快速检测生物细胞死活状态的荧光染色试剂盒及其应用

摘要

本发明涉及一种快速检测生物细胞死活状态的荧光染色试剂盒及其应用，试剂盒包括花青素染料和碘化丙啶染料。检测步骤如下：在细胞悬液中加入试剂盒中的花青素染料和碘化丙啶，利用荧光显微镜观察计数或者利用微孔荧光读板器在发射光波长下进行检测，根据不同颜色荧光值的强弱反映生物样品液中细胞的存活状态。本发明可以快速实时地观察或者检测样品中各种细胞的活细胞与死细胞的数量，直观简便，排除了其它物质的干扰和培养周期长的缺点，不仅适用于动物细胞，并且还适用于大部分的革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌。

说明书

技术领域

本发明属于细胞计数领域，特别涉及一种快速检测生物细胞死活状态的荧光染色试剂盒 及其应用。

背景技术

目前测定活细胞数的方法有光学显微镜读数计数法、平板涂布培养菌落计数法、光电比 浊法、最大或然数法，以及膜过滤法等。

显微镜直接计数法：将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载 玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接观察计数。该方法简便、快速、直观，可以用于酵母、 细菌、霉菌孢子和动物细胞等悬液的计数。缺点为不能准确识别细胞的死活状态，所测得的 结果通常是死细胞和活细胞的总和。

平板菌落计数法：将待测样品经适当稀释，使其中的微生物菌落或动物细胞充分分散成 单个细胞状态，取一定量的稀释样液接种到平板培养基上，经过培养，由每个单细胞生长繁 殖而形成肉眼可见的菌落或细胞群落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。这种方 法广泛适用于生物制品检验(如活菌制剂)，以及食品、饮料和水（包括水源）等的含菌指数 或污染程度的检测。缺点是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以经培养后形 成的单菌落可能来自样品中的2-3个或更多个细胞，或者由于菌体的生长周期不同，在同一 种培养基中由于适应性的差异，有的菌体需要3天即可长出菌落，有的菌体需要1个星期甚 至更长的时间，因此平板菌落计数的结果往往偏低，通常使用菌落形成单位（colony-forming units,cfu）而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速检测生物细胞死活状态的荧光染色试剂盒及 其应用，该试剂盒可以快速实时地观察或者检测样品中各种细胞的活细胞与死细胞的数量， 直观简便，排除了其它物质的干扰和培养周期长的缺点，不仅适用于动物细胞，并且还适用 于大部分的革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌。

本发明的一种快速检测生物细胞死活状态的荧光染色试剂盒，所述试剂盒包括花青素染 料和碘化丙啶染料，花青素染料的储存浓度为5-6mM，碘化丙啶染料的储存浓度为100 μg/mL。

所述花青素染料所使用的稀释缓冲液为1×TE buffer[含1mM EDTA（乙二胺四乙酸）的 10mM Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷-HCl）缓冲液，pH8.0]。这种染料能渗透到所有状态下 的细胞，它倾向于结合细胞内双链DNA，对于单链DNA和RNA的结合较少，对细胞的核 酸进行染色，使细胞发出绿色荧光。

所述花青素染料使用时稀释1000-10000倍。

所述花青素染料溶剂为二甲基亚砜，使用时的工作最终浓度（工作浓度指的是与细胞染 色时的实际浓度）为5-6μM。

花青素染料，其结构式为：

所述碘化丙啶染料的溶剂和稀释剂为超纯水。这种染料只能特定地通过死细胞的细胞膜， 结合到DNA或者RNA上，使细胞发出红色荧光，因此可以检测死亡的细胞。

所述碘化丙啶染料的工作最终浓度为10-20μg/mL。

所述花青素染料的溶剂为二甲基亚砜，碘化丙啶染料的溶剂为超纯水。

本发明的一种快速检测生物细胞死活状态的荧光染色试剂盒的应用，检测步骤如下：在 细胞悬液中加入试剂盒中的花青素染料和碘化丙啶，利用荧光显微镜观察计数或者利用微孔 荧光读板器在发射光波长下进行检测，根据不同颜色荧光值的强弱反映生物样品液中细胞的 存活状态。

