一种能同时施加力学刺激和化学刺激的微流控装置

摘要

一种能同时施加力学刺激和化学刺激的微流控装置，用于体外模拟动脉粥样硬化，其包括一个微流控芯片、细胞培养驱动系统和负压产生器，所述细胞培养驱动系统与微流控芯片连接以驱动微流控芯片的微流通道内的液体流动；所述负压产生器与微流控芯片相连以产生负压，该装置可以模拟血管中物理刺激和化学刺激对血管内皮细胞的影响，从而对动脉粥样硬化发生发展进行研究，并可进一步进行药物筛选和探索治疗方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于能同时施加力学刺激和化学刺激的微流控芯片和具有 该芯片的微流控装置，具体用于体外模拟动脉粥样硬化。

背景技术

现有微流控技术是在微管道中控制气体和流体的技术。这种技术操作简单 并且能够很容易地与常用的各种生物化学分析方法结合，因而被广泛地应用到 生物化学分析中。动脉粥样硬化，是最常见的和最具有危害性的疾病，是动脉 硬化的一种，大、中动脉内膜出现含胆固醇、类脂肪等的黄色物质，多由脂肪 代谢紊乱、神经血管功能失调引起。常导致血栓形成、供血障碍等。动脉粥样 硬化多见于40岁以上的男性和绝经期后的女性。本病常伴有高血压、高胆固醇 血症或糖尿病等。这种病是发生于血管中的一种由血管内皮细胞功能失调而引 起的疾病。血管内皮细胞在体内所处的微环境主要包括物理刺激和化学刺激两 方面，物理刺激主要是由血液流动引起的流体剪切力和由心脏跳动引起的周期 性的拉伸；化学刺激主要是血液中的葡萄糖、胆固醇等以及各种细胞因子。这 些因素共同作用导致血管内皮细胞产生各种病理变化。因此要研究动脉粥样硬 化这种由血管内皮细胞功能失调引起的疾病、需要建立一个简单有效的能够结 合上述所有因素的模型。现有的研究模型可以概括为三类，分别专注于拉伸、 流体剪切力和化学刺激条件的控制。目前并没有简单而有效地将三种条件结合 于一体的研究模型。

中国专利申请(申请号为201110404504.6和201110404620.8)涉及一种动脉 血管模拟微流控装置及其应用，主要是在微流控芯片上实现了对细胞的长期力 学刺激，但没有涉及到将化学刺激引入芯片中，从而模拟例如动脉粥样硬化这 种化学和力学刺激共同作用在血管内皮细胞上从而引发的疾病。另外，在芯片 的设计上，上述两项申请中芯片中薄膜的拉伸表现为单方向的拉伸，在拉伸的 同时垂直拉伸方向的薄膜仍会有3%的轻微形变。

本发明除了在芯片中同时引入化学刺激和物理刺激以外，与上述现有技术 相比有一下三个方面的明显不同之处：1.负压发生模块凹槽F部分没有形成联 通的回路，如此设计可以确保通道中接种的细胞所承受的拉伸为单轴拉伸；2. 气动室在与两条窄沟槽F1平行的中轴线上，并通过两条通道分别与两条窄沟槽 F2联通，如此设计可以确保细胞受到的来自管道F2两侧的拉伸力相等；3，微 流通道模块的管道更窄，如此设计可以减少管道中细胞的数量，减少管道中间 的细胞与管道两侧的距离，使每个细胞承受的拉伸力更均一。

发明内容

本发明的目的在于提出本发明目的在于构建体外模拟动脉粥样硬化的微流 控装置，可以模拟血管中物理刺激和化学刺激对血管内皮细胞的影响，从而对 动脉粥样硬化发生发展进行研究，并可进一步进行药物筛选和探索治疗方法。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一种微流控芯片，用于同时施加力学刺激和化学刺激，优选用于体外模拟动 脉粥样硬化，其特征在于：所述微流控芯片包括透明的微流通道模块和与其相 适配的透明的负压产生模块，所述微流通道模块底部和负压产生模块顶部通过 弹性膜相粘合，所述微流控芯片是所述微流通道模块、所述弹性膜、所述负压 产生模块的整合体，所述微流通道模块用于流体流动，所述负压产生模块用于 产生使弹性膜发生形变的负压。

