荚膜革兰氏阳性细菌生物缀合物疫苗

摘要

本发明的一种实施方式涉及新的金黄色葡萄球菌生物缀合物疫苗。更通常地，本发明涉及革兰氏阳性和其他生物缀合物疫苗，包含：包含插入的核酸共有序列的蛋白载体；至少一个连接至共有序列的多糖例如荚膜革兰氏阳性多糖；以及可选地佐剂或药学上可接受的载体。在进一步的方面，本发明涉及一种生产革兰氏阳性和其他生物缀合物疫苗的方法。在另一个方面，本发明提供了N-糖基化蛋白，其包含一种或多种多糖，例如革兰氏阳性多糖。本发明还涉及工程化的原核生物体，其包含编码第一原核生物体的糖基转移酶和第二原核生物体的糖基转移酶的核酸序列。本发明进一步包括质粒和用质粒转化的原核细胞，所述质粒编码多糖或生产N-糖基化蛋白和/或生物缀合物疫苗的酶。进一步地，本发明涉及在哺乳动物中诱导免疫应答的方法，包含给药所述生物缀合物疫苗。

说明书

相关申请的引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2010年5月6日提交的美国临时 专利申请No.61/332,170的优先权，以其全文整体并入本文作为参考。

联邦政府资助研究的声明

本发明的一些方面是在国立卫生研究院（National institutes of Health） 授予的授权号1R01AI088754-2，子授权号105699的政府支持下做出的。政 府在本发明的这些方面具有某些权利。

序列表

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背景技术

疫苗是现代医学公共卫生领域中最重大的发明之一，并且已经拯救了 数百万条生命。免疫已被证明是预防和控制感染的理想途径。疫苗每年能 够使多达三百万人免于死亡，并使750,000名儿童免于残疾。（Global Alliance  for Vaccines and Immunization-Press Releases（2006年3月11日）网址： www.gavialliance.org/media_centre/press_releases/2006_03_09_en_pr_queenra  nia_delhi.php）。在1999年，CDC宣布免疫是20世纪最伟大的公共卫生成 就（Ten great public health achievements-United States，1900-1999.MMWR Morb Mortal Wkly Rep48:241-3（1999年4月2日））。一些细菌，诸如引 起破伤风和白喉的细菌，产生在很大程度上引起这些疾病的毒素。该毒素 能够以减毒形式被用作疫苗。然而，对于大多数细菌而言，并没有能够用 于开发疫苗的单一毒素。

最成功的疫苗是诸如流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）、脑膜炎 奈瑟菌（Neisseria meningitidis）和肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae） 的细菌病原体的缀合至载体蛋白的表面多糖。这些细菌被荚膜所包围，其 促进了微生物的致病性和对吞噬细胞杀伤的抗性，并保护其免于干燥。

如果细菌多糖偶联至含有T细胞表位的蛋白载体，其就能够引起人类 的长期免疫应答。这一观点在80年前就已被阐明（Avery，O.T.和W.F. Goebel.1929.Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins.II Immunological specificity of synthetic sugar-proteins. J.Exp.Med.50:521-533），并且之后被联至蛋白载体白喉毒素的B型流感 嗜血杆菌（Haemophilus influenzae type B，HIB）的多糖偶所证实（Anderson， P.1983.Antibody responses to Haemophilus influenzae type b and diphtheria  toxin induced by conjugates of oligosaccharides of the type b capsule with the  nontoxic protein CRM197.Infect Immun39:233-8；Schneerson，R.，O.Barrera， A.Sutton和B.Robbins.1980.Preparation，characterization，and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide-protein  conjugates.J Exp Med152:361-76）。该糖缀合物（glycoconjugate）也是于 1987年在美国被许可的第一种缀合物疫苗，并在之后不久就引入美国婴儿 免疫计划。除了HIB之外，缀合物疫苗也被成功用于对抗荚膜内人病原体 脑膜炎奈瑟菌（N.meningitidis）和肺炎链球菌（S.pneumoniae）。这些疫 苗的常规应用导致了鼻咽部定植和感染的减少。目前大约25%的全球疫苗 市场包含缀合物疫苗。

革兰氏阳性细菌具有被荚膜多糖包围的细胞膜。葡萄球菌 （Staphylococcus）就是一类这样的革兰氏阳性细菌。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）引起感染。金黄色葡萄球菌 是一种机会性细菌病原体，是引起广谱的人类疾病的原因。尽管金黄色葡 萄球菌可以在正常人的黏膜表面定植，但其也是伤口感染的主要原因，并 具有引发严重感染的侵袭能力，包括骨髓炎、心内膜炎和菌血症并伴有代 谢性并发症（Lowy，F.D.1998.Staphylococcus aureus infections.New Engl J  Med339:520-32）。金黄色葡萄球菌是涉及呼吸机相关性肺炎的最常见媒介 之一，并且其也是社区获得性肺炎的重要的和新兴的起因，影响之前身体 健康的成人和缺乏预防风险因素的儿童（Kollef，M.H.，A.Shorr，Y.P. Tabak，V.Gupta，L.Z.Liu和R.S.Johannes.2005.Epidemiology and outcomes  of health-care-associated pneumonia:results from a large US database of  culture-positive pneumonia.Chest128:3854-62；Shorr，A.F.2007. Epidemiology and economic impact of meticillin-resistant Staphylococcus  aureus:review and analysis of the literature.Pharmacoeconomics25:751-68）。

金黄色葡萄球菌是医院内菌血症（nosocomial becteremia）的第二常见 的起因，并且耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistantS.aureus， MRSA）菌株占据了美国加护病房的所有感染的50%以上。医院和社区的 金黄色葡萄球菌的感染还在增加。MRSA菌株在1974年从2%的葡萄球菌 感染一级在2004年从63%的葡萄球菌感染中被分离出来。许多医院内 MRSA菌株是耐多药的，并且即使甲氧西林敏感性菌株也可以是致死性的。 一份最近的报告利用基于种群的活性实例发现，其显示2005年在美国发生 了94,360例侵袭性MRSA感染，并且这些大部分（58%）发生在医院外 （Klevens，R.M.，M.A.Morrison，J.Nadle，S.Petit，K.Gershman，S.Ray， L.H.Harrison，R.Lynfield，G.Dumyati，J.M.Townes，A.S.Craig，E.R.Zell， G.E.Fosheim，L.K.McDougal，R.B.Carey和S.K.Fridkin.2007.Invasive  methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States. JAMA298:1763-71）。在该分析中，相比于AIDS，在2005年更多美国人 死于MRSA（>18,000例死亡）。

金黄色葡萄球菌USA100，也称为纽约/日本克隆，是主要的美国医院 获得性MRSA菌株的MRSA菌株（McDougal，L.K.，C.D.Steward，G.E. Killgore，J.M.Chaitram，S.K.McAllister和F.C.Tenover.2003.Pulsed-field  gel electrophoresis typing of oxacillin-resistant Staphylococcus aureus isolates  from the United States:establishinga national database.J Clin Microbiol 41:5113-20）。

流行病学分析表明，金黄色葡萄球菌每年仅在美国就引起大约两百万 例临床感染（Fridkin，S.K.，J.C.Hageman，M.Morrison，L.T.Sanza，K. Como-Sabetti，J.A.Jernigan，K.Harriman，L.H.Harrison，R.Lynfield和 M.M.Farley.2005.Methicillin-resistant Staphylococcus aureus disease in three  communities.N Engl J Med352:1436-44；King，M.D.，B.J.Humphrey，Y. F.Wang，E.V.Kourbatova，S.M.Ray和H.M.Blumberg.2006.Emergence of  community-acquired methicillin-resistantStaphylococcus aureus USA300 clone as the predominant cause of skin and soft-tissue infections.Ann Intern  Med144:309-17；Klevens，R.M.，M.A.Morrison，J.Nadle，S.Petit，K. Gershman，S.Ray，L.H.Harrison，R.Lynfield，G.Dumyati，J.M.Townes， A.S.Craig，E.R.Zell，G.E.Fosheim，L.K.McDougal，R.B.Carey，S.K. Fridkin和M.I.for the Active Bacterial Core surveillance.2007.Invasive  methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States. JAMA298:1763-1771）。金黄色葡萄球菌感染不仅在数量上增加，而且金 黄色葡萄球菌对抗生素的耐性也在增加。MRSA占了美国医院金黄色葡萄 球菌感染的40%-60%，而这些菌株的大多数是耐多药的。由于作为医院内 感染的主要来源而声名狼藉的金黄色葡萄球菌最近又具有了一个新角色， 即引起缺乏预防风险因素的非医院人群的社区性获得性感染的数目逐渐增 加。恶性社区相关MRSA（CA-MRSA）菌株在美国和欧洲变得更加流行， 已经在全球范围内观察到其传播（Baggett，H.C，T.W.Hennessy，K. Rudolph，D.Bruden，A.Reasonover，A.Parkinson，R.Sparks，R.M.Donlan， P.Martinez，K.Mongkolrattanothai和J.C.Butler.2004.Community-onset  methicillin-resistant Staphylococcus aureus associated with antibiotic use and  the cytotoxin Panton-Valentine leukocidin duringa furunculosis outbreak in  rural Alaska.J Infect Dis189:1565-73；Gilbert，M.，J.MacDonald，D.Gregson， J.Siushansian，K.Zhang，S.Elsayed，K.Laupland，T.Louie，K.Hope，M. Mulvey，J.Gillespie，D.Nielsen，V.Wheeler，M.Louie，A.Honish，G.Keays 和J.Conly.2006.Outbreak in Alberta of community-acquired(USA300) methicillin-resistant Staphylococcus aureus in people with a history of drug use， homelessness orincarceration.Canad Med Assoc J175:149-54；Kazakova，S. V.，J.C.Hageman，M.Matava，A.Srinivasan，L.Phelan，B.Garfinkel，T.Boo， S.McAllister，J.Anderson，B.Jensen，D.Dodson，D.Lonsway，L.K. McDougal，M.Arduino，V.J.Fraser，G.Killgore，F.C.Tenover，S.Cody 和D.B.Jernigan.2005.A clone of methicillin-resistantStaphylococcus aureus  among professionalfootball players.N Engl J Med352:468-75）。

不仅金黄色葡萄球菌对甲氧西林的耐药性变得更为普遍，而且已经报 道了对万古霉素的敏感性降低的多种分离株。已经在美国分离出携带vanA 并对万古霉素具有完全耐性的金黄色葡萄球菌的7种临床分离株。这些分 离株也是耐甲氧西林的（Chang，S.，D.M.Sievert，J.C.Hageman，M.L. Boulton，F.C.Tenover，F.P.Downes，S.Shah，J.T.Rudrik，G.R.Pupp， W.J.Brown，D.Cardo和S.K.Fridkin.2003.Infection with vancomycin-resistant Staphylococcus aureus containing the vanA resistance  gene.New Engl J Med348:1342-7）。由于金黄色葡萄球菌并不能总是被抗 生素所控制，并且MRSA分离株在社区中变得日益流行，因而急切地需要 其他控制策略，例如疫苗。

金黄色葡萄球菌荚膜多糖涉及感染。多种毒性因子促成了葡萄球菌感 染的发病机理，包括表面相关粘附物、分泌的外蛋白和毒素、以及免疫逃 避因子（Foster，T.J.2005.Immune evasion by staphylococci.Nature Reviews  Microbiology3:948-58）。像很多侵袭性细菌病原体一样，金黄色葡萄球菌 产生荚膜多糖（CP）（图4），其通过宿主先天免疫防御来增强对清除的 抗性。金黄色葡萄球菌的大多数临床分离株是包具有荚膜的，并且血清型5 和8菌株占主导地位（Arbeit，R.D.，W.W.Karakawa，W.F.Vann和J.B. Robbins.1984.Predominance of two newly described capsular polysaccharide  types among clinical isolates of Staphylococcus aureus.Diagn Microbiol Infect  Dis2:85-91）。5型（CP5）和8型（CP8）荚膜糖蛋白具有相似的三糖重 复单元，该三糖重复单元包含N-乙酰氨基甘露糖醛酸（ManNAcA）、N- 乙酰L-岩藻糖胺（L-FucNAc）、和N-乙酰D-岩藻糖胺（D-FucNAc）（Jones， C.2005.Revised structures for the capsular polysaccharides from  Staphylococcus aureus types5and8，components of novel glycoconjugate  vaccines.Carbohydr Res340:1097-106。CP5和CP8在血清学上是不同的， 这归因于糖之间的连接和O-酰基化位点的不同（图4）。

之前的研究已经将金黄色葡萄球菌荚膜产生与体外吞噬细胞摄取和杀 死关联起来（Fattom，A.，R.Schneerson，S.C.Szu，W.F.Vann，J.Shiloach， W.W.Karakawa和J.B.Robbins.1990.Synthesis and immunologic properties  in mice of vaccines composed of Staphylococcus aureus type5and type8 capsular polysaccharides conjugated to Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Infect Immun58:2367-74；Thakker，M.，J.-S.Park，V.Carey和J.C.Lee.1998. Staphylococcus aureus serotype5capsular polysaccharide is antiphagocytic and  enhances bacterial virulence in a murine bacteremia model.Infect Immun 66:5183-5189；Watts，A.，D.Ke，Q.Wang，A.Pillay，A.Nicholson-Weller 和J.C.Lee.2005.Staphylococcus aureus strains that express serotype5or  serotype8capsular polysaccharides differ in virulence.Infect Immun 73:3502-11）。人类嗜中性粒细胞在具有补体活性的非免疫血清存在下吞噬 荚膜阴性突变体，而荚膜包被的分离株需要荚膜特异性抗体和补体两者用 于最优化调理吞噬杀除（opsonophagocytic killing）（Bhasin，N.，A.Albus， F.Michon，P.J.Livolsi，J.-S.Park和J.C.Lee.1998.Identification of a gene  essentialfor O-acetylation of the Staphylococcus aureus type5capsular polysaccharide.Mol Microbiol27:9-21；Thakker，M.，J.-S.Park，V.Carey 和J.C.Lee.1998.Staphylococcus aureus serotype5capsular polysaccharide is  antiphagocytic and enhances bacterial virulence in a murine bacteremia model. Infect Immun66:5183-5189；Watts，A.，D.Ke，Q.Wang，A.Pillay，A. Nicholson-Weller和J.C.Lee.2005.Staphylococcus aureus strains that express  serotype5or serotype8capsular polysaccharides differ in virulence.Infect Immun73:3502-11）。Nilsson等人（Nilsson，I.-M.，J.C.Lee，T.Bremell， C.Ryden和A.Tarkowski.1997.The role of staphylococcal polysaccharide  microcapsule expression in septicemia and septic arthritis.Infect Immun 65:4216-4221）报道了与亲代菌株Reynolds相比，来自小鼠的腹膜巨噬细胞 显著地吞噬更大数量的CP5-阴性突变株。被吞噬后，CP5-阳性株比突变株 在细胞内存活更长时间。Cunnion等人（Cunnion，K.M.，J.C.Lee和M.M. Frank.2001.Capsule production and growth phase influence binding of  complement to Staphylococcus aureus.Infect Immun69:6796-6803）比较了同 基因金黄色葡萄球菌株的调理作用，并证明了CP5-阳性株比荚膜突变体结 合少42%的血清补体（C’）。

金黄色葡萄球菌疫苗的开发常规地涉及荚膜作为靶标。由于人类中金 黄色葡萄球菌感染的变化无常的表现和临床复杂性，因此保护对抗葡萄球 菌疾病的疫苗设计变得十分复杂。许多金黄色葡萄球菌疫苗候选物已经在 被感染的动物模型中得到研究，但是据报道仅有两种免疫治疗方案完成了 III期临床试验（Schaffer，A.C和J.C.Lee.2008.Vaccination and passive  immunisation against Staphylococcus aureus.Int J Antimicrob Agents32Suppl l:S71-8）。第一种疫苗是基于在金黄色葡萄球菌的临床菌株中最为流行的 两种荚膜多糖（CP）（图4）。Fattom等人（Fattom，A.R.Schneerson，S. C.Szu，W.F.Vann，J.Shiloach，W.W.Karakawa和J.B.Robbins.1990. Synthesis and immunologic properties in mice of vaccines composed of  Staphylococcus aureus type5and type8capsular polysaccharides conjugated to  Pseudomonas aeruginosa exotoxin.Infect Immun58:2367-74）将血清型5 （CP5）和血清型8（CP8）多糖缀合至非毒性重组铜绿色假单胞菌（P. aeruginosa）的外蛋白A（rEPA）。该缀合物疫苗在小鼠和人类中有免疫原 性，并且其诱导调理素的抗体，后者显示出在保护啮齿动物免受致死和非 致死葡萄球菌感染的效力（Fattom，A.R.Schneerson，S.C.Szu，W.F.Vann， J.Shiloach，W.W.Karakawa和J.B.Robbins.1990.Synthesis and  immunologic properties in mice of vaccines composed of Staphylococcus  aureus type5and type8capsular polysaccharides conjugated to Pseudomonas  aeruginosa exotoxin.Infect Immun58:2367-74；Fattom，A.，R.Schneerson， D.C.Watson，W.W.Karakawa，D.Fitzgerald，I.Pastan，X.Li，J.Shiloach， D.A.Bryla和J.B.Robbins.1993.Laboratory and clinical evaluation of  conjugate vaccines composed of S.aureus type5and type8capsular  polysaccharides bound to Pseudomonas aeruginosa recombinant exoprotein A. Infect Immun61:1023-32；Fattom，A.I.，J.Sarwar，A.Ortiz和R.Naso.1996. A Staphylococcus aureus capsular polysaccharide(CP)vaccine and CP-specific  antibodies protect mice against bacterial challenge.Infect Immun64:1659-65； Lee，J.C，J.S.Park，S.E.Shepherd，V.Carey和A.Fattom.1997.Protective  efficacy of antibodies to the Staphylococcus aureus type5capsular  polysaccharide in a modified model of endocarditis in rats.Infect Immun 65:4146-51）。被动免疫研究表明，CP5-和CP8-特异性抗体使得金黄色葡 萄球菌乳腺炎的鼠科动物模型中的感染显著降低（Tuchscherr，L.P.，F.R. Buzzola，L.P.Alvarez，J.C.Lee和D.O.Sordelli.2008.Antibodies to capsular  polysaccharide and clumpingfactor A prevent mastitis and the emergence of  unencapsulated and small-colony variants of Staphylococcus aureus in mice. InfectImmun76:5738-44）。组合的CP5-和CP8-缀合物疫苗在人类中显示 安全，并产生显示出调理吞噬活性的抗体。

