利用荧光光谱法检测葡萄藻脂质含量的前处理及测定方法

摘要

本发明涉及葡萄藻开发利用的技术，旨在提供一种利用荧光光谱法检测葡萄藻脂质含量的前处理及测定方法。该方法是将待测葡萄藻液置于离心管，加入微粒型的黄单胞多糖，然后置于冰水浴中，并用超声波将由几十至上百个细胞形成的葡萄藻集落制备成均匀分布的单细胞或几个细胞的聚集体，以满足荧光光谱测定法对被测藻液均匀度的要求。本发明方法具有藻液用量少、灵敏度高、稳定性好、省时省力，且可实现高通量测量等优点，可为葡萄藻育种和培养等研发提供必要的技术方法。

说明书

技术领域

本发明属于能源微藻——葡萄藻开发利用的技术，特别涉及一种利用 荧光光谱法检测葡萄藻脂质含量的前处理及测定方法。

背景技术

葡萄藻（Botryococcus）是一种世界广布的能源微藻，该藻因脂质的 含量高（可达细胞干重85％）、且组成和结构与化石原油相近，而被 誉为“油藻”，以其生产航空燃油等高品质燃料一直是近年来全球生 物能源领域的研发热点之一[Metzger & Largeau. Botryococcus  braunii: a rich source for hydrocarbons and related  ether lipids. Appl Microbiol Biotechnol. 2005, 66: 48 6–496]。建立快速、微量、可靠的脂质含量检测技术是开展葡萄藻等 微藻种质改良和培养模式优化等研发的重要基础，国内外已将尼罗红 荧光法成功地用于小球藻等微藻的脂质含量快速检测[王金娜等. 产 油微藻的筛选及中性脂动态积累过程的检测. 生物物理学报. 2010 , 26(6): 472-480]。但值得指出的是，葡萄藻细胞不像小球藻等微 藻细胞那样以游离的单细胞形式存在，而通常是由几十至上百个细胞 形成集落。这种集落状的细胞团因体积大且易于下沉而难以在培养液 中均匀分布，从而严重影响应用尼罗红荧光法检测其脂质含量的可行 性与准确性。正因如此，目前在葡萄藻研发中仍多沿用传统的干重法 检测其脂质含量，这也是导致多年来国内外葡萄藻育种、培殖和深加 工等方面研发进展缓慢的重要原因之一[Yaming Ge, et al.  G rowth characteristics of Botryococcus braunii 765 unde r high CO₂ concentration in photobioreactor. Bioresour ce Technology. 2011, 102(1): 130–134]。因此，迫切需要建 立一种方法，能将集落状的葡萄藻细胞团制备成能均匀分布的单细胞 或由几个细胞组成的小细胞团，以满足荧光光度测定法对样品的要求 ，从而将具快速、微量、可靠的尼罗红荧光脂质含量检测技术用于葡 萄藻的研究与开发。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，建立一种利用 荧光光谱法检测葡萄藻脂质含量的前处理及测定方法。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种利用荧光光谱法检测葡萄藻脂质含量的前处理方法，其特征 在于，该方法是：将待测葡萄藻液置于离心管，加入微粒型的黄单胞 多糖（Xanthan gum），然后置 于冰水浴中，并用超声波将由几十至上百个细胞形成的葡萄藻集落制 备成均匀分布的单细胞或几个细胞的聚集体，以满足荧光光谱测定法 对被测藻液均匀度的要求。

该方法具体包括以下步骤：

(1) 取4 mL待测葡萄藻液于5 mL离心管中，再加入适量微粒型黄单 胞多糖，并置于冰水浴中预冷；

(2) 预冷藻液经超声波处理10 s后，在光学显微镜下观察葡萄藻集 落是否已被分散成单细胞或2-5个细胞的聚集体； 

(3) 若没有，则可用每次5 s的超声波进行多次处理，直至被分散成 单细胞或2-5个细胞的聚集体，由此可计算被测葡萄藻液适宜的超声处 理时间T=10+5*n，单位为s，其中n为每超声处理5 s的次数。

