病毒性出血性败血症病毒的RT-PCR检测试剂盒及其制备方法

摘要

病毒性出血性败血症病毒的RT-PCR检测试剂盒及其制备方法，涉及一种RT-PCR检测试剂盒。所述病毒性出血性败血症病毒的RT-PCR检测试剂盒设有盒体、操作说明书和检测试剂；操作说明书和检测试剂设在盒体内，所述检测试剂包括裂解液、吸附液、洗涤液、DEPC处理水、反转录反应液、VHSV-PCR反应液、阳性对照和阴性对照。制备盒体；配制检测试剂；将操作说明书、裂解液、吸附液、洗涤液、DEPC处理水、反转录反应液、VHSV-PCR反应液、阳性对照和阴性对照置入盒体内，即得病毒性出血性败血症病毒的RT-PCR检测试剂盒。试剂齐全，操作简单。

说明书

技术领域

本发明涉及一种RT-PCR检测试剂盒，尤其是涉及病毒性出血性败血症病毒(Viral  hemorrhagic septicemia virus,VHSV)的RT-PCR检测试剂盒及其制备方法。

技术背景

病毒性出血性败血症(Viral hemorrhagic septicemia,VHS)是感染鲑类、鳟鱼、大菱鲆、鲈 鱼、漠斑牙鲆、褐鳟、茴鱼等多种鱼类的一种致死性传染性疾病。该病导致鱼皮肤、肾脏和 肝脏出血，死亡率约为90%。VHS的病原是病毒性出血性败血症病毒(VHSV)，属于弹状病毒 科Novirhabdovirus属。VHSV基因组为一段单链负链RNA，其长度约12kp，线性基因组编码5 个蛋白，包括：核衣壳蛋白(N蛋白)，两个结构蛋白(P和M蛋白)，糖蛋白(G蛋白)、RNA聚合 酶(L蛋白)和一个非结构蛋白（NV蛋白），顺序为3’-Leader-N-P-M-G-NV-L-Trailer-5’。VHSV 病毒粒子长约180nm，宽约70nm。在国际动物卫生组织和我国进境动物一、二类传染病名录 中均被列为必报疫病。国际组织通常采用一些限制措施，从而避免染病鱼类流动到其他地区 和国家,过去VHS主要流行于北美洲和欧洲一些国家。近年来,随着水生动物及其产品进出口 贸易的急剧增加，VHSV已经传入我国，并在我国局部地区流行。

逆转录链式聚合酶反应（RT-PCR）是一种用于检测病毒和类病毒最常用的方法,已经应 用到了一系列鱼病病毒的检测中，包括：昏睡病虹彩病毒(Sleeping disease virus)、大马哈鱼传 染性贫血症病毒(Infectious salmon anaemia virus)、水生呼肠孤病毒属（Fish aquareovirus）、败 血症病毒（Hemopoietic necrosis virus）。

病毒性出血性败血症病毒致死率非常高，给网箱养殖造成巨大的经济损失。防治病毒感 染最有效的方式是防止接触病毒，有规律地进行常规检查，在鱼类运输前后，进行更严格的 检测。原则上避免接触感染的养殖场，使用无病毒感染的饵料喂食，使用无病毒的养殖水体， 使用经检测的鱼卵是控制VHSV的最有效措施。目前还没有一种有效的治疗方法，因此在感 染初期检测病毒就显得非常重要。这就需要一种成本低、快速、特异性与灵敏度高的检测方 法。在过去的几十年里，已经建立了几种检测病毒性出血性败血症病毒的方法。传统标准的 检测方法是首先通过细胞培养分离出病毒，再使用特异方法如免疫荧光单抗（IFAT）或者抗 体中和试验检测（[11]Fregeneda-GrandesJM,Olesen NJ.Detection of rainbow trout antibodies  against viral haemorrhagicsepticaemia virus(VHSV)by neutralisation test is highly dependent on  the virus isolate used.Dis Aquat Organ,2007,74(2):151-158）。我国2008年由国家质量监督检 验检疫总局发布的国标GB/T15805.3-2008中，也采用了该方法。目前常用的还有酶联免疫吸 附法（[12]Encinas P,Gomez-Casado E,Estepa A,Coll JM.An ELISA for detection of trout  antibodies to viral haemorrhagic septicemia virus using recombinant fragments of their viral G  protein.J Virol Methods,176(1-2):14-23）和实时定量RT-PCR（[13]Chico V,Gomez N, Estepa A,Perez L.Rapid detection and quantitation of viral hemorrhagic septicemia virus in  experimentally challenged rainbow trout by real-time RT-PCR.J Virol Methods,2006, 132(1-2):154-159）。但这些方法有的耗时长，有的要求使用昂贵的设备和试剂。RT-PCR技 术是一种快速、特异性好和灵敏高的病毒检测方法，广泛的应用于饵料、养殖水体和环境监 测中。以前也有关于VHSVRT-PCR检测方法的报道，但是只报道了特异性引物，没有形成 试剂盒，操作时需要购买大量配套试剂，过程繁琐。