进一步的，所述微流通道模块顶部设有流体出口和流体入口以及贯通孔，所 述流体出口和流体入口分别连接于所述微流通道，所述微流通道设于所述微流 通道模块底部。

进一步的，所述负压产生模块顶部设有负压凹槽和气动室，所述气动室和所 述微流通道模块上的所述贯通孔对准，并且所述气动室与所述负压凹槽相连。

进一步的，所述微流通道模块、负压产生模块和弹性膜均由聚二甲基硅氧烷 （PDMS）材料制成。

进一步的，所述负压产生模块和所述弹性膜之间填充有液体润滑剂。

进一步的，所述流体出口和流体入口以及贯通孔均为圆形孔。

进一步的，所述负压产生模块的气动室呈圆柱形空腔状。

进一步的，所述弹性膜在与所述微流通道模块的所述贯通孔和所述负压产生 模块的所述气动室相对的对应位置打孔，以使所述负压产生模块的所述负压凹 槽和所述气动室通过所述贯通孔与外界相通。

进一步的，所述负压凹槽包括对称设置的两个弯折形状的管道和两条平行的 窄沟槽，气动室E在与两条窄沟槽平行的中轴线上，其中每条所述管道一端连 接所述气动室，另一端连接一条所述窄沟槽的中部。

一种能同时施加力学刺激和化学刺激的微流控装置，优选用于构建体外模拟 动脉粥样硬化模型，具有上述微流控芯片，还包括细胞培养驱动系统和负压产 生器，所述细胞培养驱动系统包括储液瓶和与其连接的蠕动泵，所述微流控芯 片、所述储液瓶、所述蠕动泵通过PE管串联形成循环流体通路；所述储液瓶与 和所述微流控芯片的所述微流通道模块的所述流体出口相连通，所述蠕动泵进 液口与所述储液瓶相连，所述蠕动泵出液口与所述微流控芯片的所述微流通道 模块的所述流体入口相连以驱动所述微流控芯片的所述微流通道模块的所述微 流通道内的流体流动；

所述负压产生器包括气流分配器、气流控制器和真空泵，所述气流分配器出 气口通过PE管连接至所述微流控芯片的所述负压产生模块的所述气动室以使负 压产生模块产生负压；所述气流控制器包括控制单元和气流开关，气流分配器 具有三个气流进出口，气流分配器第一气流进出口通过管连接至气动室，第二 气流进出口经气流开关与大气相通，第三气流进出口与真空泵相连，气流开关 用于控制第二、第三气流进出口交替打开或关闭，气流开关的控制端与控制单 元相连接。具体操作时，由电动气流开关控制第二气流进出口闭合以及使第三 气流进出口打开，以使第一气流进出口和第三气流进出口形成通路，使得气动 室与真空泵连通；或使得第二气流进出口打开以及使第三气流进出口闭合，以 使第一气流进出口和第二气流进出口形成通路，使得气动室与大气连通。所述 气流开关通过控制单元的设定周期性地通过电动气流开关改变气流分配器中的 气流通路。

上述任一种微流控芯片或上述微流控装置的用途，其中，所述微流控芯片 或所述微流控装置应用于体外模拟动脉粥样硬化。

附图说明

图1是微流控芯片的微流通道模块；

图2是述微流控芯片的负压产生模块；

图3是微流控芯片的负压产生模块尺寸图；

图4是述微流控芯片的微流通道模块、负压产生模块、弹性膜的组合结构；

图5是图4的截面图；

图6是微流控装置整体示意图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

本发明具体提供的一种可以同时施加力学刺激和化学刺激的微流控装置，包 括一个生物力学刺激和化学刺激的微流控芯片、细胞培养驱动系统和负压发生 器，所述细胞培养驱动系统与微流控芯片连接以驱动微流控芯片的微流通道内 的液体流动；所述负压发生器与微流控芯片相连以使其产生负压。

所述微流控芯片1，包括透明的微流通道模块1.1和与其相适配的透明的负 压产生模块1.2，所述微流通道模块底部和负压产生模块顶部通过弹性膜1.3相 粘合，所述微流控芯片1是所述微流通道模块1.1、所述弹性膜1.3、所述负压 产生模块1.2的整合体，所述微流通道模块1.1用于流体流动，所述负压产生 模块1.2用于产生使弹性膜1.3发生形变的负压。

如图1所示，所述微流通道模块1.1顶部设有流体出口B和流体入口C以及 贯通孔A，所述流体出口B和流体入口C分别通过与流体入口C和流体出口B相 适配的PE管贯通连接于微流通道D，所述微流通道D设于所述微流通道模块1.1 底部。