所述微粒型黄单胞多糖的添加量为5粒，0.2 mg/粒，共1 mg。

本发明进一步提供了基于前述方法的荧光光谱法测定葡萄藻脂质含量 的方法，其过程包括：将经过前处理的葡萄藻液加入二甲基亚砜水溶 液和尼罗红水溶液，二甲基亚砜辅助尼罗红进入葡萄藻细胞，使胞内 脂质与尼罗红生成荧光产物；于490 nm光子激发下检测568 nm的荧 光发射光谱，获得被测葡萄藻的荧光发射光强度（I）；将所得结果与 空白样本进行比较后，再与油脂标准品——三油酸甘油酯的荧光发射 光强度曲线进行比较，通过对应的光强度值得到被测葡萄藻样品中脂 质含量。

该方法具体包括以下步骤：

 (1) 取200 μL经前处理的葡萄藻液于荧光测量皿中，依次加入1 5%(V/V)二甲基亚砜水溶液和3 μg/mL尼罗红溶液各200 μL，充分 混匀后于黑暗中40℃染色10 min，再利用荧光分光光度计于490 nm 光子激发下检测568 nm的荧光发射光强度（I）；同时，取200 μL 葡萄藻培养液于另一荧光测量皿中，依次加入15%(V/V)二甲基亚砜水 溶液和3 μg/mL尼罗红溶液各200 μL，充分混匀后于黑暗中40℃染 色10 min，进而利用荧光分光光度计于490 nm光子激发下检测568  nm的荧光发射光强度（I_B），以此为对照；被测葡萄藻中脂质的相对 荧光强度值I_S=I-I_B；

(2) 以三油酸甘油酯为脂质含量测定的标准品，在5个1 ml的EP离心 管中依次加入200 μg/mL的三油酸甘油酯DMSO水溶液[DMSO含量为3% (V/V)] 0、50、100、150和200 μL，并用蒸馏水补齐至200 μL， 依次加入15%(V/V)二甲基亚砜水溶液和3 μg/mL尼罗红溶液200 μ L，充分混匀后于黑暗中40℃染色10 min，再利用荧光分光光度计于 490 nm光子激发下检测568 nm的相对荧光发射光强度值（I_R），以 三油酸甘油酯加入量m为横坐标、I_R为纵坐标，作两者的标准曲线，并 得到线性拟合方程I_R=f(m)；

(3) 以步骤(1)中测得葡萄藻中脂质的相对荧光强度值I_S替代步骤(5 )线性拟合方程I_R=f(m)中的I_R，通过计算即可求得200 μL被测葡萄 藻液中脂质的质量m_s（单位为μg）；

(4) 200 μL待测葡萄藻液的干藻质量M_s (单位为μg)可用干重称 量法测定，被测葡萄藻的脂质含量C_L=(m_s/M_s)×100%。

本发明中，设定超声波仪的频率为20 kHz，发射功率为100 W，将Φ 2型变幅杆前端2 cm浸入预冷藻液，以1 s / 1 s (开/关)间歇 超声处理15~25 s。

本发明中，3 μg/mL尼罗红溶液的配制方法为，称取1.5 mg尼罗红 并用5 ml丙酮溶解，再用蒸馏水定容至500 ml。

与现有技术相比，本发明的显著优点：

本发明方法与传统的干重检测法等方法相比，具有藻液用量少、灵敏 度高、稳定性好、省时省力，且可实现高通量测量等优点，可为葡萄 藻育种和培养等研发提供必要的技术方法。

