS 洗涤，然后用肿瘤细胞悬浮液重悬得到对照组肿瘤细胞重悬液和两个药物处 理组肿瘤细胞重悬液，调整三组肿瘤细胞密度为5×10⁶个/mL备用

将上述得到的三组肿瘤细胞重悬液各取100μL分别和400μL血小板重悬 液孵育15min，500μL4%多聚甲醛（多聚甲醛终浓度为2%）固定15min，然 后于流式细胞仪上采用FL1通道检测肿瘤细胞荧光率获得药物处理组荧光率 以及对照组荧光率，每组重复3-5次，统计学显著性差异分析两组数据是否具 有显著性差异。

3、结果

结果见图2（其他重复结果图略），乳腺癌细胞MCF-7与血小板重悬液 孵育后，带荧光的细胞占41.9%（荧光率）。斑蝥素以及去甲斑蝥素是已知能 够抑制肿瘤侵袭和转移的抗肿瘤药物，乳腺癌细胞MCF-7分别用斑蝥素和去 甲斑蝥素处理后，再与血小板重悬液孵育，孵育后带荧光的细胞分别占25.6% 和29.7%（荧光率），经显著性差异分析后和对照组具有显著性差异（P<0.05）。 表明本发明检测结果与预期结果一致。

实施例3：本发明检测方法和现有技术的对比试验

现有技术：将肿瘤细胞种于细胞培养板中，待细胞完全贴壁，并完全融 合后用待检测的抗肿瘤药物处理，将荧光标记过的血小板加入培养板中，孵 育一定时间后，漂洗去除未粘附于肿瘤细胞的血小板，加入裂解液裂解细胞 和血小板后，检测培养板中的荧光水平相对于未经抗肿瘤药物处理的荧光水 平是否有所降低，抗肿瘤药物为斑蝥素和去甲斑蝥素，肿瘤细胞为乳腺癌细 胞MCF-7，结果见图3；

本发明：相关试剂配制和检测方法参照实施例2，抗肿瘤药物为斑蝥素和 去甲斑蝥素，肿瘤细胞为乳腺癌细胞MCF-7，结果见图4和图5；

由图3可知，采用现有技术进行的肿瘤细胞与血小板粘附的检测，与对 照组相比，当采用抗肿瘤药物斑蝥素（CAN）和去甲斑蝥素（NCTD）处理后， 细胞变圆，粘附力下降，培养板中出现了一些没有细胞的空隙（详见矩形框 放大部分镜检图），这些空隙处在光镜下可见到血小板，荧光显微镜下可见 绿色荧光，说明血小板直接粘附到了培养板上的空隙处。经检测各组间的总 荧光强度无明显差别，无法证实药物对肿瘤细胞与血小板的粘附有抑制活性， 结果出现偏差。

由图4和图5可知，肿瘤细胞与血小板孵育后于流式细胞仪检测，可见 加斑蝥素和去甲斑蝥素处理组的细胞的荧光率下降，说明粘附于细胞上的血 小板减少，与对照组结果具有显著性差异（P<0.05），表明斑蝥素和去甲斑蝥 素具有对肿瘤细胞与血小板的粘附有抑制活性，能够抑制肿瘤细胞的侵袭和 转移，与预期结果是一致的，结果准确。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。