如图2所示，所述负压产生模块1.2顶部设有负压凹槽F和气动室E，所述 气动室E和微流通道模块上的贯通孔A对准，并通过与其相适配的PE管与负压 凹槽F相连。

图3是负压产生模块的具体尺寸图。

如图4所示，弹性膜1.3位于所述微流通道模块1.1、负压发生模块1.2之 间，经粘合后组合成一个整体，并将弹性膜1.3的与所述微流通道模块的所述 贯通孔A和所述负压产生模块的所述气动室E相对的对应的位置打孔以使负压 发生模块的负压凹槽F和气动室E通过贯通孔与外界相通，所述负压发生模块 1.2和弹性膜1.3间填充有液体润滑剂。

如图5所示，微流控装置包括一个生物力学刺激和化学刺激的微流控芯片、 细胞培养驱动系统和负压发生器。所述细胞培养驱动系统包括储液瓶3和与其 连接的蠕动泵2，所述微流控芯片1、所述储液瓶3、所述蠕动泵2通过PE管串 联形成循环流体通路；所述储液瓶3一端与所述流体出口B与所述微流通道D 相连，所述蠕动泵2通过PE管与所述储液瓶3的另一端相连，所述蠕动泵2通 过PE管和所述流体入口C与所述微流通道D相连，以驱动微流通道D内的流体 流动。

所述负压发生器包括气流分配器4、气流控制器和真空泵5，所述气流分配 器底部通过PE管连接至气动室与负压发生模块连接，以使负压发生模块产生负 压；所述气流控制器包括控制单元和气流开关，气流分配器4具有三个气流进 出口，气流分配器第一气流进出口通过管连接至气动室E，第二气流进出口经气 流开关与大气相通，第三气流进出口与真空泵相连，气流开关用于控制第二、 第三气流进出口交替打开或关闭，气流开关的控制端与控制单元6相连接。具 体操作时，由电动气流开关控制第二气流进出口闭合以及使第三气流进出口打 开，以使第一气流进出口和第三气流进出口形成通路，使得气动室与真空泵连 通；或使得第二气流进出口打开以及使第三气流进出口闭合，以使第一气流进 出口和第二气流进出口形成通路，使得气动室与大气连通。所述气流开关通过 控制单元的设定周期性地通过电动气流开关改变气流分配器中的气流通路。

优选地，所述微流通道模块、负压产生模块和弹性膜均由聚二甲基硅氧烷 （PDMS）材料制成。

优选地，所述流体出口和流体入口以及贯穿孔均为圆形孔，PE管垂直连接 于所述微流通道模块底部。

优选地，所述负压产生模块的气动室呈圆柱形空腔状。

另一方面，本发明提供一种利用可以同时施加力学刺激和化学刺激的微流控 装置在体外模拟血管内皮细胞在体内的微环境，以研究动脉粥样硬化发生和发 展的各种影响因素。

优选的，通过在微流通道模块中通入含有致病因子的培养基引入对微流通道 内细胞的化学刺激；

优选的，通过改变真空泵抽气的频率可以控制弹性膜的拉伸频率从而对微流 通道内生长在弹性膜上的细胞施加力学刺激；

优选的，通过蠕动泵控制其循环液流的流速，可以控制对微流通道内细胞的 流体剪切力刺激。

具体实施例如下：

实施例1

微流控芯片的制备

通过机械加工制备聚甲基丙烯酸甲酯模板，表面经过全氟硅烷处理后，利用 软刻蚀技术制备聚二甲基硅氧烷模板以及二次翻模制备聚二甲基硅氧烷模块， 包括微流通道模块（图1）和负压发生模块（图2）。其中，微流通道模块的管 道D长20mm，宽1mm，高0.4mm；三个圆柱形孔A、B、C贯通整个模块，高约 2mm，直径0.8mm。微流通道模块总长约30mm，宽约15mm。负压发生模块总长约 30mm，宽约15mm，厚约2mm。负压发生模块上的凹槽深1mm。其他具体数据如图 3所示。两条平行窄沟槽F2间距0.5mm；窄沟槽F2宽0.25mm，长15mm。管道 F1宽0.5mm，与窄沟槽F2联通处位于窄沟槽F2中点，管道F1与窄沟槽F2垂 直段长3mm，与窄沟槽F2平行段长15mm；气动室E与管道F1及窄沟槽相联通， 为圆柱形，直径3mm。