金黄色葡萄球菌疫苗的开发也涉及表面蛋白作为靶标。第二种金黄色 葡萄球菌临床疫苗的试验是基于对葡萄球菌粘附物的抗体对预防葡萄球菌 感染的保护有效性。金黄色葡萄球菌聚集因子A是细胞壁锚定的蛋白，其 在表面被表达，介导葡萄球菌粘附至纤维蛋白原（Foster，T.J.和M.Hook. 1998.Surface protein adhesins of Staphylococcus aureus.Trends Microbiol 6:484-8），并促进金黄色葡萄球菌附着至生物材料表面（Vaudaux，P.E.， P.Francois，R.A.Proctor，D.McDevitt，T.J.Foster，R.M.Albrecht，D.P. Lew，H.Wabers和S.L.Cooper.1995.Use of adhesion-defective mutants of  Staphylococcus aureus to define the role of specific plasma proteins in  promotingbacterial adhesion to canine arteriovenous shunts.Infection& Immunity63:585-90）、血液凝块、和损伤的内皮表面（Moreillon，P.，J.M. Entenza，P.Francioli，D.McDevitt，T.J.Foster，P.Francois和P.Vaudaux.1995. Role of Staphylococcus aureus coagulase and clumpingfactor in pathogenesis  of experimental endocarditis.Infection&Immunity63:4738-43）。C1fA的纤 维蛋白原结合结构域位于全长蛋白的区域A内（McDevitt，D.,P.Francois， P.Vaudaux和T.J.Foster.1995.Identification of the ligand-binding domain of  the surface-locatedbrinogen receptor(clumpingfactor)of Staphylococcus  aureus.Molecular Microbiology16:895-907）。C1fA在金黄色葡萄球菌结合 至血小板时起到重要作用，该结合在导管诱导的葡萄球菌心内膜炎的动物 模型中是危险性的（Sullam，P.M.，A.S.Bayer，W.M.Foss和A.L.Cheung. 1996.Diminished platelet binding in vitro by Staphylococcus aureus is  associated with reduced virulence in a rabbit model of infective endocarditis. Infection&Immunity64:4915-21）。

Nanra等人报道了针对C1fA的抗体诱导体外金黄色葡萄球菌的调理吞 噬杀死（Nanra，J.S.，Y.Timofeyeva，S.M.Buitrago，B.R.Sellman，D.A. Dilts，P.Fink，L.Nunez，M.Hagen，Y.V.Matsuka，T.Mininni，D.Zhu， V.Pavliak，B.A.Green，K.U.Jansen和A.S.Anderson.2009.Heterogeneous  in vivo expression of clumpingfactor A and capsular polysaccharide by  Staphylococcus aureus:Implications for vaccine design.Vaccine27:3276-80）。 此外，用ClfA的结合区域A的重组形式免疫的小鼠显示了金黄色葡萄球菌 诱导的关节炎和致死率的降低（Josefsson，E.，O.Hartford，L.O'Brien，J.M. Patti和T.Foster.2001.Protection against experimental Staphylococcus aureus  arthritis by vaccination with clumpingfactor A，a novel virulence determinant. Journal of Infectious Diseases184:1572-80）。在兔中进行的被动免疫实验获 得了人多克隆免疫球蛋白制剂，其包含对ClfA的特异性水平更高的抗体 （Vernachio，J.，A.S.Bayer，T.Le，Y.L.Chai，B.Prater，A.Schneider， B.Ames，P.Syribeys，J.Robbins，J.M.Patti，J.Vernachio，A.S.Bayer， T.Le，Y.-L.Chai，B.Prater，A.Schneider，B.Ames，P.Syribeys，J.Robbins 和J.M.Patti.2003.Anti-clumpingfactor A immunoglobulin reduces the  duration of methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteremia in an  experimental model ofinfective endocarditis.Antimicrobial Agents& Chemotherapy47:3400-6）。与万古霉素单独处理组相比，组合疗法使得具 有导管诱导的金黄色葡萄球菌心内膜炎的兔的血液具有更好的细菌清除。 另外，ClfA特异性抗体的被动传输使得金黄色葡萄球菌乳腺炎的鼠科模型 中的感染显著降低（Tuchscherr，L.P.，F.R.Buzzola，L.P.Alvarez，J.C.Lee 和D.O.Sordelli.2008.Antibodies to capsular polysaccharide and clumping factor A prevent mastitis and the emergence of unencapsulated and small-colony  variants ofStaphylococcus aureus in mice.InfectImmun76:5738-44）。

据报道，设计了III期临床试验以在2000例低出生体重的早产新生儿 中保护其免于患上脓血症。婴儿接受多达4次给药Veronate，Veronate是一 种从供体汇集的人免疫球蛋白制剂，具有针对ClfA和SdrG的高抗体滴度。 尽管来自相似的II期临床试验获得了有希望的结果，但该预防性疗法导致 了新生儿中葡萄球菌感染的频率并没有降低（DeJonge，M.，D.Burchfield， B.Bloom，M.Duenas，W.Walker，M.Polak，E.Jung，D.Millard，R.Schelonka， F.Eyal，A.Morris，B.Kapik，D.Roberson，K.Kesler，J.Patti和S.Hetherington. 2007.Clinical trial of safety and efficacy of INH-A21for the prevention of  nosocomial staphylococcal bloodstream infection in premature infants.J Pediatr 151:260-5）。

已经显示在原核生物中发生蛋白的糖基化，但很少如此天然地发生。 另一方面，N-连接的蛋白糖基化是在真核生物的内质网中发生的基本的和 保守的过程。其对蛋白折叠、寡聚化、稳定性、质量控制、分泌器官的选 择和转运以及膜蛋白都是很重要的（Helenius，A.和Aebi，M.(2004).Roles  of N-linked glycans in the endoplasmic reticulum.Annu.Rev.Biochem.73， 1019-1049）。蛋白糖基化对蛋白的抗原性、稳定性和半衰期都有很大的有 利影响。另外，糖基化能够辅助蛋白通过色谱来纯化，例如，利用凝集素 配体结合至与蛋白的糖基化部分相互作用的固相而进行的亲和色谱。从而 实现了在真核细胞中重组生产大量糖基化蛋白，以提供生物学和医学上有 用的糖基化模式。

缀合物疫苗已经成功用于保护免受细菌感染。抗原性多糖与蛋白载体 的缀合物是保护性记忆应答所需要的，因为多糖是T细胞非依赖性抗原。 多糖利用多糖和蛋白载体中的活性反应基团通过不同化学方法缀合至蛋白 载体。（Qian，F.，Y.Wu，O.Muratova，H.Zhou，G.Dobrescu，P.Duggan， L.Lynn，G.Song，Y.Zhang，K.Reiter，N.MacDonald，D.L.Narum，C.A. Long，L.H.Miller，A.Saul和G.E.Mullen.2007.Conjugating recombinant  proteins to Pseudomonas aeruginosa ExoProtein A:a strategy for enhancing  immunogenicity of malaria vaccine candidates.Vaccine25:3923-3933； Pawlowski，A.，G.Kallenius和S.B.Svenson.2000.Preparation of  pneumococcal capsular polysaccharide-protein conjugates vaccines utilizing  newfragmentation and conjugation technologies.Vaccine18:1873-1885； Robbins，J.B.，J.Kubler-Kielb，E.Vinogradov，C.Mocca，V.Pozsgay，J. Shiloach和R.Schneerson.2009.Synthesis，characterization，and  immunogenicity in mice of Shigella sonnei O-specific  oligosaccharide-core-protein conjugates.Proc Natl Acad Sci U S A 106:7974-7978）。

可以对儿童给药缀合物疫苗以保护他们免受细菌感染，并且能够为成 人提供长期的免疫应答。本发明的构建提已经发现在动物中产生IgG应答。 相信多糖（即，糖残基）引起糖特异性的短期免疫应答。实际上，人类免 疫系统产生对细菌的特异性多糖表面结构的强烈应答，例如O-抗原和荚膜 多糖。然而，由于对多糖的免疫应答是IgM依赖性的，因此免疫系统不会 形成记忆。然而，携带有多糖的蛋白载体引起T细胞依赖性并提供长期保 护的IgG应答，这是因为免疫系统具有记忆性。由于该原因，在疫苗的开 发过程中，将其作为蛋白载体-多糖缀合物来开发是有利的。

原核生物很少产生糖基化蛋白。然而，已经证明了一种细菌，即食物 源病原体空肠弯曲杆菌（Campylobacterjejuni）能够糖基化其蛋白 （Szymanski等人(1999).Evidence for a system of general protein  glycosylation in Campylobacter jejuni.Mol.Microbiol.32，1022-1030）。糖基 化所需要的机制是由在pgl位点成簇的12个基因编码的。糖基化的破坏影 响空肠弯曲菌（C.jejuni）的侵袭和致病性，但并不像大多真核动物中那样 是致死的（Burda P.和M.Aebi，(1999).The dolichol pathway of N-linked  glycosylation.Biochim Biophys Acta1426(2):239-57）。已经显示pgl位点是 弯曲杆菌中N-连接的蛋白糖基化的原因，并且通过在大肠杆菌中同时重组 表达pgl位点和受体糖蛋白而重建空肠弯曲菌蛋白的N-糖基化是可能的 （Wacker，M.，D.Linton，P.G.Hitchen，M.Nita-Lazar，S.M.Haslam，S. J.North，M.Panico，H.R.Morris，A.Dell，B.W.Wren和M.Aebi.2002. N-linked glyco sylation in C.jejuni and its functional transfer intoE.coli. Science298:1790-3）。

弯曲杆菌的N-连接的蛋白糖基化生物合成途径与细菌中的多糖生物合 成途径具有显著的相似性（Bugg，T.D.和P.E.Brandish.1994.From  peptidoglycan to glycoproteins:commonfeatures of lipid-linked oligosaccharide  biosynthesis.FEMS Microbiol Lett119:255-62）。基于这样的认识，即细菌 的抗原性多糖和弯曲杆菌的寡糖都在载体脂十一异戊二烯焦磷酸（UndPP） 上合成，这两个途径在大肠杆菌中被合并（Feldman，M.F.，M.Wacker， M.Hernandez，P.G.Hitchen，C.L.Marolda，M.Kowarik，H.R.Morris， A.Dell，M.A.Valvano和M.Aebi.2005.Engineering N-linked protein  glycosylation with diverse O antigen Hpopolysaccharide structures in  Escherichiacoli.Proc Natl Acad Sci U S A102:3016-21）。已经证明了PglB 不具有对脂连接的糖底物的严格特异性。在UndPP上聚集的抗原性多糖由 PglB在周质中被捕获并转移至蛋白载体（Feldman，M.F.，M.Wacker，M. Hernandez，P.G.Hitchen，C.L.Marolda，M.Kowarik，H.R.Morris，A.Dell， M.A.Valvano和M.Aebi.2005.Engineering N-linked protein glycosylation  with diverse O antigen Hpopolysaccharide structures in Escherichia coli.Proc  Natl Acad Sci U S A102:3016-21；Wacker，M.，M.F.Feldman，N.Callewaert， M.Kowarik，B.R.Clarke，N.L.Pohl，M.Hernandez，E.D.Vines，M.A. Valvano，C.Whitfield和M.Aebi.2006.Substrate specificity of bacterial  oligosaccharyltransferase(OTase)suggests a common transfer mechanism for  the bacterial and eukaryotic systems.Proc Natl Acad Sci U S A103:7088-93）。 显示了如果在还原端含有N-乙酰化己糖胺，弯曲杆菌PglB就会转移不同排 列的UndPP连接的寡糖（Wacker等人(2006)），N-乙酰化己糖胺使得抗原 性多糖能够通过N-糖苷键连接缀合至选中的蛋白。尽管这可能为缀合物疫 苗的体内生产提供了理论基础，但仍需要克服许多不同的挑战来认识这种 理论的可能性。

基于之前的发现，即空肠弯曲菌含有通常的N-连接的蛋白糖基化系统， 大肠杆菌被修饰为包括空肠弯曲菌的N-连接的蛋白糖基化机制。通过该途 径，在大肠杆菌宿主中产生了空肠弯曲菌自身蛋白的糖基化形式。进一步 显示了该过程能够被用于在修饰的大肠杆菌宿主中生产来自不同生物体的 糖基化蛋白以用于疫苗制品。通过大肠杆菌来生产是有利的，因为这样修 饰的大肠杆菌宿主可以进行大规模培养，生产大量的有用疫苗。

利用该过程在修饰的大肠杆菌宿主中生产糖基化蛋白以用做对金黄色 葡萄球菌的疫苗产品遇到了曾经认为是不能克服的问题。首先，大肠杆菌 是革兰氏阴性细菌，其糖生物合成途径在聚合步骤之后与革兰氏阳性细菌 例如金黄色葡萄球菌有很大不同。另外，像之前的技术那样通过基因加工 大肠杆菌以直接生产金黄色葡萄球菌荚膜多糖是不可行的。例如，金黄色 葡萄球菌是革兰氏阳性生物，其荚膜合成与细胞被膜结构和细胞外壳的构 造相关。产生荚膜的生物合成机制被特别设计为将荚膜多糖（PS）设置在 细胞及其细胞壁的外侧。这是非常困难的，至少是因为以下的原因，即在 修饰的大肠杆菌生物体中产生该荚膜是高度资源紧缺的，因为大肠杆菌的 细胞被膜是以根本上不同的方式构建的。从PS前体到荚膜装配的生物合成 机制将由于不同的环境而变得无能为力。金黄色葡萄球菌荚膜必须穿过 （transit）单层膜，而在大肠杆菌中存在需要穿过以到达可靠的荚膜的最终 位置所需要的另一层膜。而且，由于金黄色葡萄球菌荚膜非常大，因此相 信在大肠杆菌的两层膜之间形成如金黄色葡萄球菌荚膜那么大的荚膜是不 可行的。

之前已经显示了以下原则，即来自不同生物体的酶可以一起工作（例 如，Rubires，X.，F.Saigi，N.Pique，N.Climent，S.Merino，S.Alberti， J.M.Tomas和M.Regue.1997.A gene(wbbL)from Serratia marcescens N28b (04)complements the rfb-50mutation of Escherichia coli K-12derivatives.J. Bacteriol179(23):7581-6）。然而，相信并没有来自革兰氏阳性生物体的修 饰的LPS多糖已经在革兰氏阴性生物体内生产。

发明内容

我们现在出人意料地发现了一种新的金黄色葡萄球菌生物缀合物疫 苗。这种新的金黄色葡萄球菌疫苗基于以下新的和意外的发现，即具有一 个革兰氏株的原核生物的寡糖或多糖能够在具有不同的革兰氏株的宿主原 核生物中使蛋白糖基化。本发明的进一步的新的和意外的特点包括而不限 于如下所述的实施方式。

更通常地，本发明涉及生物缀合物疫苗例如革兰氏阳性疫苗，其包含 包含插入的核酸共有序列的蛋白载体；至少一种来自细菌例如革兰氏阳性 细菌的寡糖或多糖连接至共有序列，以及可选地包含佐剂。进一步，本发 明涉及革兰氏阳性细菌疫苗，例如金黄色葡萄球菌疫苗，或其他细菌疫苗， 其通过糖基化系统利用修饰的LPS生物合成途径来形成，包含生产修饰的 荚膜多糖或LPS。

本发明还涉及重组N-糖基化蛋白，其包含蛋白，所述蛋白包含至少一 个插入的共有序列D/E-X-N-Z-S/T，其中X和Z可以是除脯氨酸之外的任 何天然氨基酸；以及连接至所述共有序列的至少一种来自细菌例如革兰氏 阳性细菌的寡糖或多糖。

本发明进一步涉及金黄色葡萄球菌的修饰的荚膜多糖与来自相同生物 体通过N-糖苷键连接的蛋白抗原的结合。

本发明进一步涉及包含核苷酸序列的宿主原核生物，所述核苷酸序列 编码第一原核物种例如革兰氏阳性类型的一种或多种糖基转移酶；不同原 核物种例如革兰氏阴性类型的一种或多种糖基转移酶；编码蛋白的核苷酸 序列；和编码OTase的核苷酸序列。本发明另外还涉及工程化的宿主原核 生物，其包含引入的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码仅由革兰氏阳性原 核生物自身产生的糖基转移酶；编码蛋白的核苷酸序列；和编码OTase的 核苷酸序列。

本发明进一步涉及在包含核酸的宿主原核生物中生产生物缀合物疫苗 的方法，所述核酸编码来自第一种原核物种例如革兰氏阳性类型（例如金 黄色葡萄球菌）的一种或多种糖基转移酶；第二原核物种的一种或多种糖 基转移酶，一种蛋白；以及OTase。另外，本发明涉及通过在革兰氏阴性细 菌中产生修饰的荚膜多糖来生产生物缀合物疫苗，其可以通过WaaL被转 移至脂质A核心和/或通过OTase被连接至选定的载体。