发明内容

本发明的目的在于提供可特异性检测病毒性出血性败血症病毒的引物。

本发明的另一个目的在于提供一种病毒性出血性败血症病毒的RT-PCR检测试剂盒及其 制备方法。

根据已公开的病毒性出血性败血症病毒基因组序列，选取病毒性出血性败血症病毒的核 蛋白基因序列，进行分析设计，所述可特异性检测病毒性出血性败血症病毒的引物为：

VHSN-F：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

VHSN-F：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述病毒性出血性败血症病毒的RT-PCR检测试剂盒设有盒体、操作说明书和检测试剂； 操作说明书和检测试剂设在盒体内，所述检测试剂包括裂解液、吸附液、洗涤液、DEPC处理 水、反转录反应液、VHSV-PCR反应液、阳性对照和阴性对照。

所述病毒性出血性败血症病毒的RT-PCR检测试剂盒的制备方法如下：

1）制备盒体；

2）配制检测试剂：

裂解液为：5mol/L盐酸胍，0.1mol/L EDTA，去离子水定容至1L，pH为8.0；

吸附液为：将5g玻璃粉放在25～30mL水中悬浮，然后再加入等体积的硝酸反应，最后 重新加水悬浮即可，所述硝酸的浓度可为68%；

洗涤液为：0.1mol/L氯化钠，1mmol/L EDTA，10mmol/L Tris-HCl，去离子水定容至1L， pH为7.5，再加入等体积的无水乙醇；

DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水：往超纯水中加入DEPC至终浓度为0.1%，振荡2h后，高温 高压灭菌2次；

反转录反应液：每6μL反转录反应液含有1μL50mM VHSN-R引物；1μL dNTP混合物， 每种dNTP浓度为10mM；2μL5×Primescript缓冲液；0.25μL RNase抑制剂；0.25μL逆转录酶， 购自中国大连宝生物公司；0.3μL甘油；1.2μL DEPC处理水；

VHSV-PCR反应液：每18μL VHSV-PCR反应液含有1μL10mM VHSN-F引物；1μL10mM  VHSN-F引物；1μL dNTP混合物，每种dNTP浓度为2.5mM；0.25μL Taq DNA聚合酶；2μL 10×PCR缓冲液；1.5μL甘油；11.25μL双蒸水；

阴性对照：DEPC处理水；

阳性对照：将体外转录得到的VHSV核蛋白基因RNA片段稀释到10⁴拷贝/μL所得溶液；

3）将操作说明书、裂解液、吸附液、洗涤液、DEPC处理水、反转录反应液、VHSV-PCR 反应液、阳性对照和阴性对照置入盒体内，即得病毒性出血性败血症病毒的RT-PCR检测试剂 盒。

在步骤2）中，所述阳性对照的制备方法如下：

（1）引物设计，具体方法为：

根据已获得的VHSV核蛋白基因序列，设计以下两条用于构建体外转录VHSV核蛋白基因 RNA片段重组质粒pSP-VHSV的引物VHSV-long-F和VHSV-long-R，分别携带HindⅢ和BamH  Ⅰ酶切位点：

VHSV-long-F：其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

VHSV-long-R：其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

（2）含有检测目的片段重组质粒pSP-VHSV的构建和作为阳性对照的RNA片段的制备， 具体步骤为：

a）pSP-VHSV重组质粒的构建

使用VHSV-long-R作为反转录引物，将病毒RNA样品作为模板，经过反转录PCR反应， 获得了目的片段，然后将获得的逆转录产物作为模板进行PCR扩增，将PCR产物回收后用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ内切酶做双酶切，再使用E.Z.N.A.^TM Cycle Pure试剂盒（OMEGA，USA）回收酶 切产物，然后将酶切产物连接到pSP64poly(A)（Promega，USA）载体上，转化至感受态 E.coliDH5α中，筛选阳性克隆并测序验证；

b）体外转录获得作为阳性对照的RNA片段

提取构建好的pSP-VHSV质粒，EcoRI线性化后回收质粒，再用Promega体外转录试剂盒 体外转录获得小RNA片段，用1.2%琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测RNA质量和浓度；根据 RNA分子量确定单位体积RNA分子数，按10倍梯度稀释，分别稀释为1×10⁶到1×10¹拷贝/μL， 获得浓度梯度的阳性RNA片段。

本发明根据VHSV核蛋白（N）基因序列设计了两对新的引物用于VHSV的RT-PCR检测， 并且检测了该引物的特异性和灵敏度；体外转录了一小段病毒RNA作为阳性对照，从而建立 起快速灵敏的VHSV检测试剂盒。