通过匀胶机将液态PDMS旋涂在洁净的硅片上，固化后获得PDMS薄膜。PDMS 膜厚40nm，长30mm，宽15mm，具有弹性。

按照图4的方式将微流通道模块、负压发生模块以及PDMS薄膜组合形成微 流控芯片。微流通道模块与负压发生模块的通道对齐，与中间夹一层PDMS弹性 膜，微流通道模块的贯通孔A和负压发生模块的气动室E相对，并将薄膜打穿 以使负压发生模块的管道和气动室通过贯通孔A与外界相通。

实施例2

利用本发明的模型重现血管内皮细胞在体内所处的正常微环境的实施方案 如下：

1.按照实施例1中的方法制作微流控芯片。

2.通过微流通道模块上的流体出口B和入口C向微流通道中接种血管内皮 细胞，在其贴壁后培养12小时。

3.用外径为0.8mm的PE软管将流体出入口B和C连接成回路，回路中注满 培养基，并将回路与蠕动泵连接，通过蠕动泵控制其循环液流的流速，将其中 细胞所承受的流体剪切力控制在1.16Pa至5.07Pa之间（体内细胞所受的正常 流体剪切力范围）。

4.用外径为0.8mm的PE软管将贯通孔A与真空泵及其控制系统相连，真空 泵可将负压发生模块中的气体抽出，使PDMS弹性膜拉伸，从而对膜上的血管内 皮细胞施加拉伸力。通过控制系统将真空泵抽气的频率设定为70次/分钟（正 常心跳的频率）。

5.将芯片置于37℃，5%CO2的培养箱中。

通过以上5步，即可为接种在芯片内的细胞提供一个十分接近体内正常微环 境的培养条件。培养一段时间后对细胞进行免疫荧光检测，即可分析细胞状态。

实施例3

利用本发明的模型重现血管内皮细胞在体内所处的微环境，单独改变培养基 中化学刺激条件，为血管内皮细胞提供一种高血糖环境的实施方案其中之一如 下：

1.按照实施例1中的方法制作微流控芯片。

2.通过微流通道模块上的流体出B和入口C向微流通道中接种血管内皮细 胞，在其贴壁后培养12小时。

3.用外径为0.8mm的PE软管将流体出入口B和C连接成回路，在培养基中 加入20mmol/L的葡萄糖后注满回路中，并将回路与蠕动泵连接，通过蠕动泵控 制其循环液流的流速，将其中细胞所承受的流体剪切力控制在1.16Pa至5.07Pa 之间（体内细胞所受的正常流体剪切力范围）。

4.用外径为0.8mm的PE软管将贯通孔A与真空泵及其控制系统相连，真空 泵可将负压发生模块中的气体抽出，使PDMS弹性膜拉伸，从而对膜上的血管内 皮细胞施加拉伸力。通过控制系统将真空泵抽气的频率设定为70次/分钟（正 常心跳的频率）。

5.将芯片置于37℃，5%CO2的培养箱中。

通过以上5步，即可为接种在芯片内的细胞提供一个十分接近体内高血糖微 环境的培养条件。高血糖被认为可能是引起血管内皮细胞功能失调，并进而导 致动脉粥样硬化的重要原因之一，通过本实施例，即可单独研究血糖浓度对血 管内皮细胞状态的影响。培养一段时间后对细胞进行免疫荧光检测，即可分析 细胞状态。

实施例4

利用本发明的模型重现血管内皮细胞在体内所处的微环境，单独改变流体剪 切力条件，为血管内皮细胞提供一种低血液流速环境的实施方案其中之一如下：

1.按照上述方法制作微流控芯片

2.通过微流通道模块上的流体出口B和入口C向微流通道中接种血管内皮 细胞，在其贴壁后培养12小时。

3.用外径为0.8mm的PE软管将流体出口B和入口C连接成回路，回路中注 满培养基，并将回路与蠕动泵连接，通过蠕动泵控制其循环液流的流速，将其 中细胞所承受的流体剪切力控制在小于1.07Pa（显著低流体剪切力的条件）。

4.用外径为0.8mm的PE软管将贯通孔A与真空泵及其控制系统相连，真空 泵可将负压发生模块中的气体抽出，使PDMS弹性膜拉伸，从而对膜上的血管内 皮细胞施加拉伸力。通过控制系统将真空泵抽气的频率设定为70次/分钟（正 常心跳的频率）。