本发明进一步涉及在包含核苷酸序列的宿主原核生物中生产糖基化蛋 白的方法，所述核苷酸序列编码第一原核生物自身的糖基转移酶并且也编 码与第一种原核生物不同的第二原核生物自身的糖基转移酶。本发明还涉 及用革兰氏阳性细菌的荚膜多糖N-糖基化的蛋白的生产，其通过来自不同 生物的不同糖基转移酶的组合而合成。本发明进一步涉及在宿主原核生物 中生产糖基化蛋白，所述宿主原核生物包含引入的核苷酸序列，该核苷酸 序列编仅由码革兰氏阳性原核生物自身产生的糖基转移酶。

本发明还涉及质粒，例如，包含SEQ.ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中的一个或多个的质粒。本发明也包括包含SEQ.ID NO:6；SEQ. ID NO:7；SEQ.ID NO:8和SEQ.ID NO:16中的一个或多个的质粒。本发 明还涉及包含SEQ.ID NO:10；SEQ.ID NO:11；和SEQ.ID NO:12中的一 个或多个的质粒。此外，本发明涉及包含SEQ.ID NO:13；SEQ.ID NO:15； SEQ.ID NO:15；SEQ.ID NO:17；SEQ ID NO:18；SEQ.ID NO:19；SEQ. ID NO:20；SEQ.ID NO:21和SEQ.ID NO:27中的一个或多个的质粒。

本发明另外还涉及转化的细菌细胞，例如，用质粒转化的细菌细胞， 所述质粒包含SEQ.ID NO.2；SEQ.ID NO:3；SEQ.ID NO:4；SEQ.ID NO: 17；SEQ.ID NO:18；SEQ.ID NO:19和SEQ.ID NO:20；SEQ.ID NO:21 和SEQ.ID NO:27中的一个或多个。本发明进一步涉及用质粒转化的细菌 细胞，所述质粒包含SEQ.ID NO:5；SEQ.ID NO:8；SEQ.ID NO:9；SEQ. ID NO:10；SEQ.ID NO:11；SEQ.ID NO:12；SEQ.ID NO:13；SEQ.ID NO: 14；SEQ.ID NO:15和SEQ.ID NO:16中的一个或多个。

该发明进一步涉及在哺乳动物中诱导针对由革兰氏阳性细菌和其他细 菌引起的感染的免疫应答的方法。在一种实施方式中，该方法包括向所述 哺乳动物给药有效量的药物组合物，所述药物组合物包含：包含至少一个 插入的共有序列D/E-X-N-Z-S/T的蛋白，其中X和Z可以是除脯氨酸之外 的任何天然氨基酸；和一个或多个寡糖或多糖，其中的一个或多个寡糖或 多糖彼此相同或不同，来自革兰氏阳性细菌并连接至所述共有序列。

在另一个方面，本发明披露了鉴别靶标多肽的方法，其中所述靶标多 肽用于以所述靶标多糖使蛋白整体或部分糖基化。包含靶标多糖的所述糖 基化蛋白可以用于，例如，疫苗组合物。在一种实施方式中，鉴别靶标多 糖的方法包括：鉴别革兰氏阳性细菌，例如金黄色葡萄球菌，作为靶标； 鉴别由所述革兰氏阳性细菌产生的多糖的第一重复单元，所述第一重复单 元包含至少三个单体；鉴别由革兰氏阴性类型的细菌产生的多糖，其包含 第二重复单元，所述第二重复单元包含两个与所述第一重复单元相同的单 体。

本发明还涉及修饰第一细菌物种例如革兰氏阴性类型的细菌的方法。 在一种实施方式中，该方法包括：鉴别革兰氏阳性类型例如金黄色葡萄球 菌的多糖的第一重复单元，所述第一重复单元包含三个单体；鉴别第二革 兰氏阴性类型的细菌产生的多糖，其包含另外的重复单元，所述重复单元 包含两个与第一重复单元相同的单体；向第一个革兰氏阴性类型的所述细 菌插入一个或多个编码装配三糖的糖基转移酶的核苷酸序列，所述三糖包 含：a）所述第二重复单元；和b）不包含在所述第二重复单元中的所述第 一重复单元的单体；插入编码蛋白的核苷酸序列；以及插入编码OTase的 核苷酸序列。

附图说明

图1描绘了wzx/wzy依赖性O-抗原生物合成的途径，以铜绿色假单胞 菌O11O-抗原生物合成为例。展示的反应的蛋白名称在箭头上方或下方显 示，包括尿苷二磷酸（UDP）和尿苷单磷酸（UMP）。

图2描绘了在大肠杆菌中的工程化金黄色葡萄球菌荚膜多糖血清型5 （CP5）的生物合成的建议途径。铜绿色假单胞菌O11的O-抗原簇提供的 酶在图1中示出。来自金黄色葡萄球菌CP5的酶显示为Cap5（对照图6）。 WecB和WecC是生产UDP-ManNAcA所需的大肠杆菌酶。其他描述的蛋 白和酶包括尿苷二磷酸（UDP）、尿苷单磷酸（UMP）、和辅酶A（CoA）。

图3描绘了工程化的金黄色葡萄球菌荚膜多糖血清型8（CP8）生物合 成的议议途径。基因名称以箭头指示（对照图1、图2和图6）。UDP，UMP： 尿苷二磷酸，尿苷单磷酸。CoA：辅酶A。

图4描绘了荚膜金黄色葡萄球菌和铜绿色假单胞菌O-抗原重复单元 （RU）结构的结构重叠。

图5A描绘了通过金黄色葡萄球菌酶来延长不完整O11O-抗原RU（重 复单元）的SDS-PAGE分析。

图5B描绘了通过金黄色葡萄球菌酶来延长不完整O11O-抗原RU的免 疫检测。

图6描绘了本发明的一种实施方式中构建嵌合OH/CP5和OH/CP8基 因簇的策略。

图7A描绘了本发明的一种实施方式中在大肠杆菌脂质提取物中检测 的多聚CP5LPS。

图7B描绘了本发明的一种实施方式中在大肠杆菌脂质提取物中检测 的多聚CP8LPS。

图8A描绘了本发明的一种实施方式中重组CP5LPS的生产，通过 SDS-PAGE以银染色并根据含有W3110ΔwecA细胞内的嵌合簇的pLAFR 质粒上的抗生素抗性基因来进行分析。

图8B描述了本发明的一种实施方式中重组CP5LPS的生产，通过 SDS-PAGE以银染色以及免疫检测并根据含有W3110ΔwecA细胞内的嵌合 簇的pLAFR质粒上的抗生素抗性基因来进行分析。

图9描述了本发明的一种实施方式中重组CP5LPS的生产，通过免疫 检测并根据W3110ΔwecA细胞内的嵌合簇之前的启动子来进行分析。

图10A示出了利用嵌合CP5簇（SEQ ID:2）产生的本发明的CP5的 重组RU的一种实施方式的HPLC分析结果。

图10B示出了利用缺少cap8I聚合酶的嵌合CP8簇产生的本发明的CP8 的重组RU的一种实施方式的HPLC分析结果。

图11A示出了通过在大肠杆菌中表达本发明的嵌合CP5簇的一种实施 方式而产生的在图10A中在第37分钟时洗脱的特定峰的MALDI-MS/MS 分析结果。

图11B显示了通过在大肠杆菌中表达本发明的嵌合CP5簇的一种实施 方式而产生的在图10A中在第40分钟时洗脱的特定峰的MALDI-MS/MS 分析结果。

图11C示出了通过在大肠杆菌中表达本发明的嵌合CP8簇的一种实施 方式而产生的在图10B中在第32分钟时洗脱的特定峰的MALDI-MS/MS 分析结果。

图11D示出了通过在大肠杆菌中表达本发明的嵌合CP8簇的一种实施 方式而产生的在图10B中在第38分钟时洗脱的特定峰的MALDI-MS/MS 分析结果。

图11E示出了通过在大肠杆菌中表达本发明的嵌合CP8簇的一种实施 方式而产生的在图10B中在第45分钟时洗脱的特定峰的MALDI-MS/MS 分析结果。

图11F示出了聚糖结构优化的一种实施方式的HPLC分析结果。

图11G（包括图11G-1）示出了在本发明的一种实施方式中在大肠杆 菌细胞中的UndPP中的全部CP5聚糖部分的HPLC分析结果。

图11H示出了本发明的一种实施方式中脱乙酰CP5聚糖和RU同源性 的HPLC分析结果。

图11I提供了本发明的一种实施方式中在大肠杆菌细胞中UndPP上存 在的CP8聚糖部分的HPLC分析结果。

图11J示出了本发明的一种实施方式中脱乙酰CP8聚糖和RU同源性 的HPLC结果。

图11K示出了HPLC结果，其显示本发明的一种实施方式中由wzzO7 与CP8嵌合簇共表达诱导的RU多聚化的减少和LLO的增加。

图12示出了本发明的一种实施方式中来自不具有和具有金黄色葡萄球 菌翻转酶基因cap5K（SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3）的细胞，经Ni²⁺亲 和色谱纯化的EPA-CP5生物缀合物的SDS-PAGE分析结果。

图13A示出了根据本发明的一种实施方式的经Ni²⁺亲和色谱和离子交 换色谱纯化的CP5-EPA生物缀合物的分析。

图13B描绘了根据本发明的一种实施方式，N-糖苷键连接至O-乙酰化 RU质量（m/z=2088([M+H]⁺)）的胰蛋白酶化肽DNNNSTPTVISHR中发现 的糖基化位点的M/Z质量。插入物示出了连接于肽的RU结构。

图13C描绘了根据本发明的一种实施方式，N-糖苷键连接至O-乙酰化 RU质量（m/z=1165([M+H]⁺)）的胰蛋白酶化肽DQNR中发现的糖基化位 点的M/Z质量。插入物示出了连接于肽的RU结构。

图13D描绘了根据本发明的一种实施方式，Ni²⁺亲和色谱和阴离子交 换色谱纯化的CP8-EPA生物缀合物的分析。

图13E描绘了根据本发明的一种实施方式中来自含有用于糖缀合物生 产的3个（左侧泳道）或2个质粒（右侧泳道）的细胞的纯化的CP5-EPA 生物缀合物。

图13F描绘了根据本发明的一种实施方式的Ni²⁺亲和色谱纯化的 CP8-EPA生物缀合物的分析。

图14A示出了利用图13A的3质粒系统产生的本发明一种实施方式中 的纯化CP5-EPA生物缀合物的高质量MALDI分析。

图14B示出了利用图13A的3质粒系统产生的本发明本发明的一种实 施方式中的CP5-EPA生物缀合物的大小排阻色谱表征。

图14C示出了根据本发明一种实施方式的纯化CP5-Hla生物缀合物的 SDS-PAGE分析和免疫检测。

图14D示出了根据本发明的一种实施方式的纯化的CP5-AcrA生物缀 合物的结果。

图14E示出了根据本发明的一种实施方式的纯化的CP5-ClfA生物缀合 物的结果。

图15A示出了根据本发明的一种实施方式在小鼠中由CP5-EPA引起的 特异性抗CP5抗体。

图15B示出了根据本发明的一种实施方式在兔中由CP5-EPA引起的特 异性抗CP5抗体。

图16A示意性示出了根据本发明的一种实施方式，由CP5-EPA免疫兔 引起的CP5特异性抗体的体外调理吞噬活性（针对金黄色葡萄球菌 Reynolds）。

图16B示意示出了根据本发明的一种实施方式，由CP5-EPA免疫兔引 起的CP5特异性抗体的体外调理吞噬活性（针对金黄色葡萄球菌USA100）。

图17A描绘了根据本发明的一种实施方式利用抗CP5-EPA抗体被动免 疫的结果，在小鼠中用约3.6×10⁷CFU的金黄色葡萄球菌菌株Reynolds进 行i.p.激发。

图17B描绘了根据本发明的一种实施方式利用抗CP5-EPA抗体被动免 疫的结果，在小鼠中注射2mg CP5-EPA IgG。

图17C描绘了根据本发明的一种实施方式利用抗CP5-EPA抗体被动免 疫的结果，在小鼠中注射300μgCP5-EPA IgG。

图18描绘了根据本发明的一种实施方式，利用不同剂量的CP5-EPA 作为疫苗并且利用小鼠菌血症模型进行激发的活性免疫分析结果。

具体实施方式

根据本发明的一种实施方式，来自革兰氏阳性生物的LPS多糖现在显 示在革兰氏阴性生物中表达。我们相信这是一个新的成果，与现有技术相 比，其表现出重要的和显著的差别。

本发明的范围之内的核酸由包含在序列表中的本发明的核酸来示例示 出。能够在宿主细胞中表达的编码免疫原性组分的任何核酸或其部分均可 以用于本发明。提供下面的序列描述是为了有助于理解在本申请全文中使 用的某些术语，为不应被解释为本发明的限制性实施方式。

SEQ ID NO:1描述了pLAFRl（Gene Bank Accession AY532632.1）， 其包含来自铜绿色假单胞菌PAO103的在EcoRI位点的O11O-抗原序列， 互补链（部分来自于Gen Bank Accession AF236052）。

SEQ ID NO:2描述了包含CP5嵌合簇的pLAFR1，其对应于 pLAFRl-O11，其中cap5HIJ基因通过同源重组替代wbjA-wzy。插入序列还 包含用于选择同源重组克隆的cat表达盒。

SEQ ID NO:3描述了包含具有cap5K翻转酶基因的CP5嵌合簇的 pLAFR1，其对应于pLAFR1-O11，其中cap5HIJ基因通过同源重组替代 wbjA-wzy，并且cap5K克隆在cap5J和cat表达盒之间。

SEQ ID NO:4描述了包含包括翻转酶的CP8嵌合簇的pLAFR1，其对 应于pLAFR1-Ol1，其中cap8KHIJ基因替代wbjA-wzy。插入序列还包含用 于选择同源重组克隆的cat表达盒。

SEQ ID NO:5描述了用于Hla H35L生产的表达质粒。编码Hla H35L 的ORF克隆被到pEC415中的NdeI/SacI中。

SEQ ID NO.6描述了用于Hla-H35L位点202生产的表达质粒。ORF 编码来自大肠杆菌的N-端DsbA信号肽、氨基酸位点202附近的糖基化位 点和C-端HIS标签。该构建体被克隆到pEC415上的NheI/Sa1I中。

SEQ ID NO:7描述了用于Hla-H35L位点238生产的表达质粒。ORF 编码来自大肠杆菌的N-端DsbA信号肽、氨基酸位点238附近的糖基化位 点和C-端HIS标签。上述构建体被克隆到pEC415上的NheI/SalI中。

SEQ ID NO:8描述了用于Hla-H35L位点272生产的表达质粒。ORF 编码来自大肠杆菌的N-端DsbA信号肽、氨基酸位点272附近的糖基化位 点和C-端HIS标签。上述构建体被克隆到pEC415上的NheI/SalI中。

SEQ ID NO:9描述了用于ClfA生产的表达质粒。该基因是化学合成的 并且被克隆到pEC415表达载体的NdeI/SacI中。

SEQ ID NO:10描述了用于ClfA位点290生产的表达质粒。ORF编码 来自大肠杆菌的N-端DsbA信号肽、氨基酸位点290附近的糖基化位点和 C-端HIS标签。上述构建体被克隆到pEC415上的NheI/SslI中。

SEQ ID NO:11描述了用于ClfA位点327生产的表达质粒。ORF编码 来自大肠杆菌的N-端DsbA信号肽、氨基酸位点327附近的糖基化位点和 C-端HIS标签。上述构建体被克隆到pEC415上的NheI/SalI中。

SEQ ID NO:12描述了用于ClfA位点532生产的表达质粒。ORF编码 来自大肠杆菌的N-端DsbA信号肽、氨基酸位点532附近的糖基化位点和 C-端HIS标签。上述构建体被克隆到pEC415上的NheI/SalI中。

SEQ ID NO:13描述了重组的、遗传减毒的EPA的氨基酸序列，其具 有信号序列并且在位置260和402处具有两个糖基化位点。

SEQ ID NO:14描述了重组的、遗传减毒的EPA的氨基酸序列，其没 有信号序列并且在位置241和383处具有两个糖基化位点。

SEQ ID NO:15描述了编码AcrA的ORF，其经由NheI/SalI克隆到 pEC415中。

SEQ ID NO:16描述了用于Hla-H35L位点130生产的表达质粒。ORF 编码来自大肠杆菌的N-端DsbA信号肽、氨基酸位点130附近的糖基化位 点和C-端HIS标签。上述构建体被克隆到pEC415上的NheI/SalI中。

SEQ ID NO:17描述了生产具有cap5K翻转酶的基因簇的CP5，随后是 由大肠杆菌血清型O121的galF和wbqA之间的基因间DNA序列和pglB ORF组成的pglB表达盒。该插入物被克隆到pLAFR1的EcoRI位点中。

SEQ ID NO:18描述了生产具有cap8K翻转酶的基因簇的CP8，随后是 由大肠杆菌血清型（serotype）O121的galF和wbqA之间的基因间DNA序 列和pglBORF组成的pglB表达盒。该插入物被克隆到pLAFR1的EcoRI 位点中。

SEQ ID NO:19描述了生产具有cap8K翻转酶的基因簇的CP8，随后是 由大肠杆菌血清型O121的galF和wbqA之间的基因间DNA序列和pglB ORF组成的pglB表达盒，另外该序列还具有大肠杆菌血清型（serovar）O7 的wzz克隆到SfaAI/BspTI中，即，在铜绿色假单胞菌O11的wzx和cap8H 之间。该插入物被克隆到pLAFR1的EcoRI位点中。