所述利用荧光显微镜观察计数的具体步骤包括：

（1）吸取细胞悬液于包有锡箔纸的离心管中；

（2）以体积比为7:3（细胞悬液与混合染料的配比）的比例加入体积比为1-2:1的花青素染料 和碘化丙啶的混合染料，上下摇动，置于黑暗中10-30分钟；或者加入体积比为4:1（细胞悬 液与染料的配比）的花青素染料，上下摇动，置于黑暗中10-30分钟，测活体；或者加入体 积比为9:1（细胞悬液与染料的配比）的PI染料，上下摇动，置于黑暗中10-30分钟，测死 体；

（3）将染过色的细胞样品液通过0.2μm的黑色过滤膜（Whatman）过滤，使细胞截留在黑 色过滤膜上，将过滤膜转移到载玻片上，在膜中央滴一滴无荧光精油，盖上盖玻片；

（4）将玻片置于荧光显微镜下，在盖玻片中央滴一滴无荧光镜油，用100倍的油镜观察，分 别在花青素染料和PI染料的最适激发光（花青素染料的最适激发光为488nm，PI染料的最适 激发光为522nm）下进行检测，目镜中呈绿色的细胞是活体，呈红色的细胞是死体。

所述利用微孔荧光读板器在发射光波长下进行检测的具体步骤包括：

（1）将含有细胞的培养基经过0.2μm的过滤膜过滤，将收集的细胞用生理盐水重悬；

（2）在微孔板中加入细胞悬液，以体积比为7:3（细胞悬液与混合染料的配比）的比例在微 孔中加入体积比为1-2:1的花青素染料和碘化丙啶的混合染料，上下摇动，置于黑暗中10-30 分钟；或者加入体积比为4:1（细胞悬液与染料的配比）的花青素染料，上下摇动，置于黑暗 中10-30分钟，测活体；或者加入体积比为9:1（细胞悬液与染料的配比）的PI染料，上下 摇动，置于黑暗中10-30分钟，测死体；微孔内总体积不超过300μL，染色10-30分钟，在 激发光为460nm-500nm，发射光为500nm-530nm的条件下检测其荧光强度值，荧光的强弱 反映了此细胞悬液中活体的数量，在激发光为460nm-530nm，发射光为600nm-640nm的条 件下检测其荧光强度值，荧光的强弱反映了此细胞悬液中死体的数量。

本发明的原理是采用两种荧光染料对细胞的核酸进行荧光标记，根据在培养过程中细胞 的生物活性的不同，细胞会发出不同的荧光，根据荧光强度的不同反映了不同生物活性的细 胞在培养基中的比例。该技术的建立为深入研究各种生物细胞的存活状态提供了通用方法和 技术。特别是对木醋杆菌等尺寸更小微生物细胞的生物学特性及细菌纤维素的合成过程提供 了一种简便可行的方法。

检测原理：当在细胞悬液中同时加入两种染料，花青素染料能进入所有的细胞，使细胞 发出绿色荧光。当细胞处于存活状态，则细胞膜只允许花青素染料进入细胞，PI染料不能进 入细胞，则存活状态的细胞只显示绿色荧光。当细胞处于濒死状态，细胞膜的通透性增大， PI会部分进入到细胞中，嵌入到已染有绿色荧光的细胞的核酸部分，覆盖掉部分绿色荧光， 使细胞发出部分的红色荧光，在显微镜下检测到的是细胞发出橙色荧光。当细胞处于死亡状 态，则PI能够大量地通过细胞膜，嵌入到细胞的核酸上，覆盖掉花青素的绿色荧光，则死亡 的细胞会整体显示红色荧光。

有益效果

本发明可以快速实时地观察或者检测样品中各种细胞的活细胞与死细胞的数量，直观简 便。并且花青素染料来源于自然界，毒性低，便于使用。由于染料只能专一性地结合在双链 核酸上发出荧光，排除了其它物质的干扰和培养周期长的缺点。此染色方法不仅适用于动物 细胞，并且还适用于大部分的革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌。