5.将芯片置于37℃，5%CO2的培养箱中。

通过以上5步，即可为接种在芯片内的细胞提供一个十分接近体内低流体剪 切力微环境的培养条件。低流体剪切力环境出现于动脉粥样硬化形成后，血管 内径变小，血液流速降低的情况下，被认为可能促使动脉粥样硬化的进一步发 展。通过本实施例即可对低流体剪切力对血管内皮细胞的影响进行研究。培养 一段时间后对细胞进行免疫荧光检测，即可分析细胞状态。

实施例5

利用本发明的模型重现血管内皮细胞在体内所处的微环境，单独改变拉伸频 率条件，为血管内皮细胞提供一种心动过速环境的实施方案其中之一如下：

1.按照实施例1中的方法制作微流控芯片。

2.通过微流通道模块上的流体出入口B和C向微流通道中接种血管内皮细 胞，在其贴壁后培养12小时。

3.用外径为0.8mm的PE软管将流体出入口B和C连接成回路，回路中注满 培养基，并将回路与蠕动泵连接，通过蠕动泵控制其循环液流的流速，将其中 细胞所承受的流体剪切力控制在1.16Pa至5.07Pa之间（体内细胞所受的正常 流体剪切力范围）。

4.用外径为0.8mm的PE软管将贯通孔A与真空泵及其控制系统相连，真空 泵可将负压发生模块中的气体抽出，使PDMS弹性膜拉伸，从而对膜上的血管内 皮细胞施加拉伸力。通过控制系统将真空泵抽气的频率设定为120次/分钟（心 动过速）。

5.将芯片置于37℃，5%CO2的培养箱中。

通过以上5步，即可为接种在芯片内的细胞提供一个十分接近体内心动过速 微环境的培养条件。一个心动周期包括收缩期和舒张期，心动过速会同时缩短 收缩期和舒张期，但会增大收缩期与舒张期之比，收缩期与舒张期之比的增大 被认为可能会引起血管内皮细胞功能失调，是动脉粥样硬化发生的诱因之一。 通过本实施例即可对心动过速对于血管内皮细胞的影响进行研究。培养一段时 间后对细胞进行免疫荧光检测，即可分析细胞状态。

实施例6

利用本发明的模型重现血管内皮细胞在体内所处的微环境，同时改变化学刺 激条件和物理刺激条件，为血管内皮细胞提供一种心动过速且高糖低流速微环 境的实施方案其中之一如下：

1.按照实施例1中的方法制作微流控芯片。

2.通过微流通道模块上的流体出入口B和C向管道中接种血管内皮细胞， 在其贴壁后培养12小时。

3.用外径为0.8mm的PE软管将流体出入口B和C连接成回路，在培养基中 加入20mmol/L的葡萄糖后注满回路中，并将回路与蠕动泵连接，通过蠕动泵控 制其循环液流的流速，将其中细胞所承受的流体剪切力控制在小于1.07Pa（显 著低流体剪切力的条件）。

4.用外径为0.8mm的PE软管将贯通孔A与真空泵及其控制系统相连，真空 泵可将负压发生模块中的气体抽出，使PDMS弹性膜拉伸，从而对膜上的血管内 皮细胞施加拉伸力。通过控制系统将真空泵抽气的频率设定为120次/分钟（心 动过速）。

5.将芯片置于37℃，5%CO2的培养箱中。

通过以上5步，即可为接种在芯片内的细胞提供一个十分接近体内心动过速 且高糖低流速微环境的培养条件。本实施例为血管内皮细胞提供的环境条件综 合了上述实施例3，实施例4及实施例5所分别提供的异常条件，包含了可能引 起血管内皮细胞功能失调进而导致动脉粥样硬化的三类主要影响因素，可对这 些异常条件对血管内皮细胞状态的共同作用效果进行研究。培养一段时间后对 细胞进行免疫荧光检测，即可分析细胞状态。

通过以上设计，该模型能有效地将对血管内皮细胞的物理刺激和化学刺激条 件相结合，采用光学透明材料制备，易于肉眼或光学显微镜下实时观察细胞的 状态，条件控制简单。在芯片的设计上，与现有技术相比，可以实现芯片中薄 膜的双向对称拉伸，减少其余方向不必要的形变。