SEQ ID NO:20描述了EPA和wzz的表达质粒。骨架是pACT3，其中 的抗性盒被替换（将卡那霉素替换成氯霉素）。

SEQ ID NO21描述了被克隆到pext21Eco/Sal中的大肠杆菌血清型O7 的wzz。

SEQ ID NO22描述了实施例中提及的肽序列。

SEQ ID NO23描述了实施例中提及的肽序列。

SEQ ID NO24描述了蛋白共有序列，D/E-X-N-Z-S/T，其中X和Z可 以是除了脯氨酸之外的任何天然氨基酸。

SEQ ID NO:25描述了糖基化位点。

SEQ ID NO:26描述了糖基化位点。

SEQ ID NO:27描述了含有克隆到EcoRI/BamHI位点中的pglB ORF的 表达质粒。

下面列出了说明书中所用的术语和缩写的描述，并与本领域普通技术 人员已知的使用方法一致。提供这些描述是为了有利于理解这样的术语和 缩写，并而不应将其解释为本发明的限制性实施方式。

AcrA是指一种来自空肠弯曲菌的糖蛋白。

自动免疫是指暴露于抗原之后诱导的免疫性（抗体）。

APC是指抗原呈递细胞。

Amp是指氨苄青霉素。

菌血症是指循环血中存在活细菌。

C’是指补体。

CapA是在金黄色葡萄球菌CP5中被认为链长度确定的酶。

CapB是在金黄色葡萄球菌CP5中被认为是多糖链长度的调节子的酶。

CapC是在金黄色葡萄球菌CP5中被认为编码转运蛋白的酶。

CapD是在金黄色葡萄球菌CP5中具有4,6-脱氢酶活性并将前体 UDPGlcNAc转化为UDP-2-乙酰氨基-2,6-二脱氧-D-木糖-4-己酮糖的酶。

CapE是4,6-脱氢酶3,5-差向异构酶，其在金黄色葡萄球菌CP5中催化 UDP-D-GlcNAc差向异构化为UDP-2-乙酰氨基-2,6-二脱氧-D-来苏糖-4-己 酮糖。

CapF是还原酶，其在金黄色葡萄球菌CP5中将还原形式的UDP-2-乙 酰氨基-2,6-二脱氧-D-来苏糖-4-己酮糖催化为UDP-L-6dTalNac。

CapG是2-异构酶，其在金黄色葡萄球菌CP5中将异构形式的 UDP-L-6dTalNAc催化为UDP-LFucNac。

CapH在金黄色葡萄球菌CP5中是O-乙酰转移酶。

CapH在CP8中是转移酶，类似于来自金黄色葡萄球菌CP5的CapI。

CapI在金黄色葡萄球菌CP5中是糖基转移酶，其催化UDP-ManNAcA 转移至载体脂质-D-FucNAc-L-FucNAc，从而产生载体脂质 -D-FucNAc-L-FucNAc-ManNAcA。

CapI在CP8中是聚合酶，类似于金黄色葡萄球菌CP5中的CapJ。

CapJ在金黄色葡萄球菌CP5中是聚合酶。

CapJ在CP8中是O-乙酰转移酶，类似于在金黄色葡萄球菌CP5中的 CapH。

CapK在金黄色葡萄球菌CP5中是翻转酶。

CapK在金黄色葡萄球菌CP8中是翻转酶，类似于CP5中的CapK。

CapL是转移酶，其在金黄色葡萄球菌CP5中催化UDP-L-FucNAc转移 至D-FucNAc-载体脂质上，以产生载体脂质-D-FucNAc-L-FucNAc。

CapM是转移酶，其在金黄色葡萄球菌CP5中催化UDP-D-FucNAc转 移至载体脂质上，以产生载体脂质-D-FucNAc。

CapN是4-还原酶，其在金黄色葡萄球菌CP5中催化UDP-2-乙酰氨基 -2,6-二脱氧-D-木糖-4-己酮糖还原为UDP-D-FucNAc。

CapO是脱氢酶，其在金黄色葡萄球菌CP5中催化UDP-D-ManNAc转 化为UDP-ManNAcA。

CapP是2-差向异构酶，其在金黄色葡萄球菌CP5中催化 UDP-D-GlcNAc差向异构化为UDP-D-ManNAc。

CFU是指克隆形成单位。

ClfA是指金黄色葡萄球菌聚集因子A（clumpingfactor A），其是一种 细胞壁锚定蛋白。

缀合物疫苗是指通过将多糖抗原共价连接至载体蛋白而产生的疫苗。 缀合物疫苗引起抗细菌免疫应答和免疫记忆。如果这些抗原与诱导T细胞 依赖性应答的蛋白缀合，则其能够在婴儿和老年人中诱导针对多糖抗原的 保护性免疫应答。

共有序列是指氨基酸序列-D/E-X-N-Z-S/T-，其中X和Z可以是除脯氨 酸之外的任何天然氨基酸，其中发现连接至N-连接的糖蛋白的糖连接位点。

荚膜多糖，具有其天然存在的形式，是指多糖的厚的、黏液样的层， 其是水溶性的，并通常是酸性的。天然存在的荚膜多糖由一个至若干个单 糖/单体的规则重复单元组成。

CP5是指金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖或血清型5荚膜多糖。

CP8是指金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖或血清型8荚膜多糖。

D-FucNAc是指N-乙酰D-岩藻糖。

ECA是指肠道菌共同抗原。

ELISA是指酶联免疫吸附分析，其是一种在免疫学中主要用于检测样 品中抗体或抗原存在的生物化学技术。

EPA或EPAr是指非毒性重组铜绿色假单胞菌外蛋白A。

糖缀合物疫苗是指包含连接至抗原性或免疫原性寡糖的蛋白载体的疫 苗。

糖基转移酶是指这样的酶，其作为单糖单元从活化的核苷糖转移至糖 基受体分子的催化剂。

革兰氏阳性菌株是指用革兰氏染色（一种有用的诊断工具）呈紫色的 细菌菌株。革兰氏阳性细菌具有由肽聚糖组成（大约50-90%的细胞壁）的 较厚网状细胞壁。

革兰氏阴性菌株是指具有较薄层（约10%的细胞壁）并且被染色呈粉 色的细菌菌株。革兰氏阴性细菌还具有另外的外膜，其包含脂质，并被周 质空间（periplasmic space）与细胞壁分开。

Hla（α毒素）是指α溶血素，它是一种分泌的孔形成毒素，并且是金 黄色葡萄球菌的必要毒力因子抗原。

Hla H35L是指来自金黄色葡萄球菌的Hla非毒性α-毒素突变体。

组氨酸标签，或者多组氨酸标签，是蛋白中由至少5个组氨酸（His） 残基组成的氨基酸基序，通常位于蛋白的N-端或C-端，并用于通过特异性 结合至镍亲和柱而以简单快速的方式来纯化。

IV指静脉内。

kDa指千道尔顿，是原子质量单位。

L-FucNAc是指N-乙酰L-岩藻糖胺。

LPS是指脂多糖。脂多糖（LPS）也被称为脂聚糖，是由脂质和多糖通 过共价键结合而成的大分子；其通常位于革兰氏阴性细菌的外膜中，作为 外毒素并在动物中引起强烈的免疫应答。

ManNAcA是指N-乙酰甘露糖胺醛酸。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株（MRSA）是指与长期住院和在加护病 房中更多感染相关的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌菌株，其导致更多的抗 生素给药。

N-聚糖或N-连接的寡糖是指各种组成的单糖、寡糖或多糖，其通过N- 糖苷键连接至蛋白中的天冬氨酸残基的ε-酰胺氮。

N-连接的蛋白糖基化是指共价连接“聚糖”（单糖、寡糖或多糖）至靶标 蛋白的天冬酰胺（N）侧链的氮的过程或途径。

O-抗原或O-多糖是指LPS内包含的重复性聚糖多聚体。O抗原结合至 核心寡糖，并包含LPS分子的最外侧结构域。

寡糖或多糖是指通过共价结合碳水化合物（单糖）而形成的均聚物或 杂聚物，并包括但不限于通过糖苷键连接在一起的重复单元（单糖、二糖、 三糖，等等）。

调理吞噬活性是指在补体和特异性抗体存在下病原体的细胞吞噬。血 清抗体的体外调理吞噬活性（POA）被认为代表了抗体在体内的功能活性 并从而与保护性免疫相关。

OTase或OST是指寡糖基转移酶，其催化寡糖或多糖以独特机制并选 择性转移（糖基化）至新生的或折叠的蛋白的共有序列的天冬酰胺（N）残 基。

被动免疫是指以已经产生的抗体的形式从一个个体转移至另一个的转 移的活性体液免疫。

周质空间是指革兰氏阴性细菌的内部胞质膜和外部的外膜之间的空 间。

PMN是指多形核嗜中性白细胞，它是人类和多种（虽然不是全部）哺 乳动物的外周血中最丰富的白细胞。

蛋白载体是指包含共有序列的蛋白，其中寡糖或多糖结合至所述共有 序列。

RU是指包含特定多糖的重复单元，其中的特定多糖通过将个体单糖装 配到寡糖或多糖中而合成。

信号序列是指在蛋白的N-末端的短（例如，长度为约3-60个氨基酸） 肽，其引导蛋白至不同的定位。

UDP-D-ManNAc是UDP-N-乙酰-D-甘露糖胺。

UDP-D-ManNAcA是UDP-N-乙酰-D-甘露糖胺醛酸。

UDP-D-QuiNAc是UDP-N-乙酰-D-鸡纳糖胺。

UDP-L-FucNAc是UDP-N-乙酰-L-岩藻糖胺。

UDP-L-6dTalNAc是UDPN-乙酰-L-塔洛糖 （UDPN-acetyl-L-pneumo samine）。

Und是指由11个异戊烯醇单元组成的十一戊烯基或十一异戊烯醇脂。

UndP是指十一异戊烯基磷酸酯（undecaprenyl phosphate），它是一种 输出至细菌细胞被膜的碳水化合物聚合物的聚糖生物合成中间体的通用脂 载体（衍生自Und）。

UndPP是指十一异戊烯基焦磷酸酯，它是UndP的磷酸化形式。

wbjA是铜绿色假单胞菌O11中的糖基转移酶。

wbjB是一种推定的翻转酶，类似于金黄色葡萄球菌中CP5和CP8的荚 膜生物合成所需的酶。

wbjC是一种铜绿色假单胞菌O11中的推定的差向异构酶。

wbjD是一种铜绿色假单胞菌O11中的推定的差向异构酶。

wbjE是一种铜绿色假单胞菌O11中的推定的差向异构酶。

wbjF是一种铜绿色假单胞菌O11中的推定的糖基转移酶。

wbpL是一种糖基转移酶，其参与铜绿色假单胞菌O11中的LPS生物 合成。

wbpM是一种糖基转移酶，其参与铜绿色假单胞菌O11中的LPS生物 合成。

本发明的实施方式至少部分地是基于这样的发现，即空肠弯曲菌含有 通常的N-连接的蛋白糖基化系统，这是原核生物的不寻常的特征。空肠弯 曲菌的多种蛋白显示被七糖所修饰。该七糖在内膜的细胞质一侧在特定的 糖基转移酶催化下通过逐步添加核苷活化的单糖在载体脂UndPP上组装。 然后，脂连接的寡糖通过翻转酶例如PglK翻转进入（即，横向扩散）间质 空间。在N-连接的蛋白糖基化的最终步骤，OTase（例如，PglB）催化寡糖 从载体脂转移至共有序列Asp/Glu-Xaa-Asn-Zaa-Ser/Thr（即， D/E-X-N-Z-S/T）内的Asn残基，其中Xaa和Zaa可以是除了Pro之外的任 何氨基酸。我们已经成功地将七糖的糖基化簇转移至大肠杆菌中，并且能 够产生弯曲杆菌属（Campylobacter）的N-连接的糖蛋白。

已经开发出一种新颖的和创造性的方法以修饰革兰氏阴性宿主细菌， 例如大肠杆菌，以生产用作针对革兰氏阳性细菌例如金黄色葡萄球菌的疫 苗产品的糖基化蛋白。这种方法的发展需要克服重大的并且在很多方面难 以预料的困难，并且实质上区别于传统知识和现有技术。

在这种新颖的和创造性的方法中，鉴别了另一种产生多糖的革兰氏阴 性细菌，所述多糖与感兴趣的靶标生物例如金黄色葡萄球菌的多糖具有结 构相似性。为了本发明的目的，结构相似性表明其自身作为靶标（例如， 金黄色葡萄球菌）的多糖中的重复单元，与所鉴别的其他革兰氏阴性细菌 中的多糖的重复单元部分地相同。由于后一种细菌是革兰氏阴性的，其本 身就是宿主，例如大肠杆菌，因此我们最初假定（并且之后通过下文所述 的实验验证）在修饰的大肠杆菌中利用其生物合成途径将能够实现生物合 成构建的RU抗原并且其从细胞质翻转进入修饰的大肠杆菌的周质内。进一 步地，我们假定（并且之后通过下文所述的实验证实）通过该生物合成途 径产生的多糖的大小将比通过革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的生物合成途径 产生的多糖小得多。

结果，如下文所讨论，我们所开发的新颖的和创造性的方法解决了前 述的难题。

进一步地，如下文所述，我们出人意料地发现革兰氏阴性生物中的LPS 通路的方面能够用于生产多糖，所述多糖含有一些与革兰氏阳性细菌例如 金黄色葡萄球菌自身的荚膜多糖相同的重复单元。

因此，在制造金黄色葡萄球菌的糖基化蛋白疫苗的多糖部分的时候， 一种出人意料的解决办法是构建至少部分地基于与革兰氏阴性细菌（例如 大肠杆菌）自身产生的多糖来构建多糖部分。我们进一步发现，为了这样 做，寻找产生与金黄色葡萄球菌产生的感兴趣的多糖尽可能相似的多糖的 细菌显然是非常重要的。铜绿色假单胞菌是这样的细菌。

图1提供了通过在O-抗原簇中提供的酶或者通过革兰氏阴性宿主细胞 的管家酶（house keeping enzyme）在细胞质中制备核苷活化的单糖的实施 方式的逐步描述，对于本领域技术人员而言，根据本说明书的记载，这是 显然的。该过程的步骤在图1的描述中从左至右进行。在图1描述的实施 方式中，糖基磷酸转移酶（WbpL）将D-FucNac磷酸添加至UndP，形成 UndPP-FucNAc。然后特异性糖基转移酶进一步通过添加形成重复单元 （RU）寡糖的单糖（WbjE，WbjA）来延长UndPP-FucNAc分子。然后RU 通过Wzx蛋白翻转进入周质空间中。Wzy酶聚合周质RU以形成O-抗原多 糖。聚合物长度由Wzz蛋白控制。很多细菌寡糖和多糖在UndPP上装配， 然后被转移至其他分子。也就是说，UndPP是细菌中常规的糖建设平台。 在大肠杆菌和据信大多数其他革兰氏阴性细菌中，O-抗原通过大肠杆菌酶 WaaL从UndPP转移至脂质A核心以形成脂多糖（LPS）。

图2描绘了通过在铜绿色假单胞菌O11的O-抗原簇中提供的酶、通过 革兰氏阴性宿主细胞的管家酶、以及通过已知UDP-ManNAcA生物合成所 需的金黄色葡萄球菌和/或大肠杆菌酶（Cap50P和/或WecBC）在细胞质中 制备核苷活化的单糖的实施方式，对本领域技术人员而言，根据本说明书 的记载，这是显然的。该过程的步骤在图2的描述中从左至右进行。在O11 生物合成中，WbpL和WbjE合成核心二糖。然后，金黄色葡萄球菌糖基转 移酶Cap5I添加D-ManNAcA。Cap5H将乙酰基团添加至第二FucNAc残基。 如图2所示，乙酰化可以是RU合成的最终步骤。在该系统中，翻转可以通 过Wzx蛋白的一种或全部进行，这是重组表达的铜绿色假单胞菌的Wzx 或Cap5K，或内源性表达的Wzx样酶，例如在大肠杆菌染色体中编码的ECA 簇。聚合是在UndPP上形成CP5多糖的Cap5J聚合酶的专有活性。像其他 结合UndPP的多糖一样，CP5糖被大肠杆菌酶WaaL转移至脂质A核心以 形成重组LPS（LPS荚膜）。

图3描绘了通过通过在铜绿色假单胞菌O11的O-抗原簇中提供的酶、 通过革兰氏阴性宿主细胞的管家酶、以及通过已知UDP-ManNAcA生物合 成所需的金黄色葡萄球菌和/或大肠杆菌酶（Cap80P和/或WecBC）在细胞 质中制备核苷活化的单糖，对于本领域技术人员而言，根据本说明书的记 载，这是显然的。该过程的步骤在图3的描述中从左至右进行。在O11生 物合成中，WbpL和WbjE合成核心二糖。然后，金黄色葡萄球菌糖基转移 酶Cap8H添加D-ManNAcA。Cap8J将乙酰基团添加至第二FucNAc残基。 尚不知道乙酰化发生在活化的糖上还是脂质结合的RU上。在该系统中，翻 转可以通过Wzx蛋白的一种或全部进行，其是重组表达的铜绿色假单胞菌 的Wzx或Cap8K，或内源性表达的Wzx样酶，例如在大肠杆菌染色体中编 码的ECA簇。聚合是在UndPP上形成CP8多糖的Cap8I聚合酶的专有活 性。然后，CP8糖在大肠杆菌中被酶WaaL转移至脂质A核心。