附图说明

图1为用荧光显微镜检和涂平板法检测同一体系的木醋杆菌，检测结果的对比；

图2为花青素染料染色菌体的最佳染料浓度，RFU=染色菌体总荧光强度-菌体空白荧光-染料 空白的荧光。

图3为PI染料染色菌体的最佳染料浓度，RFU=染色菌体总荧光强度-菌体空白荧光-染料空白 的荧光；

图4为用试剂盒检测按不同的死菌和活菌的比例混合的金黄色葡萄球菌悬液，其RFU累计强 度的比值变化，RFU=染色菌体总荧光强度-菌体空白荧光-染料空白的荧光；

图5为用试剂盒检测按不同的死菌和活菌的比例混合的大肠杆菌悬液，其RFU累计强度的比 值变化，RFU=染色菌体总荧光强度-菌体空白荧光-染料空白的荧光；

图6为用试剂盒检测按不同的死菌和活菌的比例混合的木醋杆菌悬液，其RFU累计强度的比 值变化，RFU=染色菌体总荧光强度-菌体空白荧光-染料空白的荧光；

图7为用试剂盒检测木醋杆菌活菌的标准曲线；

图8为用试剂盒检测木醋杆菌死菌的标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

（1）花青素染料用二甲亚砜（DMSO）溶解至5-6mM浓度，此为配制的花青素染料储存浓 溶液。

（2）PI染料用超纯水溶解至100μg/mL，避光储存

（3）吸取1mL的木醋杆菌菌液于包有锡箔纸的2mL离心管中。

（4）加入300μL经缓冲液稀释1000倍后的花青素染料和200μL的100μg/mL PI染料，上 下摇动多次，置于黑暗中10-30分钟，稀释缓冲液为1×TE buffer(含1mM EDTA的 10mM Tris-HCl缓冲液，pH8.0)。

（5）将染过色的菌液通过0.2μm的黑色过滤膜（Whatman）过滤，将菌体截留在黑色过滤 膜上，将过滤膜转移到载玻片上，在膜中央滴一滴无荧光精油，盖上盖玻片。

（6）将玻片置于荧光显微镜100倍物镜下观察，由于不同的染料有不同的最适激发波段， 因此需要在花青素染料和PI染料的最适激发光下进行检测，目镜中呈绿色的菌体是活 菌体，呈红色的菌体是死菌体。从同一体系中取出1mL的木醋杆菌，将其稀释10倍， 100倍，1000倍，10000倍，将稀释好的菌体分别涂平板，待长出菌落，将计算所得 的菌落数量与荧光显微镜的实验结果进行对比（实验结果如图1）。实验结果表明，使 用荧光显微镜所测得的菌体数量结果比用平板菌落计数法所得的检测结果平均高出 1-2个数量级，这与文献中报道的相同，由于使用平板计数法时待测样品往往不易完全 分散成单个细胞，所以经培养后形成的单菌落可能来自样品中的2-3个或更多个细胞， 因此平板菌落计数的结果往往偏低。但是其与荧光显微镜法检测的结果线性关系良好， R²=0.9872。

实施例2

（1）将花青素染料储存浓溶液稀释1000倍至20000倍，用体积相同但稀释倍数不同的染料 按实施例1中的步骤1-3来染色菌体，使用Molecular Devices Flexstation II型钙流荧光 仪进行检测，发现菌体的荧光强度随染料的稀释倍数的增加而下降，当稀释5000倍时， 其染色效果较好且染料用量相对较低，比较经济。若稀释倍数增大，所检测到的荧光 值接近误差限所在范围，检测值的误差增大（实验结果如图2）。

（2）将染料PI的浓度配制成从1μg/mL到100μg/mL，用体积相同但稀释倍数不同的染料 染色菌体，发现浓度为10μg/mL时其染色效果最好（实验结果如图3）。

实施例3

（1）将金黄色葡萄球菌培养到菌浓的浊度OD值为0.7，取25mL菌液在12000r/min条件 下离心10-15分钟；

（2）收集菌体重悬于2mL的生理盐水中；

（3）取1mL菌液溶于20mL生理盐水，另取1mL溶于20mL70%异丙醇中；

（4）每15分钟搅拌一次，室温孵育1小时；

（5）在12000r/min条件下离心10-15分钟；

（6）分别重悬于20mL的生理盐水，再离心洗涤，操作步骤同上；

（7）分别用10mL的生理盐水重悬，将活菌与死菌按照表一的比例进行混合；

表一

活菌与死菌的比例 活菌的体积（mL） 死菌的体积（mL） 0:100 0 2 10:90 0.2 1.8 50:50 1 1 100:0 2 0

（8）在微孔板中加入140μL混合好的菌液，在暗室条件下加入40μL的5mM花青素染料 和20μL的100μg/mL PI染料，在激发光为488nm下进行激发，分别在522nm和622 nm的检测光下进行检测，将522nm下测得的荧光强度除以622nm下测得的荧光强度， 得到RFU的比值。然后以活菌的比例对RFU比值作图，回归得到回归方程和R²值， 实验结果如图4。结果显示回归方程的线性很好，R²=0.9599，说明该试剂盒中的染料 染色细胞后，在相关激发波长下激发的荧光强度与细胞的死活状态能很好地对应。

