新山楂酸衍生物、其制备方法及其在抗肿瘤药物中的应用

摘要

本发明属于天然药物化学领域，涉及化学结构通式为式(1)所示的两种新化合物1和2的制备；本发明还涉及该新化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。其制备方法是利用发明人筛选的对山楂酸具有结构修饰能力的总状共头霉菌种，在优化条件下发酵培养，对山楂酸进行转化7～10天，转化产物用有机溶剂萃取，分离纯化得到两个新的山楂酸衍生物。

说明书

技术领域

本发明属于天然药物化学领域，涉及新的山楂酸衍生物及其制备方法，以及新化合物在抗肿瘤方面的应用。 

背景技术

山楂酸为齐墩果烷型五环三萜类化合物，存在于油橄榄、藿香根、大花紫薇、石榴花、水杨梅等植物中。由于山楂酸的化学结构中存在活泼的双键、羟基、羧基官能团，因而具有广泛的生物学活性，如抗HIV、抗肿瘤、抗II型糖尿病、抗氧化等作用。 

发明内容

本发明的目的是提供了一类新的山楂酸衍生物。 

本发明的另一个目的是提供了新山楂酸衍生物的制备和抗肿瘤用途。 

本发明是通过如下技术方案完成的，具体内容包括：山楂酸的微生物转化反应、产物提取分离及结构鉴定、体外抗肿瘤活性评价。 

(1)山楂酸的微生物转化反应 

将山楂酸溶于乙醇溶液中，配成浓度为10～30g/L的底物溶液，加入到在25～28℃，150～250rpm/min条件下培养了1～3天的微生物中，转化反应条件为：25～28℃，150～250rpm/min，7～10天。 

(2)产物的提取分离纯化 

转化结束后，用乙酸乙酯等有机溶剂萃取，减压浓缩，经硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、反相硅胶柱色谱和半制备高效液相色谱分离纯化得到化合物1、化合物2。 

(3)新化合物体外抗肿瘤活性评价 

将新化合物作用于人肺癌细胞A-549、人胃癌细胞SGC-7901、人宫颈癌细胞Hela，评价其抗肿瘤效果。 

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步说明，但其并不限制本发明的保护范围。 

实施例1 

新化合物1、2的制备及提取分离 

在10瓶1000ml(每瓶400mL培养基)的三角瓶中以2％的接种量接入总状共头霉Syncephalastrum racemosum 3.2500菌种，置恒温振荡器中，180rpm、27℃培养72小时后加入500mg底物山楂酸(溶于30ml乙醇中，每瓶加入2ml)，继续培养10天。发酵完成后，过滤菌丝体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取三次，菌丝体干燥后粉碎，用500mL乙酸乙酯超 声提取三次，每次30min，合并乙酸乙酯萃取液与提取液，置旋转蒸发仪上浓缩至小体积，干燥，得转化反应提取物(1.62g)。 

将提取物用少量丙酮溶解，两倍硅胶拌样，32g硅胶分离，石油醚/四氢呋喃梯度洗脱(从20∶1到1∶1，共2400ml)，收集到五个流分：A(581.9mg)，B(61.1mg)，C(136.7mg)为未反应的山楂酸，D(98.8mg)，E(433.4mg)，流分D用半制备型高效液相色谱仪制备，流动相：乙腈/水(1∶1)，流速：3mL/min，检测波长210nm，得到化合物1(17.6mg)，流分E用半制备型高效液相色谱仪制备，流动相：甲醇/水(72∶28)，流速：3mL/min，检测波长210nm，得到化合物2(45.2mg)。 

实施例2 

新化合物1结构鉴定 

新化合物1为无色针状结晶，HR-ESI-MS给出487.3444([M-H]-)，结合¹H-NMR和 ¹³C-NMR推断确定分子式为C₃₀H₄₇O₅。¹H-NMR(600MHz，pyridine-d₅)中，显示该化合物有七组甲基氢信号δ0.99(3H，s)，1.02(3H，s)，1.08(3H，o)，1.28(6H，s)，1.30(6H，o)；低场处有一活泼氢信号：δ5.53(s)，推测可能是双键上的氢。¹³C-NMR中显示两个不饱和碳原子δ123.1和δ144.4，一个羧基碳原子δ179.7。综合以上信息可以推断该化合物为齐墩果烷型五环三萜酸类化合物。 