图4示出了O11、CP5和CP8多糖的不同结构。图4中示出了RU共 享相同的主干结构，该主干结构由UndPP和二糖 α-D-FucNAc-(l,3)-L-FucNAc组成。金黄色葡萄球菌RU部分地在中间的 L-FucNAc或ManNAcA残基上以单独的O-乙酰基团修饰，这是金黄色葡萄 球菌RU的特征。金黄色葡萄球菌RU中的第二个和第三个糖的连接，以及 聚合的RU之间的连接彼此之间是不同的。在右边，糖结构以不同的表现方 式示出。黑色箭头表示的数字（CP5和CP8）代表用O-乙酰基团修饰的碳 的位置。RU结构的一种可替代表现方式示于左下方。如图4中所示，作为 铜绿色假单胞菌自身产生的多糖的部分的O11抗原中的RU和葡萄球菌属 各菌株的CP5和CP8荚膜的RU之间有很大的重复。尤其是，如图4所示， RU中的L-FucNAc>D-FucAc部分在两者中是相同的。

在另一个方面，本发明描述了鉴别靶标多糖的方法，其用于用所述靶 标多糖的全部或部分来糖基化蛋白。包含靶标多糖的所述糖基化蛋白可以 用于，例如，疫苗组合物。鉴别靶标多糖的方法包括：鉴别革兰氏阳性细 菌，例如金黄色葡萄球菌，作为靶标；鉴别由所述革兰氏阳性细菌产生的 多糖的第一重复单元，其包含至少三个单体；鉴别包含第二重复单元的革 兰氏阴性类型的细菌生产的多糖，所述第二重复单元包含至少两个与所述 第一重复单元的单体相同的单体。

因此，在本发明的一种实施方式中，修饰第一革兰氏阴性类型的细菌 的方法包括：鉴别革兰氏阳性细菌，例如金黄色葡萄球菌，作为靶标；鉴 别由所述革兰氏阳性细菌产生的多糖的第一重复单元，其包含至少三个单 体；鉴别由包含第二重复单元的第二革兰氏阴性类型的细菌产生的多糖， 所述第二重复单元包含至少两个与所述第一重复单元的单体相同的单体； 向所述第一革兰氏阴性类型的细菌插入一个或多个编码装配三糖的糖基转 移酶的核苷酸序列，所述三糖包含：a）所述第二重复单元；和B）在所述 第二重复单元中不存在的所述第一重复单元的单体；插入编码蛋白的核苷 酸序列，所述蛋白例如包含至少一个插入的共有序列D/E-X-N-Z-S/T，其中 X和Z可以是除脯氨酸之外的任何天然氨基酸；以及插入编码OTase的核 苷酸序列。

在本发明的一种实施方式中，该方法进一步包含向宿主革兰氏阴性细 菌中插入一个或多个编码装配三糖的糖基转移酶的核苷酸序列，所述三糖 包含在第二重复单元中不存在的第一重复单元并且装配第二重复单元的单 体。本发明的一个另外的实施方式涉及插入一个或多个来自革兰氏阴性细 菌的糖基转移酶，其装配至少一个来自第一重复单元的单体单元，和一个 或多个来自革兰氏阳性细菌（例如金黄色葡萄球菌）的糖基化转移酶，其 装配至少两个来自第二重复单元的单体。该方法还包含向革兰氏阴性宿主 细菌中插入编码蛋白的核苷酸序列和编码OTase的核苷酸序列。

在本发明的至少一种实施方式中，宿主大肠杆菌菌株产生为携带编码 金黄色葡萄球菌的CP5和CP8菌株的需要的酶的相应核酸，其将建立、翻 转并聚合所构建的重复单元。在一种实施方式中，所需的特异性糖基转移 酶符合形成铜绿色假单胞菌自身产生的L-FucNAc—>D-FucNAc RU的那 些，并且对应于添加D-ManNAcA单糖以完成金黄色葡萄球菌的CP5和CP8 菌株分别自身产生的RU的糖基转移酶。这样的实施方式可进一步包括利用 质粒以将核酸注入到宿主细胞中。一种另外的实施方式涉及在一个质粒中 利用编码对应于L-FucNAc—>D-FucNAc的糖基转移酶的核酸，以及在不同 的质粒中利用编码对应于D-ManNAcA的糖基转移酶的核酸。这样的实施 方式的一个好处是，以现有技术的观点出人意料的是，经修饰的铜绿色假 单胞菌的LPS生物合成途径，现在为产生构建的金黄色葡萄球菌荚膜的RU 聚合体的原因，使得其结构比金黄色葡萄球菌的荚膜小得多。

本发明另外涉及重组N-糖基化蛋白，包含至少一个插入的共有序列 D/E-X-N-Z-S/T，其中X和Z可以是除脯氨酸之外的任何天然氨基酸；并且 来自革兰氏阳性细菌的至少一个寡糖或多糖连接至所述共有序列。在其他 实施方式中，重组N-糖基化蛋白包含两个或多个所述插入的共有序列。在 另外一种实施方式中，重组N-糖基化蛋白包含两个或多个所述金黄色葡萄 球菌寡糖或多糖。在又一种的实施方式中，重组N-糖基化蛋白包含两个或 多个所述插入的共有序列和来自不同的金黄色葡萄球菌菌株的寡糖或多 糖，例如，来自金黄色葡萄球菌荚膜多糖5菌株和荚膜多糖8菌株。

本发明进一步涉及金黄色葡萄球菌的修饰的荚膜多糖与来自相同生物 的蛋白抗原通过N-糖苷键连接的组合物。

本发明的实施方式包括天然糖基化的蛋白。这样的天然糖基化蛋白（例 如，空肠弯曲菌蛋白）含有天然的共有序列而不包含任何其他（即，引入 的）优化共有序列。天然糖基化蛋白包括原核蛋白和真核蛋白。本发明的 实施方式进一步包括重组N-糖基化蛋白，包含一个或多个下述N-糖基化局 部氨基酸序列：D/E-X-N-Z-S/T，（优化的共有序列）其中X和Z可以是除 Pro之外的任何天然氨基酸，并且其中至少一个所述N-糖基化局部氨基酸序 列是引入的。将特定的局部氨基酸序列（优化的共有序列）引入蛋白使得 蛋白在引入位点被OTase有效地N-糖基化，例如，来自弯曲菌 （campylobocter spp.）的OTase，例如，来自空肠弯曲菌的OTase。

在本发明的上下文中使用的术语“局部氨基酸序列”也指“优化的共有序 列”或“共有序列”。优化的共有序列被OTaseN-糖基化，例如来自弯曲菌的 OTase，例如，来自空肠弯曲菌的OTase。

根据国际上接受的氨基酸单字母编码，缩写D、E、Ν、S和T分别表 示天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、和苏氨酸。

优化的共有序列的引入可以通过添加、删除和/或取代一个或多个氨基 酸来实现。以引入优化的共有序列为目的添加、删除和/或取代一个或多个 氨基酸可以通过本领域技术人员已知的化学合成策略例如固相辅助化学肽 合成来实现。可替代地，并且对于更大的多肽优选地，本发明的蛋白可以 通过标准重组技术通过将编码一个或多个优化的共有序列的核酸添加进入 起始蛋白的核酸序列中而制备，所述起始蛋白可以是天然糖基化的蛋白或 者可以是没有天然糖基化的蛋白。

在一种优选的实施方式中，本发明的蛋白可以包含一个或多个，优选 至少两个或至少三个，更优选至少五个所述引入的N-糖基化的优化的氨基 酸序列。

本发明蛋白中的一个或多个N-糖基化的优化的氨基酸序列的存在有利 于增加其抗原性、增加其稳定性、影响其生物活性、延长其生物半衰期和/ 或简化其纯化。

优化的共有序列在位点X和Z处可以包括除脯氨酸之外的任何氨基酸。 术语“任何氨基酸”意指包含常见的和稀有的天然氨基酸以及合成的氨基酸 衍生物和类似物，其仍然能够使得优化的共有序列被OTase N-糖基化。对 于X和Z而言，天然存在的常见和稀有氨基酸是优选的。X和Z可以是相 同或不同的。

注意到在根据本发明的蛋白的每个优化的共有序列中X和Z可以不同。

当在脂载体上通过OTase转移来装配寡糖时，结合于优化的共有序列 的N-聚糖将通过特定的糖转移酶及其相互作用来确定。本领域技术人员能 够通过改变期望的宿主细胞中存在的特定糖基转移酶的类型和量来设计N- 聚糖。（Raetz&Whitfield，Lipopolysaccharide Endotoxins，NIH-PA Author  Manuscript1-57，19-25（作为以下的最终编辑形式出版：Annual Rev. Biochem.，71:635-700(2002)）；Reeves等人，Bacterial Polysaccharide Synthesis  and Gene Nomenclature，Trends in Microbio.4(3):495-503，497-98(1996年 12月)；以及Whitfield，C.和I.S.Roberts.1999.Structure，assembly and  regulation of expression of capsules in Escherichia coli.Mol Microbiol31(5): 1307-19）。

如本文所用的，“多糖”包括包含至少两个单糖的糖。多糖包括寡糖、三 糖、包含一个或多个单糖（或单体）的重复单元、和本领域技术人员认为 是多糖的其他糖。N-聚糖在本文中被定义为可变组成的单糖、寡糖或多糖， 其通过N-糖苷键连接于蛋白中的天冬酰胺残基的ε-氨基氮。

本发明的实施方式的多糖包括但不限于金黄色葡萄球菌多糖例如CP5 和PC8。本发明的实施方式进一步包括靶向细菌的金黄色葡萄球菌多糖， 例如靶向耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌株的多糖。当本文提及多糖靶向细 菌菌株时，这样的多糖包括来自期望发生针对它的免疫或抗原应答，并进 一步包括与之相同、基于、来源于、其自身产生的、或者由这样的细菌加 工的、期望发生针对它的免疫或抗原应答的细菌的多糖。

对本发明的重组蛋白的来源没有限制。在一种实施方式中，所述蛋白 来自哺乳动物、细菌、病毒、真菌或植物蛋白。在进一步的实施方式中， 该蛋白来自哺乳动物，最优选人蛋白。为了制备根据本发明的抗原重组蛋 白，优选为了用作疫苗中的活性组分，优选钙重组蛋白来自细菌、病毒或 真菌蛋白。各种来源的蛋白的糖基化是本领域技术人员公知的。Kowarik等 人"Definition of the bacterial N-glycosylation site consensus sequence"EMBO J.(2006)1-10。

在一种实施方式的实例中，遗传减毒的铜绿色假单胞菌外毒素（EPA） 是合适的蛋白载体。为了产生可以被糖基化的EPA形式，编码EPA的核酸 需要通过插入如前所述的糖基化位点来进行修饰。

想要用于本发明的实施方式的蛋白载体应该优选具有某些免疫学和药 理学特征。以免疫学的观点来看，优选地，蛋白载体应当：（1）具有T细 胞表位；（2）能够将抗原递送至免疫系统中的抗原呈递细胞（APC）；（3） 是有效的和持久的；以及（4）能够产生抗原特异性系统性IgG应答。以药 理学的观点来看，蛋白载体应当优选：（1）是无毒的；且（2）能够有效 递送抗原穿过完整的上皮屏障。更优选地，除了这些免疫学和药理学特征， 考虑用于生产细菌生物缀合物的蛋白载体应当：（1）易于分泌进入周质空 间；且（2）能够具有易于作为环状或线性序列引入其中的抗原表位。根据 本文公开的内容和本领域普通技术人员的知识，本领域普通从业者可以常 规地考虑并鉴别可以用于本发明的特定实施方式的合适的蛋白载体。

在本发明的一种实施方式中，弯曲菌蛋白AcrA是蛋白载体。

在本发明的进一步的实施方式中，遗传减毒的铜绿色假单胞菌外毒素 （EPA）是蛋白载体，其中期望疫苗的靶标生物是金黄色葡萄球菌。与含有 天然糖基化位点的AcrA不同，EPA不含有这样的天然糖基化位点，而需要 通过插入糖基化位点来修饰（例如，将编码前文所讨论的优化的共有序列 的核酸插入编码EPA的核酸序列中）。在一种另外的实施方式中，对进行 EPA修饰以引入两个允许用金黄色葡萄球菌抗原来糖基化的糖基化位点。 在另外一种实施方式中，如WO2009/104074的实施例10所讨论的引入两 个共有序列。

在本发明的一种实施方式中，EPA的氨基酸序列被修饰为包含两个糖 基化位点，即SEQ ID NO:13（具有信号序列）和SEQ ID NO:14（不具有 信号序列）。SEQ ID NO:13中的糖基化位点是DNNNS和DQNRT，位置 为260DNNNS和402DQNRT。SEQ ID NO:14中的糖基化位点是DNNNS 和DQNRT，位置为241DNNNS和383DQNRT。

蛋白载体例如EPA是这样的蛋白，可以为了产生细菌的生物缀合物而 在其中加入N-糖基化位点。N-糖基化位点需要引入如前所述的共有序列， 称为，D/E-X-N-Z-S/T序列子的插入，其中X和Z可以是除脯氨酸之外的 任何天然氨基酸。我们发现这样的共有序列优选引入表面环中，通过插入 而不是突变，并通过利用额外插入的侧翼残基和通过侧翼残基的突变来优 化N-糖基化位点的运转。

一些充分表征的金黄色葡萄球菌的蛋白亚单位抗原是α溶血素（α毒 素，Hla）、聚集因子α（ClfA）、IsdB、和Panton-Valentine杀白细胞素 （Panton-Valentine Leukocidin，PVL）。

Hla是分泌的孔形成毒素，并且是金黄色葡萄球菌肺炎的小鼠模型中 MRSA的基本的毒性因子。独立的金黄色葡萄球菌菌株的Hla表达水平与 其毒性直接相关。不能形成孔的Hla的突变形式（Hla H35L，SEQ ID NO:5） 的自动免疫（Menzies，B.E.，和D.S.Kernodle.1996.Passive immunization  with antiserum to a nontoxic alpha-toxin mutant from Staphylococcus aureus is  protective in a murine model.Infect Immun64:1839-41；Jursch，R.，A. Hildebrand，G.Hobom，J.Tranum-Jensen，R.Ward，M.Kehoe和S.Bhakdi. 1994.Histidine residues near the N terminus of staphylococcal alpha-toxin as  reporters of regions that are critical for oligomerization and poreformation. Infect Immun62(6):2249-56）显示，产生抗原特异性免疫球蛋白G应答并 提供针对葡萄球菌肺炎的保护。Hla特异性抗体的转移保护了幼体动物对抗 金黄色葡萄球菌的激发并防止在感染期间人肺上皮细胞的伤害（Bubeck Wardenburg，J.，A.M.Palazzolo-Ballance，M.Otto，O.Schneewind和F.R. DeLeo.2008.Panton-Valentine leukocidin is not a virulence determinant in  murine models of community-associated methicillin-resistant Staphylococcus  aureus disease.J Infect Dis198:1166-70）。为了用作疫苗，需要Hla中的 H35L突变以消除该蛋白的毒性（Menzies，B.E.和D.S.Kernodle.1994. Site-directed mutagenesis of the alpha-toxin gene of Staphylococcus aureus: role of histidines in toxin activity in vitro and in a murine model.Infect Immun 62:1843-7）。ClfA包含用于免疫的蛋白酶抗性结构域。在乳腺感染模型中， 小鼠用抗-ClfA和抗CP5抗体被动免疫有效地使乳腺无菌化（Tuchscherr， L.P.，F.R.Buzzola，L.P.Alvarez，J.C.Lee和D.O.Sordelli.2008.Antibodies  to capsular polysaccharide and clumping factor A prevent mastitis and the  emergence of unencapsulated and small-colony variants of Staphylococcus  aureus in mice.Infect Immun76:5738-44）。

本发明的进一步实施方式包括与金黄色葡萄球菌自身产生的蛋白例如 Hla和ClfA的糖基化。在本发明的另外的实例性实施方式中，可以选择所 用的蛋白载体为Hla蛋白，例如Hla H35L（例如，SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:16）。在本发明的另一种实例性实施方式 中，蛋白载体是ClfA蛋白（例如，SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ  ID NO:12）。

本发明进一步涉及重组宿主原核生物，其包含：编码一个或多个第一 原核物种例如革兰氏阳性类型的糖基化转移酶的核苷酸序列；不同的原核 物种例如革兰氏阴性类型的一种或多种糖基转移酶；编码蛋白的氨基酸序 列；和编码OTase的核苷酸序列。本发明另外还涉及重组宿主原核生物， 其包含：引入的编码仅由革兰氏阳性原核生物自身产生的糖基转移酶的核 苷酸序列；编码蛋白的核苷酸序列；和编码OTase的核苷酸序列。本发明 还涉及重组的或工程化的宿主原核生物，其包含：编码第一原核物种自身 产生的糖基转移酶的核苷酸序列，其例如不同于宿主原核生物；编码第二 原核物种自身产生的糖基转移酶的核苷酸序列，所述第二原核物种不同于 所述第一原核生物的物种并且，例如，不同于所述宿主。工程化的原核生 物也可以，例如，包含是革兰氏阳性类型的第一原核物种。工程化的原核 生物也可以，例如，包含是革兰氏阴性类型的第二原核物种。本发明进一 步包括重组的或工程化的革兰氏阴性菌宿主原核生物，其包含：编码革兰 氏阴性原核物种自身产生的糖基转移酶的核苷酸序列，所述革兰氏阴性原 核物种例如不同于所述宿主原核物种；编码金黄色葡萄球菌自身产生的糖 基转移酶的核苷酸序列；编码蛋白的核苷酸序列；和编码OTase的核苷酸 序列。本发明进一步包括重组的或工程化的大肠杆菌宿主，包含：编码铜 绿色假单胞菌自身产生的糖基转移酶的核苷酸序列；编码金黄色葡萄球菌 CP5菌株和/或金黄色葡萄球菌CP8菌株自身产生的一种或多种糖基转移酶 的核苷酸序列；编码铜绿色假单胞菌EPA、金黄色葡萄球菌α溶血素或金 黄色葡萄球菌聚集因子A蛋白载体的核苷酸序列；和编码OTase例如空肠 弯曲菌自身产生的OTase的核苷酸序列。