本发明提供了一种特异、简便和快速的病毒性出血性败血症病毒检测试剂盒，试剂齐全， 操作简单，为以后对该病的流行检测和防控提供了检测工具。

附图说明

图1是病毒性出血性败血症病毒的RT-PCR检测试剂盒横截面剖视图（即盒内设置的组 成及位置示意图）。在图1中，各标记为：1：裂解液、2：洗涤液、3：盒体、4：操作说明书、 5：吸附液、6：DEPC处理水、7：反转录反应液、8：VHSV-PCR反应液、9：阳性对照:、 10：阴性对照。

图2为实施例1引物特异性实验电泳图。在图2中，M为DL Marker2000（Takara，China）； 1为阳性对照（VHSV转录所得RNA片段），2为VHSV，3为IHNV，4为IPNV，5为SVCV， 6为阴性对照。

图3为实施例2灵敏度检测实验电泳图。在图3中，M为DL Marker2000（Takara，China）； 1～6为2×10⁶,2×10⁵,2×10⁴,2×10³,2×10²，2×10¹拷贝/μL体外转录所得阳性对照RNA；7为 阴性对照。

图4为实施例3回收率实验电泳图。在图4中，M为DL Marker2000（Takara,China）；1～3 为2×10⁶,2×10⁵,2×10⁴拷贝/μL体外转录所得阳性对照RNA；4～6为2×10⁶,2×10⁵,2×10⁴拷贝/μL 阳性对照RNA混合样品后回收的RNA；7为阴性对照。

具体实施方式

一、本发明的特异性引物，根据已公开的病毒性出血性败血症病毒基因组序列，选取病 毒性出血性败血症病毒的核蛋白基因序列，进行分析设计，能特异性鉴别病毒性出血性败血 症病毒，该对引物包括两条：

VHSV-F：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

VHSV-R：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

二、本发明所述病毒性出血性败血症病毒的RT-PCR检测试剂盒设有盒体3、操作说明书4 和检测试剂；操作说明书4和检测试剂设在盒体3内，所述检测试剂包括裂解液1、吸附液5、 洗涤液2、DEPC处理水6、反转录反应液7、VHSV-PCR反应液8、阳性对照9、阴性对照10（参 见图1）；

所述病毒性出血性败血症病毒的RT-PCR检测试剂盒的制备方法如下：

1.制备盒体；

2.配制检测试剂：

裂解液为：5mol/L盐酸胍，0.1mol/L EDTA，去离子水定容至1L，pH为8.0；

吸附液为：将5g玻璃粉放在25-30mL水中悬浮，然后再加入等体积浓度68%的硝酸反 应，最后重新加水悬浮即可。

洗涤液为：0.1mol/L氯化钠，1mmol/L EDTA，10mmol/L Tris-HCl，去离子水定容至1L， pH为7.5，再加入等体积的无水乙醇；

DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水：往超纯水中加入DEPC至终浓度为0.1%，振荡2h后，高 温高压灭菌2次。

反转录反应液：每6μL反转录反应液含有1μL50mM VHSV-R引物；1μL dNTP混合物， 每种dNTP浓度为10mM；2μL5×Primescript缓冲液；0.25μLRNase抑制剂；0.25μL逆转录酶， 购自中国大连宝生物公司；0.3μL甘油；1.2μL DEPC处理水。

VHSV-PCR反应液：每18μL VHSV-PCR反应液含有1μL10mMVHSV-F引物；1μL10mM  VHSV-R引物；1μL dNTP混合物，每种dNTP浓度为2.5mM；0.25μL Taq DNA聚合酶；2μL 10×PCR缓冲液；1.5μL甘油；11.25μL双蒸水。

阴性对照：DEPC处理水。

阳性对照：将体外转录得到的VHSV核蛋白基因RNA片段稀释到10⁴拷贝/μL所得溶液。

在步骤2中，所述阳性对照的制备方法如下：

步骤一、引物设计，具体方法为：

根据已获得的VHSV核蛋白基因序列，设计以下两条用于构建体外转录VHSV核蛋白基因 RNA片段重组质粒pSP-VHSV的引物VHSV-long-F和VHSV-long-R，分别携带HindⅢ和BamH Ⅰ酶切位点：

VHSV-long-F：其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

VHSV-long-R：其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

步骤二、含有检测目的片段重组质粒pSP-VHSV的构建和作为阳性对照的RNA片段的制 备，具体步骤为：

1）pSP-VHSV重组质粒的构建

使用VHSV-long-R作为反转录引物，将病毒RNA样品作为模板，经过反转录PCR反应， 获得了目的片段。其逆转录反应体系和反应程序如下：

混合均匀后42℃反应1h，70℃反应15min终止反应后迅速置于冰上，然后将获得的逆转 录产物作为模板进行PCR扩增，反应体系和反应程序如下：

PCR程序为：95℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min；

将PCR产物回收后用HindⅢ和BamHⅠ内切酶做双酶切，再使用E.Z.N.A.^TM Cycle Pure试 剂盒（OMEGA，USA）回收酶切产物，然后将酶切产物连接到pSP64poly(A)（Promega，USA） 载体上，转化至感受态E.coliDH5α中，筛选阳性克隆并测序验证；