实施例4

（1）将大肠杆菌培养到菌浓的浊度OD值为1.2，取25mL菌液在12000r/min条件下离心 10-15分钟；

（2）收集菌体重悬于2mL的生理盐水中；

（3）取1mL菌液溶于20mL生理盐水，另取1mL溶于20mL70%异丙醇中；

（4）每15分钟搅拌一次，室温保温孵育1小时；

（5）在12000r/min条件下离心10-15分钟；

（6）分别重悬于20mL的生理盐水，再离心洗涤，操作步骤同上；

（7）分别用10mL的生理盐水重悬，将活菌与死菌按照表一的比例进行混合；

（8）在微孔板中加入140μL混合好的菌液，在暗室条件下加入40μL的5mM花青素染料 和20μL的100μg/mL PI染料，在激发光为488nm下进行激发，在522nm和622nm 的检测光下进行检测，将522nm下测得的荧光强度除以622nm下测得的荧光强度， 得到RFU的比值。然后以活菌的比例对RFU比值作图，回归得到回归方程和R²值， 实验结果如图5。结果显示回归方程的线性很好，R²=0.9804，说明该试剂盒中的染料 染色细胞后，在相关激发波长下激发的荧光强度与细胞的死活状态能很好地对应。

实施例5

（1）将25mL木醋杆菌用0.22μm的过滤膜过滤，用2mL生理盐水重悬；

（2）取1mL菌液溶于1mL的生理盐水，另取1mL菌液用1mL5%戊二醛固定；

（3）每15分钟搅拌一次，室温下放置1小时；

（4）用0.22μm的过滤膜过滤，将截留于过滤膜上的菌体用生理盐水洗涤两次。

（5）将洗涤过的活菌体与死菌体分别重悬于10mL的生理盐水中，按照表二的比例将活菌 与死菌混合。

（6）在微孔板中加入140μL混合好的菌液，在暗室条件下加入5mM花青素染料和20μL 的100μg/mL PI染料，在激发光为488nm下进行激发，在522nm和622nm的检测 光下进行检测，将522nm下测得的荧光强度除以622nm下测得的荧光强度，得到 RFU的比值。然后以活菌的比例对RFU比值作图，回归得到方程和R²值，实验结果 如图6。结果显示回归方程的线性很好，R²=0.977，说明该试剂盒中的染料染色细胞 后，在相关激发波长下激发的荧光强度与细胞的死活状态能很好地对应。

表二

活菌与死菌的比例 活菌的体积（mL） 死菌的体积（mL） 0:100 0 2 20:80 0.4 1.6 50:50 1 1 80:20 1.6 0.4

实施例6

（1）将木醋杆菌用0.22μm的过滤膜过滤，用生理盐水重悬制成菌悬液。向菌悬液中加入 花青素染料和PI染料，从同一体系中取出一部分用于荧光显微镜检测，一部分用于荧 光读板器检测，将荧光显微镜中的细菌染色数目和读板器中所读的荧光强度值比对做 图，得到木醋杆菌活菌数与荧光强度的对应关系（实验结果如图7），以及木醋杆菌死 菌数与PI染色获得的荧光强度的对应关系（见图8）。

图7显示花青素染料染色木醋杆菌的菌浓与荧光强度RFU的相关系数R²=0.9379， 说明线性很好。

图8显示PI染料染色木醋杆菌的死菌浓度与荧光强度RFU的相关系数R²=0.9723， 说明PI染色后生成的荧光强度与死菌浓度之间的线性关系也很好。

（2）花青素染料和PI染色的检出灵敏度为菌浓为10⁵，最高检测限为菌浓10⁹。

（3）荧光读板器的检测存在误差，荧光显微镜的示数在菌量过多的情况下，计数结果会存 在误差，菌液的稀释也会存在误差，往往并不能准确地按照数量级逐级稀释。