除了在修饰的宿主大肠杆菌生物体内利用其他革兰氏阴性生物体的生 物合成途径之外，在进一步的实施方式中，宿主大肠杆菌生物体内还包括 编码以下的核酸：（i）用于构建其他革兰氏阴性生物体的多糖的重复单元 结构（其与靶标革兰氏阳性金黄色葡萄球菌生物体的感兴趣的多糖的重复 单元相同）的糖基转移酶，和（ii）构建靶标革兰氏阳性金黄色葡萄球菌生 物体的感兴趣的多糖的单元的糖基转移酶，所述单元在其他革兰氏阴性生 物体的相关多糖内没有被发现，和（iii）翻转和聚合所构建的靶标革兰氏阳 性金黄色葡萄球菌生物体的感兴趣的RU以形成金黄色葡萄球菌荚膜样多 糖。尤其是，在该实施方式中，编码（i）的核酸起源于其他革兰氏阴性细 菌，而编码（ii）和（iii）的核酸起源于靶标革兰氏阳性金黄色葡萄球菌生 物体。

本发明的另一个方面涉及：工程化的宿主原核生物，其包含：i）编码 革兰氏阳性原核物种自身产生的糖基转移酶的核苷酸序列；ii）编码蛋白的 核苷酸序列；和iii）编码OTase的核苷酸序列，其中编码所述革兰氏阳性 原核物种的转运体基因的序列被删除。这样的实施方式涉及引入的核酸构 建体，其仅编码革兰氏阳性糖基转移酶。

关于在一种或多种其他实施方式中被插入宿主的其他核酸，除了注入 编码分别来自铜绿色假单胞菌和金黄色葡萄球菌的糖基转移酶的核酸之 外，还向宿主注入编码蛋白的核酸，例如AcrA、Hla、ClfA或EPA（SEQ ID  NO:15、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16； SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:13、SEQ ID  NO:14）、以及空肠弯曲菌的寡糖转移酶（SEQ ID NO:27），它们是该生 物提的糖基化机制的一部分。结果，修饰的大肠杆菌生物提能够用在该生 物提中通过来自金黄色葡萄球菌和其他革兰氏阴性细菌的糖基转移酶的作 用产生的多糖来糖基化AcrA蛋白。

本发明的一种实施方式涉及工程化的宿主原核生物，包含：i）编码不 同于宿主原核生物的第一原核物种自身产生的糖基化转移酶的核苷酸序 列；ii）编码不同于宿主原核生物的第二原核物种自身产生的糖基转移酶的 核苷酸序列，所述第二原核物种为例如，革兰氏阳性原核物种；iii）编码蛋 白的核苷酸序列；和iv）编码OTase的核苷酸序列。在本发明的实施方式 中，第一原核物种是革兰氏阴性类型，例如，铜绿色假单胞菌。

在本发明的上下文中，宿主细胞是指任何宿主细胞，例如，真核或原 核宿主细胞。在其他实施方式中，宿主细胞是原核宿主细胞，例如埃希杆 菌属种（Escherichia ssp.）、弯曲菌属种（Campylobacter ssp.）、沙门氏菌 属种（Salmonella ssp.）、志贺氏菌属种（Shigella ssp.）、螺杆菌属种 （Helicobacter ssp.）、假单胞菌属种（Pseudomonas ssp.）或芽孢杆菌属种 （Bacillus ssp.）。在进一步的实施方式中，宿主细胞是大肠杆菌（Escherichia  Coli）、空肠弯曲菌（Campylobacterjejuni）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella  typhimurium）等等。

本发明进一步涉及产生生物缀合物疫苗的方法，包括向宿主原核生物 中引入核酸，所述核酸编码金黄色葡萄球菌的一种或多种糖基转移酶；第 二原核物种的一种或多种糖基转移酶；和OTase。另外，本发明涉及通过在 革兰氏阴性细菌中产生修饰的十一异戊烯醇（Und）上的荚膜多糖，并将这 些多糖抗原连接至选定的蛋白载体来产生生物缀合物疫苗。

本发明进一步涉及在宿主原核生物中生产糖基化蛋白的方法，其中包 含核苷酸序列，该核苷酸序列编码第一原核生物自身产生的糖基转移酶并 且也编码与不同于第一原核生物的第二原核生物自身产生的糖基转移酶。 本发明另外涉及用革兰氏阳性细菌的荚膜多糖N-糖基化的蛋白的生产，其 通过组合来自不同生物体的不同糖基转移酶来合成。本发明进一步涉及在 宿主原核生物中产生糖基化蛋白，所述宿主原核生物包含引入的核苷酸序 列，该核苷酸序列编码仅由革兰氏阳性原核生物自身产生的糖基转移酶。

如本领域所知，不同多糖的生物合成在细菌细胞中是保守的。多糖在 细胞质膜上由通常的前体（活化的糖核苷）通过具有确定特异性的不同糖 基转移酶而装配在载体脂（carrier lipid）上。（Whitfield，C.和I.S.Roberts. 1999.Structure，assembly and regulation of expression of capsules in  Escherichia coli.Mol Microbiol31:1307-19）。革兰氏阴性菌中O-抗原的多 糖生产和革兰氏阳性菌中I型荚膜多糖的生物合成途径是保守的。该过程利 用相同的脂载体，即，UndP，用于多糖装配。其开始于在膜的细胞质侧向 载体脂UndP上添加单糖-1-磷酸。抗原通过不同的糖基转移酶从活化的糖 核苷来按顺序添加单糖而构建。然后脂连接的寡糖或RU由翻转酶翻转通过 膜。RU在周质空间中通过酶Wzy而聚合，形成所称的在革兰氏阴性菌中 的O-抗原或在革兰氏阳性菌中的荚膜多糖。革兰氏阴性菌利用Wzz酶来调 节聚合物的长度，其然后转移至脂A核心形成LPS。LPS进一步转位至外 膜，将O-抗原暴露于外侧（例如图1中所描绘的）。相反，革兰氏阳性细 菌从通过利用不同的和特异的酶机制而进一步转移这些脂结合前体以形成 荚膜。这些多糖的生物合成途径使得能够在体内通过捕获周质中的多糖至 蛋白载体上而产生生物缀合物。

多糖构建的过程不同于荚膜多糖之处在于荚膜多糖在聚合之后从载体 脂释放并输出至表面。在不含有周质间隔的革兰氏阳性菌（例如金黄色葡 萄球菌）中，抗原的聚合在膜的外侧进行。另外，金黄色葡萄球菌中的长 度调节包括在负责荚膜装配的三种酶的机制中。在该装配中，多糖从脂载 体释放并通过酶促过程输出至表面。

在金黄色葡萄球菌的功能性荚膜表达所需的基因簇中发现的遗传元件 （genetic element）类似于wzy依赖性O-抗原合成簇的遗传机制（Dean， C.R.，C.V.Franklund，J.D.Retief，M.J.Coyne，Jr.，K.Hatano，D.J.Evans， G.B.Pier和J.B.Goldberg.1999.Characterization of the serogroup Oil  O-antigen locus of Pseudomonas aeruginosa PA103.J Bacteriol 181:4275-4284）。

尽管革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的多糖结构之间的差别，但我们仍 出人意料发现并验证了革兰氏阴性生物体中的LPS途径能够用于生产含有 一些革兰氏阳性细菌（例如金黄色葡萄球菌）自身产生的荚膜多糖相同的 重复单元的多糖。由于这些多糖通过革兰氏阴性宿主中的LPS途径机制产 生，因此这样的多糖的结构与LPS多糖前体是相同的。因而，本发明的革 兰氏阴性系统中产生的这样的多糖能够被表征为“修饰的荚膜多糖”或“LPS 荚膜”，以用于本发明的目的。进一步地，新合成的表达系统和生物合成途 径，其包含LPS和荚膜生物合成途径，能够被表征为“修饰的LPS生物合成 途径”，以用于本发明的目的。

在本发明的一种实施方式中，修饰的多糖由修饰的LPS生物合成途径 来生产，其包含：

在本发明的进一步的实施方式中，修饰的多糖由修饰的LPS生物合成 途径来生产，其包含：

利用本发明的技术，能够产生免疫原性的细菌生物缀合物。可以进行 基因修饰以使得细菌多肽在体内在期望的蛋白中的和期望的位点处缀合。

本发明的另一个方面涉及利用如上所述的修饰的LPS生物合成途径来 生产缀合至蛋白载体的LPS-荚膜或修饰的LPS。

本发明的进一步的实施方式包括核酸序列构建体，其编码Cap5和Cap8 完整多糖生物合成簇，其中删除的转运体基因是金黄色葡萄球菌的capA、 capB和capC（参见图6）。

本发明的其他实施方式包括将CP5/O11嵌合簇（SEQ ID NO.2、SEQ ID  NO.3或SEQ ID NO.17）或CP8/O11嵌合簇（SEQ ID NO.4、SEQ ID NO. 18或SEQ ID NO.19）整合到宿主细胞的基因组中。本发明的进一步的实施 方式涉及将以下整合到宿主细胞基因组中：（a）CP5/O11嵌合簇（SEQ ID  NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.17）或CP8/O11嵌合簇（SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19）；（b）编码OTase的核酸；和（c） 编码含有或不含引入的共有序列的蛋白的核酸。

本发明的另一种实施方式涉及质粒，例如，含有SEQ.ID NO:2；SEQ. ID NO:3；SEQ ID NO:4；SEQ.ID NO:17；SEQ.ID NO:18和SEQ.ID NO: 19中的一个或多个的质粒。本发明还包括包含SEQ.ID NO:13；SEQ.ID NO: 14和SEQ.ID NO:15中的一个或多个的质粒。本发明还涉及包含SEQ ID  NO:16；SEQ.ID NO:6；SEQ.ID NO:7和SEQ.ID NO:8中的一个或多个 的质粒。本发明还涉及包含SEQ ID NO:10；SEQ.ID NO:11和SEQ.ID NO: 12中的一个或多个的质粒。此外，本发明还涉及包含SEQ.ID NO:20；SEQ. ID NO:21和SEQ.ID NO:27中的一个或多个的质粒。

本发明的实施方式进一步涉及转化的细菌细胞，例如，包括用包含SEQ. ID NO.2；SEQ.ID NO.3；SEQ.ID NO:4；SEQ.ID NO:17；SEQ.ID NO:18； SEQ.ID NO:19；SEQ.ID NO:20；SEQ.ID NO:21和SEQ.ID NO:27中的 一个或多个的质粒转化的细菌细胞。本发明进一步包括用包含SEQ ID NO: 19和SEQ.ID NO:21中的一个或多个的质粒转化的细菌细胞。本发明进一 步包括用包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:19和SEQ.ID NO:21中的一个 或多个的质粒转化的细菌细胞。本发明进一步包括用包含SEQ.ID NO:16， SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO: 11和SEQ.ID NO:12中的一个或多个的质粒转化的细菌细胞。本发明进一 步包括细菌细胞，例如用包含SEQ.ID NO.3；SEQ.ID NO:4；SEQ.ID NO: 17；SEQ.ID NO:18；和SEQ.ID NO:19中的一个或多个的质粒转化的细菌 细胞，其中所述细菌细胞表达铜绿色假单胞菌自身产生的糖基转移酶和金 黄色葡萄球菌CP5和/或CP8自身产生的糖基转移酶。本发明进一步包括用 包含SEQ.ID NO:17；SEQ ID NO:18和SEQ.ID NO:19中的一个或多个的 质粒转化的细菌细胞，其中所述细菌细胞表达铜绿色假单胞菌自身产生的 糖基转移酶、金黄色葡萄球菌CP5和/或CP8自身产生的糖基转移酶和PglB。 本发明进一步包括（a）用包含SEQ.ID NO.19的质粒转化的细菌细胞，其 中所述细菌细胞表达铜绿色假单胞菌自身产生的糖基转移酶、金黄色葡萄 球菌CP8自身产生的糖基转移酶、大肠杆菌血清型07的Wzz和PglB；（b） 用含有SEQ.ID NO.19和SEQ.ID NO.20中的一个或多个的质粒转化的细 菌细胞，其中所述细菌细胞表达铜绿色假单胞菌自身产生的糖基转移酶、 金黄色葡萄球菌CP8自身产生的糖基转移酶、Wzz（长度调节子）、EPA 和PglB；和（c）包含SEQ.ID NO.16；SEQ.ID NO:6；SEQ.ID NO:7； SEQ.ID NO:8；SEQ.ID NO.13；SEQ.ID NO:14；SEQ.ID NO:15；SEQ.ID  NO:10；SEQ.ID NO:11和SEQ.ID NO:12中的一个或多个的细菌细胞。

本发明的实施方式另外涉及诱导针对由革兰氏阳性细菌和其他细菌在 哺乳动物（例如人类）中引起的感染的免疫应答的方法。在一种实施方式 中，该方法包含向所述哺乳动物给药有效量的药物组合物，所述药物组合 物包含：包含至少一个插入的共有序列D/E-X-N-Z-S/T的蛋白，其中X和 Z可以是出脯氨酸之外的任何天然氨基酸；和一个或多个寡糖或多糖，所述 一个或多个寡糖或多糖相同或不同于该一个或多个寡糖或多糖中的另一 个，来自连接于所述共有序列的革兰氏阳性细菌。本发明的进一步的实施 方式包括诱导针对金黄色葡萄球菌引起的感染的免疫应答，包含向所述哺 乳动物给药有效量的药物组合物，所述药物组合物包含：插入的共有序列 D/E-X-N-Z-S/T，其中X和Z可以是除脯氨酸之外的任何天然氨基酸；至少 一个金黄色葡萄球菌寡糖或多糖，例如CP5多糖；和药学上可接受的佐剂。 本发明的另一种实施方式涉及在哺乳动物中诱导针对金黄色葡萄球菌引起 的感染的免疫应答，包括向所述哺乳动物给药有效量的药物组合物，所述 药物组合物包含：插入的共有序列D/E-X-N-Z-S/T，其中X和Z可以是除 脯氨酸之外的任何天然氨基酸；至少一个金黄色葡萄球菌寡糖或多糖，例 如CP8多糖；和药学上可接受的佐剂。另外一种实施方式涉及在哺乳动物 中诱导针对金黄色葡萄球菌引起的感染的免疫应答，包含给药有效量的药 物组合物，所述药物组合物包含具有两个或多个共有序列的蛋白和来自不 同的革兰氏阳性细菌菌株的寡糖或多糖。另外一种实施方式涉及在哺乳动 物中诱导针对金黄色葡萄球菌引起的感染的免疫应答，包含给药有效量的 药物组合物，所述药物组合物包含具有两个或多个共有序列的蛋白以及包 含金黄色葡萄球菌CP5和金黄色葡萄球菌CP8的多糖。

在本说明书中记载了特定的核苷酸或氨基酸序列的实例中，可以理解 本发明覆盖了仍然表现出与所记载的序列功能相同的同源序列。在本发明 的一种实施方式中，这样的序列至少85%同源。在另一种实施方式中，这 样的序列至少90%同源。在进一步的实施方式中，这样的序列至少95%同 源。两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性的确定是本领域技术人 员公知的。

本文描述的核酸序列，例如在说明书所附的序列表中描述的那些，仅 是示例，对本领域技术人员而言这些序列显然可以以不同方式组合。本发 明的其他实施方式包括核酸变体。核酸变体（例如，密码子优化的核酸） 可以是基本上相同的，即，与SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3， SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO: 8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12，SEQ  ID NO:13，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO: 17，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21， SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:25，SEQ ID  NO:26和/或SEQ ID NO:27至少70%相同，例如，75%，80%，85%，90%， 91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或99.5%相同。序 列的核酸变体含有SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO: 4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO: 9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13，SEQ  ID NO:14，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO: 18，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22，SEQ  ID NO:23，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:26，和/或SEQ ID  NO:27。包括从含有SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO.3，SEQ ID  NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ  ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13， SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID  NO:18，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22， SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:26，和/或 SEQ ID NO:27或其部分的序列进行取代、改变、修饰、替换、删除和/或 添加一个或多个核苷酸（例如，2，3，4，5，6，8，10，12，15，20，25， 30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250，300，350，400， 450，500个或更多个核苷酸）的核酸。

这样的变体包括编码原核糖基转移酶的核酸，其i）在宿主细胞例如大 肠杆菌中被表达并且ii）与SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4， SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:18和/或SEQ ID NO:19基本相同或与其部分 相同。

本文描述的核酸包括重组DNA和合成（即，化学合成）DNA。核酸可 以是双链或单链的。在单链核酸的情况下，核酸可以是正义链或反义链。 核酸可以利用寡核苷酸类似物或衍生物来合成，如本领域技术人员在本说 明书的教导下所能获知的。

包括本文描述的核酸的质粒可以被转化进入宿主细胞以表达。转化技 术是本领域技术人员在本说明书的教导下是知晓的。

本发明的另外的实施方式涉及产生含有缀合至蛋白载体的LPS-荚膜或 修饰的LPS的革兰氏阳性生物缀合物疫苗。

本发明的进一步实施方式涉及新的生物缀合物疫苗。本发明的进一步 实施方式涉及生产这样的生物缀合物疫苗的新途径，其利用直接产生免疫 原性或抗原性生物缀合物的重组细菌细胞。在一种实施方式中，生物缀合 物疫苗可以用于治疗或预防细菌疾病，例如腹泻、医院感染和脑膜炎。在 进一步的实施方式中，缀合物疫苗可以具有对癌症或其他疾病的治疗和/或 预防潜力。