具体实施方式

利用荧光光谱法测定葡萄藻脂质含量时，要求藻细胞能均匀地分布于 培养液中。为将细胞呈集落状的葡萄藻制备成能均匀分布的单细胞或 几个细胞的聚集体，本方法用适当功率超声波进行处理，使其尽可能 分散。为减少超声波对藻细胞的机械损伤，以及克服葡萄藻细胞的体 积和密度比小球藻等微藻细胞的大而易下沉的难题，本方法于超声处 理前在藻液中加入少量黄单胞多糖（Xanthan gum），达到了很好的 效果。这主要是基于黄单胞多糖具有以下三方面特性：(1) 它水溶性 好、透明无色、性能稳定，在低于0.5‰浓度时，不影响微藻脂质含量 测定；(2) 它能在藻细胞表面形成膜状物，且可使超声波能量传递变 得更加平缓，从而有助减少超声波对藻细胞造成的机械损伤；(3) 少 量黄单胞多糖即可显著增加液体的密度，从而可通过减缓藻细胞下沉 ，使藻细胞分布得更均匀。同时，尼罗红（9-(diethylamino) benz o[a]phenoxazin-5(5H)-one）是一类亲脂性的噁嗪类染料，进入藻细 胞后能与胞内脂质结合并发出特异波长的荧光，因而在尼罗红足量的 前提下，通过测定荧光强度值即可表征被测样品的脂质含量。本方法 在尼罗红染色荧光检测体系中加入具“万能溶剂”之称的二甲基亚砜 (DMS)可辅助尼罗红进入细胞，使胞内脂质能与尼罗红充分结合生成荧 光产物，进而通过测定荧光强度即可根据标准曲线计算出葡萄藻的脂 质含量。本方法比传统方法具更高的灵敏度、重复性和简便性，且可 实现高通量测量。

下面通过具体实施例子，对本发明的实现方式进行详细描述。

本发明的技术方案可以通过以下步骤实现：

1、选用样本材料：以公知的葡萄藻品系UTEX 572（保藏单位: Cul ture Collection of Algae at the University of Texas  at Austin；地址: The University of Texas at Austin,  The Culture Collection of Algae (UTEX), 205 W. 24th  St. Stop A6700, Austin, TX 78712-1240,  USA）为材料，这株品系是实验室常用的葡萄藻，在发明人所在的浙江 大学原子核农业科学研究所生物资源与分子工程实验室也有保存，可 随时提供样本。

2、试剂和仪器：本发明中所用的微粒型黄单胞多糖（Xanthan gum， 约0.2 mg/粒）、尼罗红（NR）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxid e, DMSO）、脂质标准品三油酸甘油酯均为美国Sigma公司产品，丙酮 等为国产，均为分析纯；微粒型黄单胞多糖是指用造粒-干燥设备先将 黄单胞多糖等物料制成大小均匀的圆球体颗粒、再进行干燥而获得的 微粒状剂型，其单粒重可通过调整工艺参数进行调控。JY92-II型超声 波发生仪由宁波新芝生物科技股份有限公司生产；TE214S型电子天平 为北京赛多利斯产品；RF-5301PC型荧光分光光度计为日本岛津产品。

3、利用荧光光谱法测定葡萄藻脂质含量的样品前处理方法的主要步骤 如下：

(1) 取4 mL待测光密度值的葡萄藻液于5 mL离心管中，再加入5粒 （约1 mg）微粒型黄单胞多糖（Xanthan gum），并置于冰水浴中预 冷；

(2) 设定超声波仪的频率为20 kHz，发射功率为100 W，将Φ2型变 幅杆前端2 cm浸入步骤(1)的预冷藻液，以1 s / 1 s (开/关) 间歇超声10 s后，用玻璃吸管取约10 μL藻液在光学显微镜下观察 葡萄藻集落是否已被分散成单细胞或2-5个细胞的聚集体；

(3) 若葡萄藻集落未被分散成单细胞或2-5个细胞的聚集体，则按步 骤(2)中的方法再超声处理5 s，再用光学显微镜下观察是否已被分散 成单细胞或2-5个细胞的聚集体；

(4) 重复步骤(3)，直至将葡萄藻集落分散成单细胞或2-5个细胞的聚 集体，由此可计算被测葡萄藻液适宜的超声处理时间T=10+5*n，单位 为s,其中n为每超声处理5 s的次数；