依据HSQC、HMBC谱可以对化合物1的碳氢作进一步的归属。 

与山楂酸比较，¹H-NMR谱中，化合物1在δ3.99(dt，J＝7.0，10.0Hz)出现一个氢信号； ¹³C-NMR谱中，在δ72.8处出现一个连氧碳信号，在HSQC谱中二者相关，同时C-20和C-22分别向低场位移6.2ppm和8.9ppm，以上数据说明C-21位连有羟基，H-21ax与H-22ax的耦合常数为10.0Hz，确定该羟基为β型，综上，确定化合物1的结构为：2α，3β，21β-三羟基-12-烯-28-齐墩果酸，为一新化合物，其¹H-NMR谱、¹³C-NMR谱信号归属见表1。 

表1.化合物1的¹H NMR和¹³C NMR数据 

新化合物2结构鉴定 

化合物2为无色针状结晶，HR-ESI-MS给出485.3261([M-H]^-)，结合¹H-NMR和¹³C-NMR推断确定分子式为C₃₀H₄₅O₆。¹H-NMR谱中，显示该化合物具有七个甲基氢原子信号δ0.99(6H，s)，1.09(3H，s)，1.18(3H，s)，1.21(3H，s)，1.28(3H，s)，1.31(3H，s)；低场处有一活泼氢信号δ5.57(s)，推测可能是双键上的氢。¹³C-NMR中显示两个不饱和碳原子δ124.1和δ142.9，一个羧基碳原子δ178.0。综合以上信息可以推断该化合物为齐墩果烷型五环三萜酸类化合物。 

依据HSQC、HMBC谱可以对化合物2的碳氢作进一步的归属。 

¹³C-NMR谱中，在δ213.8处出现一个羰基碳信号，说明可能发生了羰基化反应。在HMBC谱中，δ213.8与δ2.63(H-22)、δ1.18(H-29)、δ1.31(H-30)远程相关，且C-20和C-22分别向低场位移了15.0ppm和14.6ppm。以上数据说明化合物2是山楂酸21位羰基化的产物，所以确定化合物2的结构为：2α，3β-二羟基-21-氧代-12-烯-28-齐墩果酸，为一新化合物，其¹H-NMR谱、¹³C-NMR谱信号归属见表2。 

表2.化合物2的¹H NMR和¹³C NMR数据 

实施例3 

新化合物体外抗肿瘤活性评价 

将人肺癌细胞A-549、人胃癌细胞SGC-7901、人宫颈癌细胞Hela分别接种于装有含有10％胎牛血清和100U/ml青霉素和链霉素的DMEM培养基的培养瓶中，置于37℃、5％CO₂的孵箱中培养，2-3天传代一次。传代：用0.25％胰酶消化至细胞变圆，吸出胰酶，加入带血 清的培养基，反复吹打后，以1∶4的比例稀释接种于新培养基中。 

进行实验时将培养的细胞消化后得细胞悬液，以5×10⁴个/mL的细胞密度接种于96孔培养板，每孔100μl，于37℃、5％CO₂的孵箱中培养，24h后，将培养基换为含有不同浓度的山楂酸及其衍生物(0，10，20，30，40，50，60，70，80，100μM)的DMEM培养基，继续培养48h后，加20μl/孔MTT(5mg/ml)，继续培养4h后，吸出孔内的培养液，加DMSO(150μl/孔)，在490nm下测其吸光度值(OD值)，计算IC₅₀。 

实验结果见表3，结果显示本发明新化合物1的抗肿瘤活性与山楂酸相当；与山楂酸相比，化合物2的抗肿瘤活性明显增强。 

表3化合物1、2及山楂酸对不同肿瘤细胞系的IC₅₀(μM) 

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述可以很容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。