在本发明的另一种实施方式中，合成的多糖（即，糖残基）和蛋白（即， 蛋白载体）的复合物可以用作缀合物疫苗以保护免受感染例如金黄色葡萄 球菌感染。在一种实施方式中，生物缀合物疫苗，例如革兰氏阳性疫苗， 包含含有插入的共有序列的蛋白载体；至少一个来自革兰氏阳性细菌的寡 糖或多糖连接至所述共有序列，以及可选地佐剂。本发明进一步涉及革兰 氏阳性生物缀合物疫苗的另一种实施方式，例如金黄色葡萄球菌疫苗，包 含含有插入的核酸共有序列的蛋白载体；至少一个连接至共有序列的来自 革兰氏阳性细菌的寡糖或多糖，例如荚膜多糖或LPS荚膜，以及可选地佐 剂。在本发明的另一种实施方式中，金黄色葡萄球菌生物缀合物疫苗包含 两个或更多个这些插入的共有序列。在进一步的实施方式中，金黄色葡萄 球菌生物缀合物疫苗包含两个或更多个金黄色葡萄球菌寡糖或多糖。更进 一步的实施方式包含两个或更多个所述插入的共有序列和来自不同的金黄 色葡萄球菌菌株的寡糖或多糖，例如，来自金黄色葡萄球菌荚膜多糖5菌 株（CP5）和荚膜多糖8菌株（CP8）。

本发明另外的实施方式涉及利用修饰的LPS途径通过糖基化系统来生 产的金黄色葡萄球菌疫苗，其包含生产修饰的荚膜多糖或LPS-荚膜。另外 的实施方式涉及利用修饰的LPS途径通过糖基化系统生产的金黄色葡萄球 菌疫苗，其包含从引入的核酸生产修饰的荚膜多糖，所述核酸不编码革兰 氏阴性原核物种的糖基转移酶。

进一步的实施方式涉及通过包含核酸的糖基化系统生产的金黄色葡萄 球菌疫苗，所述核酸编码：i）一种或多种负责产生铜绿色假单胞菌自身产 生的O11抗原的RU的L-FucNAc->D-FucNAc的糖基转移酶；ii）一种或 多种负责产生包含金黄色葡萄球菌的CP5或CP8菌株自身产生的RU的 D-ManNAcA的糖基转移酶；iii）一种或多种负责CP5或CP8构建的RU 的翻转和聚合的酶，iv）含有引入的共有序列的重组蛋白；和v）来自空肠 弯曲菌的寡糖基转移酶。在该实施方式中，宿主生物体可以是革兰氏阴性 菌，例如，大肠杆菌。

本发明的另外的实施方式涉及通过包含核酸的糖基化系统生产的金黄 色葡萄球菌疫苗，所述核酸编码：i）负责生产与铜绿色假单胞菌自身产生 的Ol1抗原的RU的L-FucNAc—>D-FucNAc的糖基转移酶；ii）负责生产 包含金黄色葡萄球菌的CP5或CP8菌株自身产生的RU的D-ManNAcA的 糖基转移酶；iii）空肠弯曲菌的AcrA蛋白，和iv）来自空肠弯曲菌的寡糖 基转移酶。在该实施方式中，宿主生物可以是革兰氏阴性菌，例如，大肠 杆菌。

本发明的疫苗具有治疗和预防用途。可以理解，本发明的疫苗可以用 于人类医学和兽医学领域。因而，免疫对象可以是人或其他动物，例如， 农场动物包括牛、绵羊、猪、马、山羊和家禽（例如，鸡、火鸡、鸭和鹅） 和伴侣动物例如狗和猫。

在另一个方面，本发明涉及产生用于免疫哺乳动物以抵抗细菌例如革 兰氏阳性细菌的疫苗的方法。该方法包括：用包含例如革兰氏阳性多糖（例 如金黄色葡萄球菌多糖）的生物缀合物，和药学上可接受的载体免疫对象。

本发明还披露了了用于保护免受革兰氏阳性细菌例如金黄色葡萄球菌 的感染或者用于治疗革兰氏阳性感染例如金黄色葡萄球菌感染的疫苗组合 物。在一种实施方式中，该疫苗组合物包含一种或多种免疫原性组分，例 如来自金黄色葡萄球菌的多糖，或其片段或部分。在进一步的实施方式中， 该疫苗组合物包含一种或多种免疫原性组分，例如来自革兰氏阴性或革兰 氏阳性细菌的蛋白，或其片段或部分。

本发明的一个方面提供了用于保护免受金黄色葡萄球菌感染的疫苗组 合物，其含有至少一种金黄色葡萄球菌多糖的免疫原性组分或片段和药学 上可接受的载体。这样的免疫原性组分或片段可以包括，例如，长度为至 少约2个单体或长度为至少约3个单体的金黄色葡萄球菌多糖。在本发明 的另一个方面，金黄色葡萄球菌RU包含所述单体。这样的重复单元可以包 括，例如，长度至少为1（一个）的金黄色葡萄球菌RU。

本发明的免疫原性组分或片段可以通过以下方式获得，例如，通过筛 选重组产生或通过化学合成产生的多糖或多肽，或者，例如，通过筛选包 含多糖和蛋白的生物缀合物。筛选本发明的免疫原性组分或片段可以利用 一种或多种若干不同的分析方法来进行。例如，筛选分析包括ELISA和本 领域普通技术人员已知的其他分析方法。

在一种实施方式中，免疫原性组分或片段通过多糖和/或蛋白对刺激针 对革兰氏阳性细菌的IgG抗体的能力来鉴别，例如金黄色葡萄球菌CP5或 CP8多糖，例如通过在小鼠（图15A）和兔（兔15B）中测量特异性针对 CP5抗体（通过ELISA定量）针对糖缀合物疫苗候选CP5-EPA获得的免疫 应答，和本领域普通技术人员已知的其他方法来确定。

在一种实施方式中，免疫原性组合物或片段通过多糖和/或蛋白刺激调 理素活性例如调理吞噬杀灭（opsonophagocytic killing）的能力来鉴别，通 过例如兔抗CP5-EPA抗体（下文实施例7获得，参见图15B）的金黄色葡 萄球菌杀灭（“体外”活性），和本领域普通技术人员已知的其他方法来确定。

在另外一种实施方式中，免疫原性组分或片段通过多糖和/或蛋白刺激 激素和/或细胞介导的针对革兰氏阳性细菌例如金黄色葡萄球菌的免疫性来 鉴别，通过例如在小鼠中（图18）利用CP5-EPA被动免疫的针对细菌感染 （“激发”）的保护，和本领域普通技术人员已知的其他方法来确定。

在本发明的另一种实施方式中，本发明的疫苗组合物可以基于包含本 发明的金黄色葡萄球菌多糖的免疫原性组分或片段的糖蛋白，并可选地进 一步包含药学上可接受的载体或佐剂。在本发明的进一步的实施方式中， 疫苗组合物可以基于包含本发明的金黄色葡萄球菌蛋白的免疫原性组分或 片段的糖蛋白，并可选地进一步包含药学上可接受的载体或佐剂。在本发 明的另外一个方面，疫苗组合物可以基于包含本发明的铜绿色假单胞菌蛋 白的免疫原性组分或片段的糖蛋白，并可选地进一步包含药学上可接受的 载体或佐剂。

如何修饰疫苗以将其给药于一种类型的哺乳动物（例如，小鼠）以及 将其给药于另一种类型的哺乳动物（例如，人类）是本领域技术人员公知 的。例如，本领域技术人员可以容易地知晓从用于小鼠的疫苗组合物的糖 蛋白的蛋白载体上删除其组氨酸标签可以使得糖蛋白适合于在人类中疫苗 组合物的给药。例如，在下列蛋白载体中删除组氨酸标签（HIS-tag），例 如，EPA（SEQ ID NO:13）、ClfA（SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ  ID NO:12）、和Hla（SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ  ID NO:16），将被认为是在用于给药于人类的糖蛋白中使用。

应该理解，革兰氏阳性细菌例如金黄色葡萄球菌或其他细菌感染或疾 病的任何症状的改善是期望的临床目标，包括减少用于由革兰氏阳性菌引 起的感染或疾病的药物的剂量，例如金黄色葡萄球菌引起的感染或疾病， 或其他细菌引起的感染或疾病，或者增加患者的血清或粘液中的抗体产生。 对本领域技术人员而言，显然本发明的疫苗组合物中的一些可用于预防革 兰氏阳性细菌感染，例如金黄色葡萄球菌感染，或其他细菌感染，一些可 用于治疗革兰氏阳性细菌感染，例如金黄色葡萄球菌感染，或其他细菌感 染，并且一些可用于预防和治疗这样的感染。

本发明的实施方式例如疫苗和其他药学试剂可选地可以利用合适的和 药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂和/或佐剂来制备，如本领域所公知 和根据本说明书的教导是显然的。赋形剂、稀释剂或佐剂可以是固体、半 固体或液体物质，其可以作为活性成分的载体或媒介。根据本说明书的教 导，制剂组合物领域的普通技术人员可以根据选择的产品的特定特征、待 治疗的疾病或状况、疾病或状况的阶段、和其他相关条件容易地选择合适 的形式和给药方式（Remington’sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing  Co.(1990)）。药学上可接受的稀释剂、赋形剂或佐剂的比例和性质通过所 选的药学活性化合物的溶解度和化学特性，所选的给药途径和标准药学实 践来确定。

因而，在本发明的实施方式中，疫苗组合物包含免疫原性组分或片段， 例如，金黄色葡萄球菌多糖或其片段和/或金黄色葡萄球菌或铜绿色假单胞 菌蛋白或其片段，并可选地包括药学上可接受的载体。术语“药学上可接受 的载体”是指无毒载体。合适的药学上可接受的载体包括，例如，水、盐水、 磷酸盐缓冲液、右旋糖、甘油、乙醇等等、及其组合。药学上可接受的载 体可以进一步包含少量的辅助物质例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液， 以增加抗体的储存期或效果。这样的药学上可接受的载体包括，例如，液 体、半液体、或固体稀释剂，其作为药物载体、赋形剂或介质。可以使用 本领域已知的任何稀释剂。示例性稀释剂包括，但不限于，聚氧乙烯山梨 聚糖单月桂酸酯、硬脂酸镁、羟苯甲酯和羟苯丙酯、滑石粉、海藻酸、淀 粉、乳糖、蔗糖、右旋糖、山梨醇、甘露醇、阿拉伯胶、磷酸钙、矿物油、 可可脂、和可可油。

进一步地，在本发明的其他实施方式中，疫苗组合物可以可选地包括 佐剂或佐剂的组合，包括，但不限于颗粒佐剂例如铝盐（氢氧化铝、磷酸 铝、羟基磷酸铝硫酸盐（aluminium hydroxyphosphate sulphate）等等）；乳 化剂例如水包油（MF59，AS03）；脂和盐组合例如AS04；油包水 （Montanide）；ISCOMS，脂质体/病毒颗粒；纳米颗粒和微颗粒，等等； 非颗粒的例如肽；皂角苷（QS21）；MPLA；细胞因子；DNA衍生物；细 菌毒素；等等。进一步的实施方式包括用于动物的佐剂，例如弗氏完全佐 剂和弗式不完全佐剂、基于霉菌酸酯的佐剂（例如，海藻糖二霉菌酸酯）、 细菌脂多糖（LPS）、肽聚糖（即，胞壁质、粘肽、或糖蛋白如N-Opaca、 胞壁酰二肽[MDP]、或MDP类似物）、蛋白多糖、链球菌制备物（例如， OK431）、DEAE-右旋糖、中性油（例如miglyol）、蔬菜油（例如花生油）、 聚醚、Ribi佐剂系统或白介素，尤其是刺激细胞介导的免疫的那些。使用 的佐剂部分地取决于糖缀合物疫苗的组合物和类型。给药的佐剂的量取决 于动物的类型和体型。优化剂量可以通过常规方法而容易地确定。

本发明进一步的方面涉及药物组合物，包含至少一种根据本发明的糖 蛋白。包含糖蛋白的药物的制剂是本领域公知的。最终药物组合物的制剂 配方和其给药方式和细节取决于蛋白、宿主细胞、核酸和/或使用的载体。

对本领域技术人员而言，显然本发明的多糖或糖蛋白的治疗有效量部 分地取决于给药进度表、给药的抗体的单位剂量、多糖或糖蛋白是否与其 他治疗性试剂联合给药、患者的免疫状况和健康状况、以及具体多肽或糖 蛋白的治疗活性。

本发明的疫苗组合物和/或药物制剂可以适用于口服、肠胃外或局部使 用，并可以以片剂、胶囊剂、栓剂、溶液混、悬液剂或任何其他合适的方 式或剂量形式向患者给药。在本发明的进一步的方面，该疫苗组合物和/或 药物制剂可以通过任何已知的方法引入待免疫的对象，包括，例如，通过 静脉内、皮内、肌肉内、乳房内、腹膜内或皮下注射；或者通过口服、舌 下、经鼻、肛门或阴道来递送。出于稳定、易于结晶、增加溶解性等目的， 本发明的药学活性化合物，当其自身起作用时，可以以其药学上可接受的 盐的形式来制备和给药，例如酸加成盐或碱加成盐形式。本发明的一种实 施方式中的疫苗组合物经肠胃外给药，例如，通过注射、皮下或肌肉内给 药。肌肉内免疫描述于Wolff等人(1990)Science247:1465-1468以及 Sedegah等人(1994)Immunology91:9866-9870。其他给药模式包括口服和经 皮给药。

本发明的疫苗可以作为初级预防试剂给药于例如成人或儿童，作为次 级预防在感染的宿主中革兰氏阳性细菌例如金黄色葡萄球菌被成功清除 后，或者作为治疗性试剂，有关于在宿主中诱导免疫应答从而预防革兰氏 阳性细菌例如金黄色葡萄球菌引起的感染。本发明的疫苗以本领域技术人 员能够容易地确定的量来给药。治疗可以由单一剂量或一段时间内的多剂 量组成。例如，在一些实施方式中，期望本发明的疫苗对人的典型剂量是 约1-25μg的寡糖抗原，其结合于蛋白载体（而不包含蛋白载体的质量）， 在进一步的实施方式中典型剂量是约1μg至约10μg的多糖抗原，在更进 一步的实施方式中典型剂量是约2μg的多糖抗原。在其他实施方式中，糖 缀合物或疫苗中的糖/蛋白之比为约1:5至约1:10。可选地，疫苗例如本发 明的生物缀合物疫苗，可以包括佐剂。本领域技术人员将认识到，最优剂 量可以根据患者的体重、疾病、给药途径和其他因素而增加或减少。本领 域技术人员还将认识到，合适的剂量水平可以基于已知疫苗的结果而获得。 剂量的数目将取决于疾病、剂型和临床试验的功效数据。

疫苗组合物可以包装为易于递送的形式。优选能够使免疫原性组合物 或片段进入受体哺乳动物的递送形式。

本发明的一种实施方式总体上涉及在革兰氏阴性生物中通过利用修饰 的LPS生物合成途径重组产生革兰氏阳性生物的疫苗。这是通过向宿主插 入包括编码寡糖基转移酶和蛋白的核酸和编码源自至少两种不同生物体的 糖基转移酶的核酸来实现的。该实施方式涉及基于天然生物体对生物体进 行基因工程加工并插入编码以下的核酸：（i）蛋白；（ii）寡糖基转移酶， 和（iii）来自至少两种不同生物体的糖基转移酶。

在这样的实施方式的一个实例中，产生糖基化蛋白产物以用作金黄色 葡萄球菌的疫苗。本发明的疫苗产品在基因修饰的大肠杆菌宿主中产生。 金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性细菌，并具有多糖荚膜。该生物体的疫苗产 品可以基于糖基化蛋白，其糖部分与其荚膜多糖具有相似结构。

在另一方面，本发明涉及产生免疫原性缀合物疫苗的新的生物工程方 法，其提供了优于经典化学缀合方法的优点。在一种实施方式中，该方法 涉及在细菌细胞例如革兰氏阴性细胞（例如大肠杆菌）中体内产生糖蛋白。

如本领领域技术人员所知，糖缀合物的产生和纯化可以根据疫苗候选 物和所用质粒的组合而变化。例如，基于蛋白载体、糖缀合物的糖部分和 纯化的疫苗候选的预期用途（例如，用于动物中或人类）选择哪种纯化过 程是已知的。例如，为了用于人类，已知应当除去另外有利于纯化的HIS 标签。

本文涉及的所有出版物以其整体并入本文作为参考。应当理解，如本 文所用的术语“或”，表示可选择，其可以，并适当时，被组合；也就是说， 术语“或”包括单独的每种列举的可选方式以及其组合。如本文所用的，除非 文本中另外清楚地声明，提及的单数，例如单数形式的“一个”、“一种”、“所 述”和“该”包括复数，并且是指包括该单数的复数。

本发明进一步通过参照下述实施例来定义，这些实施例描述了本发明 的组合物和方法，及其用途。对本领域技术人员而言，该组合物和方法的 修饰均可以在本发明的范围内实施是显而易见的。