(5) 取200 μL经超声处理T秒后的葡萄藻液于荧光测量皿中，依次 加入15%(V/V)二甲基亚砜水溶液和3 μg/mL尼罗红溶液（称取1.5  mg尼罗红并用5 ml丙酮溶解，再用蒸馏水定容至500 ml）各200 μ L，充分混匀后于黑暗中40℃染色10 min，再利用荧光分光光度计于 490 nm光子激发下检测568 nm的荧光发射光强度（I）；同时，取2 00 μL葡萄藻培养液于另一荧光测量皿中，依次加入15%(V/V)二甲基 亚砜水溶液和3 μg/mL尼罗红溶液（称取1.5 mg尼罗红并用5 ml丙 酮溶解，再用蒸馏水定容至500 ml）各200 μL，充分混匀后于黑暗 中40℃染色10 min，进而利用荧光分光光度计于490 nm光子激发下 检测568 nm的荧光发射光强度（I_B），以此为对照；被测葡萄藻中脂 质的相对荧光强度值I_S=I-I_B。

(6) 以三油酸甘油酯为脂质含量测定的标准品，在5个1 ml的EP离心 管中依次加入120 μg/mL的三油酸甘油酯DMSO水溶液[DMSO含量为3% (V/V)] 0、50、100、150和200 μL，并用蒸馏水补齐至200 μL， 依次加入15%(V/V)二甲基亚砜水溶液和3 μg/mL尼罗红溶液（称取1 .5 mg尼罗红并用5 ml丙酮溶解，再用蒸馏水定容至500 ml）200  μL， 充分混匀后于黑暗中40℃染色10 min，再利用荧光分光光度计于490  nm光子激发下检测568 nm的相对荧光发射光强度值（I_R），以三油 酸甘油酯加入量m为横坐标、I_R为纵坐标，作两者的标准曲线，并得到 线性拟合方程I_R=f(m)；

(7) 以步骤(5)中测得葡萄藻中脂质的相对荧光强度值I_S替代步骤(6 )线性拟合方程I_R=f(m)中的I_R，通过计算即可求得200 μL被测葡萄 藻液中脂质的质量m_s（单位为μg）；

(8) 200 μL待测葡萄藻液的干藻质量M_s (单位为μg)可用干重称 量法测定，被测葡萄藻的脂质含量C_L=(m_s/M_s)×100%。

4、结果与分析

根据实验结果，葡萄藻品系UTEX 572藻液在含0.25‰黄单胞多糖（X anthan gum）的情况下，经20 s (n=2)超声处理，由几十至上百个 细胞形成的集落被分散成以单细胞为主、少数呈2-5个细胞的聚集体。 这种经超声处理的藻液，藻细胞能在5 min内保持均匀分布，因而满 足荧光光度法测量一般需要样品在2 min内保持均匀分布的要求。同 时，实验结果显示，三油酸甘油酯的质量m与相对荧光强度I_R的回归方 程为m=0.0643*I_R，测得200 μL被测葡萄藻液的相对荧光强度值I_S= 742.4，则相应的脂质质量m_s=47.7 μg；按Rao等（Influence of  CO₂ on growth and hydrocarbon production in Botryococ cus braunii. J. Microbiol. Biotechnol. 2007, 17: 414– 419) 干重称量法测得200 μL待测葡萄藻液的干藻质量M_s=106.6  μg，则被测葡萄藻的脂质含量C_L=(m_s/M_s)×100%=47.7/106.6×100% =44.7%。用传统干重法得被测葡萄藻的脂质含量为44.2%。可见，呈集 落状的葡萄藻液经本方法处理后，其脂质含量可用具快速、微量、可 靠等优势的尼罗红荧光光谱法进行检测。

作为实例，我们分别选取公知的2株葡萄藻品系UTEX 2441和UTEX B 2629来验证本发明的实用性。利用本发明方法，UTEX 2441和UTEX  B2629分别经15 s和25 s超声处理，即可制得以单细胞为主、少数呈 2-5个细胞的聚集体，并测得脂质含量分别为39.4%和48.6%，与用传统 干重法测得结果38.8%和48.1%相吻合。这些例子进一步说明，本发明 建立的利用荧光光谱法检测葡萄藻脂质含量的前处理及测定方法是有 效和实用的。