2）体外转录获得作为阳性对照的RNA片段

提取构建好的pSP-VHSV质粒，EcoRI线性化后回收质粒，再用Promega体外转录试剂盒 体外转录获得小RNA片段。体外转录体系及条件如下：

加DEPC处理水至终体积为20μL。

离心后置于37℃反应1h，反应完后加入RQ1RNase-Free DNase2u，37℃孵育30min消化 去除pSP-VHSV质粒，酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）和氯仿/异戊醇（24∶1）抽提RNA，再用 1.2%琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测RNA质量和浓度；根据RNA分子量确定单位体积RNA 分子数，按10倍梯度稀释，分别稀释为1×10⁶到1×10¹拷贝/μL，获得浓度梯度的阳性RNA片段。

3.将检测试剂：操作说明书、裂解液、吸附液、洗涤液、DEPC处理水、反转录反应液、 VHSV-PCR反应液、阳性对照和阴性对照置入盒体内，即得病毒性出血性败血症病毒的 RT-PCR检测试剂盒。再随机抽样检测试剂盒质量。

三、病毒性出血性败血症病毒的RT-PCR检测试剂盒的应用如下：

1.将取得的样品加到0.5mL离心管内，然后加入1号管内裂解液8滴，用牙签充分捣碎（约 1～2min）。

2.12000r/min离心3min，将上清转移至新的0.5mL离心管内，加30μL5号管中的吸附液 （内含白色物质，用前充分摇匀），混匀。室温放置5min，期间振荡3次。

3.12000r/min离心30s，弃上清，再离心3s，用移液器吸干残余液体，加入2号管内的洗 涤液10滴，轻轻搅动使沉淀充分悬浮起来。

4.12000r/min离心30s，弃上清，再离心3s，用移液器吸干残余液体，室温放置3min。

5.加入20μLDEPC处理水，充分溶解沉淀，12000r/min离心30s，吸取上清4μL和7号管中 的反转录反应液6μL加到0.5mL离心管中，42℃孵育0.5h，再将反转录产物2μL和18μL8号 管的VHSV-PCR反应液混合，进行PCR反应。PCR反应参数设置为：先95℃预处理1min，进 行35个循环反应，每个循环包括94℃30s，58℃30s，72℃30s，循环完成后，72℃延 伸10min。9号管的阳性对照和10号管的阴性对照不需要处理，直接取4μL进行反转录和后续 PCR反应，反应条件与前面样品检测相同。

6.结果判定：PCR反应完毕，取10μL反应产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳检测，时间 15～25min。紫外灯下观察，阳性对照应有一条471bp的清晰条带；阴性对照在此平行位置 无条带；如果样品在该平行位置有条带，表明该样品可能含有病毒性出血性败血症病毒，若 无条带则样品中不含有病毒性出血性败血症病毒。

备注：试剂盒不使用时，7,8,9和10号试剂-20℃保存，其余试剂4℃保存，开封后，应在6 个月内用完。

下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。

实施例1引物的特异性实验

为了确定该RT-PCR检测试剂盒的特异性，分别使用其他病毒RNA或者DNA作为模板，按 照试剂盒的使用方法进行检测，所述其他病毒包括传染性造血器官坏死病病毒（Infectious  hematopoietic necrosis virus,IHNV）、胰脏坏死病毒（Infectious pancreatic necrosis virus,IPNV） 和鲤纯血症坏死病毒（Spring viremia of carp virus,SVCV）。实验结果显示：除了病毒性出血 性败血症病毒，其他病毒琼脂糖凝胶电泳后均检测不到471bp的目的片段（见图2）。说明该检 测试剂盒所用的引物特异性好。

实施例2灵敏度检测实验

取2μL不同浓度梯度（1×10⁶—1×10¹拷贝/μL）的阳性对照RNA片段作为模板按照试剂盒 的使用方法进行检测，然后使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果，结果显示（见图3），该方法 能检测到大约为10²个阳性RNA，既相当于10²个病毒粒子。

实施例3回收率实验

为了分析从样品中提取病毒RNA的效率，进行了回收率实验。将20μL1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴拷贝/μL的阳性对照RNA和阴性样品混合，按照试剂盒的使用方法提取RNA，将RNA溶解在 20μLDEPC处理水中。然后分别用2μL各浓度梯度阳性对照RNA和新提取的RNA作为模板进 行检测。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，该提取方法的回收率大于50%（见图4）。