实施例

实施例1：大肠杆菌细胞中CP5和CP8多糖的合成

本发明的实施方式的一个目的是在大肠杆菌中生产CP5和CP8抗原多 糖。如上文所讨论的，我们根据现有技术出人意料地以新的方式发现：CP 和O-抗原生产途径功能上重叠，其以RU的结构来展现（参见图1-4）。 CP5和CP8的荚膜聚糖是由2-乙酰氨基-2-脱氧-D-甘露糖醛酸 （D-ManNAcA）和具有D-和L-构型的两个2-乙酰氨基-2,6-二脱氧半乳糖 残基（D-和L-FucNAc）的相似三糖RU组成的聚合物。ManNAcA残基在 两个血清型中连接不同；另外，聚合的聚糖中RU之间的连接是不同的。另 外，在这两个抗原的不同位置具有免疫优势O-乙酰修饰（Jones，C.2005. Revised structures for the capsular polysaccharides from Staphylococcus aureus  types5and8，components of novel glycoconjugate vaccines.Carbohydr Res 340:1097-106）。铜绿色假单胞菌LPS的O11抗原在结构上与CP5和CP8 类似，因为铜绿色假单胞菌LPS的O11抗原含有 [-3)-α-L-FucNAc-(1,3)-β-D-FucNAc-(1,2)-β-D-Glc-(l-]（图4）。（Knirel， Y.A.，V.V.Dashunin，A.S.Shashkov，N.K.Kochetkov，B.A.Dmitriev和 I.L.Hofman.1988.Somatic antigens of Shigella:structure of the O-specific  polysaccharide chain of the Shigella dysenteriae type7lipopolysaccharide. Carbohydr Res179:51-60）。三糖RU不同之处仅在于金黄色葡萄球菌的 D-ManNAcA被葡萄糖单元取代，在铜绿色假单胞菌O11LPS中没有O-乙 酰修饰，以及在RU的第二个和第三个单糖之间的连接类型的不同（图4）。

为了产生能够在UndPP上合成CP5和CP8聚糖的遗传系统，利用Dean 等人的方法（Dean，C.R.，C.V.Franklund，J.D.Retief，M.J.Coyne，Jr.， K.Hatano，D.J.Evans，G.B.Pier和J.B.Goldberg.1999.Characterization of  the serogroup Oil O-antigen locus of Pseudomonas aeruginosa PA103.J  Bacteriol181:4275-4284），我们修饰了来自菌株PA103的铜绿色假单胞菌 O11O-抗原基因簇。编码合成由UndPP-D-FucNAc-L-FuncNAc组成的主干 结构的生物合成机制的基因用金黄色葡萄球菌聚糖所需的金黄色葡萄球菌 酶补充（图1-4），这也是该过程的新用途。从而，利用Dean等人的方法， 来自铜绿色假单胞菌PA103的UndPP-FucNAc-FucNAc生物合成所需的所 有遗传元件均被表达。编码添加第三个糖的糖基转移酶的基因被删除，并 用来自金黄色葡萄球菌Mu50（CP5）和MW2（CP8）的cap5或8簇并具 有轻微修饰的对应基因替换。

编码合成金黄色葡萄球菌荚膜多糖的特定残基的酶的基因根据基因功 能而逐步整合进入O11骨架，如Sau等人所预测（Sau，S.，N.Bhasin，E.R. Wann，J.C.Lee，T.J.Foster和C.Y.Lee.1997.The S.aureus allelic genetic  loci for serotype5and8capsule expression contain the type-specific genes  flanked by common genes.Microbiology143:2395-405.；O'Riordan，K.和J.C. Lee.2004.Staphylococcus aureus capsular polysaccharides.Clin Microbiol Rev 17(1):218-34）。这些步骤在下文解释。

预测cap5I/cap8H基因产物是糖基转移酶，其将ManNAcA添加至RU 的UndPP-D-FucNAc-L-FuncNAc，所述RU形成对每种血清型特异性连接 （Sau，S.，N.Bhasin，E.R.Wann，J.C.Lee，T.J.Foster和C.Y.Lee.1997. The Staphylococcus aureus allelic genetic locifor serotype5and8capsule  expression contain the type-specific genes flanked by common genes. Microbiology143:2395-405）。为了证明这一点，在存在确保铜绿色假单胞 菌O11O-抗原生产的质粒的大肠杆菌中分析Cap5I和Cap5H的活性。表达 O11簇的细胞首先在UndPP上合成O11O-抗原，从UndPP上被大肠杆菌 酶WaaL、O-抗原连接酶转移至脂A核心，形成O11特异性脂多糖（LPS） （Goldberg，J.B.，K.Hatano，G.S.Meluleni和G.B.Pier.1992.Cloning and  surface expression of Pseudomonas aeruginosa O antigen in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A89(22):10716-20）。为了合成该脂多糖，将来自铜 绿色假单胞菌PA103的O11O-抗原簇克隆至pLAFRl中（SEQ ID NO:1）。 然后通过转位子突变删除编码该糖基转移酶的wbjA基因，其为将第三个糖 添加至O11RU的酶。突变的簇（O11wbjA::Tn50<dhfr-l>）进一步通过同 源重组来修饰，以消除wzy基因的聚合酶活性，形成O11wbjA::Tn50<dhfr-1> wzy::cat，其表示为突变的SEQ ID NO:1，其中O11基因簇的糖基转移酶 wbjA和wzy聚合酶的基因失活。该修饰的簇在W3110ΔwecA细胞中表达， 提取物用蛋白酶K处理并通过SDS-PAGE和银染色进行分析，根据Tasi 等人描述的方法（Tsai，C.M.和C.E.Frasch.1982.A sensitive silver stain for  detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels.Anal Biochem119: 115-9）。结果在图5A中提供，示出了如本文所述从pLAFR1表达突变的 Ol1簇的W3110ΔwecA提取物的银染色。第二泳道指示了从可诱导质粒 pEXT22表达的基因。星形表示合成的和密码子优化的基因。不同的相关糖 型（glycoform）以箭头标示。

分析的结果参见凝胶中的两个主要条带（图5A，第1泳道）。信号对 应于未修饰的脂A核心的信号（图5A，下部条带）和由脂A核心与两个 FucNAc残基组成的LPS，如同在截短的O11RU中所期望的。根据分离的、 IPTG可诱导质粒的wbjA野生型拷贝的表达，上部条带上移至更慢的电泳 迁移率，表明了葡萄糖残基被添加至截短的O11LPS（图5A，第2泳道）。 当期望的金黄色葡萄球菌糖基转移酶Cap5I（第4泳道）和Cap8H（图5A， 第3泳道）以反式而不是WbjA表达时，观察到与糖基化的脂A核心信号 的类似迁移，表明添加的单糖可能比葡萄糖大，最可能是ManNAcA。数据 证明，金黄色葡萄球菌糖基转移酶能够延长通过铜绿色假单胞菌酶的活性 而合成的UndPP-D-FucNAc-L-FuncNAc糖脂。

通过该方法也证实了在大肠杆菌中金黄色葡萄球菌RU装配的一个先 决条件是提供UDP-ManNAcA，因为该生物合成机制存在于金黄色葡萄球 菌CP5/8簇中而不存在于铜绿色假单胞菌的O11O-抗原簇中。所有其他需 要的核苷酸活化的糖通过大肠杆菌的管家功能或铜绿色假单胞菌的O11O- 抗原簇来提供。已知大肠杆菌通过表达wecB和wecC产生UDP-ManNAcA， 其为ManNAcA糖基转移酶的底物。这些基因在负责肠道菌共同抗原（ECA） 生物合成的簇中构成性表达（Meier-Dieter，U.，R.Starman，K.Barr，H.Mayer 和P.D.Rick.1990.Biosynthesis of enterobacterial common antigen in  Escherichia coli.J Biol Chem265:13490-13497）。在金黄色葡萄球菌的CP 簇中发现的UDP-ManMAcA生物合成的功能类似物被发现补充wecBC活 性，如之前所报道的（Kiser，K.B.，N.Bhasin，L.Deng和J.C.Lee.1999. Staphylococcus aureus cap5P encodes a UDP-N-acetylglucosamine2-epimerase  with functional redundancy.J.Bacteriol181(16):4818-24）。这显示了大肠杆 菌中CP抗原的产生依赖于宿主菌株中wecBC基因的功能性表达。因此， 为了提供在重组系统中作为Cap5I和Cap8H底物的UDP-ManMAcA，证实 了WecB和WecC必须被表达。在该系统中，可以使用任何表达肠道菌共 同抗原的原核株，例如大肠杆菌野生型株，例如基于含有或不含wecA删除 以及含有或不含另外的wzzE删除的W3110的细胞类型。

金黄色葡萄球菌荚膜多糖的进一步延长被认为是聚糖的最大免疫活性 所需要的。cap5J/cap8I基因编码聚合重复单元的wzy同源物，而 cap5K/cap8K编码将UndPP-连接的三糖从细胞质转移至膜的周质侧的翻转 酶。Cap5H/cap8J编码在3’位修饰RU的L-FucNAc或在4’位修饰RU的 ManNAcA的O-乙酰转移酶（Bhasin，N.，A.Albus等人(1998)."Identification  of a gene essential for O-acetylation of the Staphylococcus aureus type5 capsular polysaccharide."Mol Microbiol27(1):9-21）。乙酰化是区别多糖的 免疫反应性的重要决定性因素（Fattom，A.I.，J.Sarwar，L.Basham，S.Ennifar 和R.Naso.1998.Antigenic determinants of S.aureus type5and type8 capsular polysaccharide vaccines.Infect Immun66:4588-92）。为了显示RU 可以被延长并乙酰化，负责聚合和O-乙酰化的金黄色葡萄球菌酶在突变的 O11簇存在下从单独的质粒表达。用蛋白酶K处理来自表达O11 wbjA::Tn50<dhfr-1>wzy::cat簇和CP5簇的不同基因的W3110ΔwecA细胞的 提取物并用SDS-PAGE进行分析，电迁移之后用抗CP5糖实施免疫印迹（获 自J.C.Lee处，Department of Medicine，Brigham and Women's Hospital，哈 佛医学院，波士顿，MA，USA）。图5B示出了通过SDS-PAGE和利用抗 CP5抗血清电迁移而分离的蛋白酶K处理的大肠杆菌提取物的免疫检测结 果。分析的所有提取物含有铜绿色假单胞菌O11簇并删除wbjA和部分（以 星号表示）wzy基因，其由pLAFR质粒表达，如本文所述，以及另外两个 质粒（pEXT22，pACT3），其表达不同的Cap5蛋白（如所表示的），其 使得在这些细胞中能够CP5聚合和O乙酰化。示出了实验详情例如诱导试 剂浓度和表达簇孵育温度。

在图5B中，结果显示为阶梯样的信号，典型地是高分子量范围的O- 抗原聚合物。不同的条带代表了在LPS或UndPP上线性聚合的RU的不同 数目，它们均对于蛋白酶K消化是稳定的。观察到了在O-乙酰转移酶存在 或不存在的情况下阶梯样的结构的不同强度。而在cap5H存在下检测到强 信号（图5B，第1-4泳道），其在不含cap5H的泳道中基本上不存在（图 5B，第5、6泳道）。这意味着O-乙酰化或者通过特定抗血清而增加识别， 或者通过加速翻转或使得聚合更有效率诱导更多RU或者通过诱导更多地 产生RU来实现聚合（图5B，第1，2泳道和第3，4泳道），单信号强度 强于cap5H从分离的质粒单独克隆的情况（比较图5B第1泳道至第3泳道 和图5B第2泳道至第4泳道）。这是出人意料的和不同寻常的，即用于诱 导金黄色葡萄球菌基因的IPTG越少，信号越强烈（比较图5B，第1至第2 泳道和图5B，第2至第4泳道）。

实施例2：大肠杆菌细胞中脂上CP5和CP8聚合物的合成

由于cap5特异性基因的高度表达导致了低聚合物的形成，构建了重组 聚糖的可选表达系统以解决该问题。详细来说，作为现有技术的教导中未 期望的新方法，将O11的铜绿色假单胞菌糖基转移酶（wbjA）和聚合酶（wzy） 替换为编码来自金黄色葡萄球菌Mu50/MW2（cap5/8HIJK及其部分）的荚 膜基因簇的CP5/8特异性元件，其产生由铜绿色假单胞菌O11和金黄色葡 萄球菌CP5或CP8基因组成的单一的嵌合基因（图6）。该构建体含有金 黄色葡萄球菌的特定基因。分别被标记为表达检测并且分别含有引入的核 糖体结合位点，并且随后是氯霉素抗性盒（cat）用于筛选形成SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:4的重组克隆，根据Datsenko等人的方 法（Datsenko，K.A.和B.L.Wanner.2000.One-step inactivation of  chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proc Natl  Acad Sci U S A97:6640-5）。

图6描述了本发明构建嵌合的O11/CP5和O11/CP8基因簇的策略的一 种实施方式。金黄色葡萄球菌CP5和CP8簇（顶部）和铜绿色假单胞菌PA103 rfb簇（O11，中部）根据如下公开内容示出（Dean，C.R.，C.V.Franklund， J.D.Retief，M.J.Coyne，Jr.，K.Hatano，D.J.Evans，G.B.Pier和J.B. Goldberg.1999.Characterization of the serogroup Oll O-antigen locus of  Pseudomonas aeruginosa PA103.J Bacteriol181:4275-84；Sau，S.，N.Bhasin， E.R.Wann，J.C.Lee，T.J.Foster和C.Y Lee.1997.The S.aureus allelic  genetic loci for serotype5and8capsule expression contain the type-specific  genes flanked by common genes.Microbiology143(Pt7):2395-405）。基因的 同源功能在下文描述。完整的正向对角线表示在两种生物体中在UndPP上 负责D-FucNAc-L-FucNAc二糖的合成的基因；点表示将第三个单糖添加到 RU上的糖基转移酶。Wzx-样翻转酶基因以正向虚对角线表示，wzj-样RU 聚合酶基因以反向的虚对角线表示。CP5簇不含有Wzz长度调节子（空箭 头），但具有一系列的三个基因，包含荚膜多糖的输出机制，其包括金黄 色葡萄球菌中的长度调节功能（空箭头）。O-乙酰转移酶基因，表示为完 整的正向对角线，是CP簇所特有的。在金黄色葡萄球菌中UDP-ManNAcA 的生物合成所需要的基因表示为黑色。它们是产生铜绿色假单胞菌O-抗原 所不需要的。这些负责O11、CP5和CP8多糖的结构上的不同的基因在对 应的基因簇的起始（O11:wbjA和wzy）或中部（CP5/8：cap5/8HIJK）聚集 在一起。考虑到长度和DNA序列，CP8簇与CP5簇几乎相同，除了确保结 构特异性的中间部分（cap5/8HIJK）。嵌合簇通过将质粒产生的O11簇的 wbjA和wzy基因替换为CP5（或CP8）簇（cap5/8HIJK）的特定部分和氯 霉素乙酰转移酶表达盒而构建，所述表达盒表示为空箭头并标记为cat（cat， 用于筛选）通过同源重组和经典克隆产生SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、 和SEQ ID NO:4。虚箭头上的星形表示用于同源重组的完整基因序列。产 生的两个嵌合簇显示在底部，表示为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的 DNA。

为了证明本发明的嵌合CP5和CP8出人意料地在UndPP上装配正确的 RU并保证重复单元被聚合，通过SDS-PAGE来制备含有全长嵌合簇的大 肠杆菌细胞（W3310ΔwecA）的蛋白酶K消化液。具体地，用蛋白酶K处 理具有含有或不含嵌合CP5基因簇（图7A）或嵌合CP8基因簇（图7B） 在pLAFR质粒上的质粒的细胞，通过SDS-PAGE分离并且在电转移至纤维 素膜上之后脂类通过银染色（图7A和7B中的左侧）或免疫检测用抗CP5 或CP8抗血清（图7A和7B的右侧）来显影。检测了缺少（SEQ ID NO:2） 和含有（SEQ ID NO:3）翻转酶基因cap5K的构建体。发现前者在CP5LPS 中活性较低。

电转移和用抗CP5特异性血清免疫检测之后，表达完整的嵌合CP5簇 的提取物显示出梯状信号，类似于用其自身抗体标记的大肠杆菌的内源性 O-抗原结构（图7A，右侧的最后两个泳道）。这强烈暗示了CP5重复单元 被聚合，并且具有优选的聚合物长度，并且CP5抗原在这些细胞中被转移 至脂A孔。相同的提取物通过SDS-PAGE后银染色来显影（图7A，在图 的左侧，右边的两泳道标记为：嵌合CP5（w/o cap5K）和嵌合CP5显示确 实LPS形成为由大肠杆菌的脂A孔以CP5O-抗原样结构修饰。由源自具有 或不具有cap5K翻转酶基因的表达CP5嵌合簇的细胞的提取物获得了强度 的差异。这两种提取物的比较显示，Cap5K表达明显的增加了聚合物形成 （比较图7A的两个图上中部和右侧的泳道）。

如图7B所示，用CP8嵌合簇观察到了相同结果。含有含或不含嵌合的 CP8基因簇在pLAFR质粒上的质粒的细胞用蛋白酶K处理，通过 SDS-PAGE分离并且电转移至纤维素膜之后脂类通过银染色（左侧）或免 疫检测利用抗CP8抗血清（右侧）来检测。含有翻转酶基因cap8K的CP8 嵌合构建体对应于SEQ ID NO:4。

通过改变用于在大肠杆菌中保持和表达嵌合簇的质粒骨架来发现了本 发明的进一步的新的和出人意料的延伸。含有嵌合CP5簇的pLAFR1中的 抗性表达盒从Tet变化为Kan。另外，根据Lee等人的方法（Lee，D.J.， L.E.Bingle，K.Heurlier，M.J.Pallen，C.W.Penn，S.J.Busby和J.L.Hobman. 2009.Gene doctoring:a method for recombineering in laboratory and pathogenic Escherichia coli strains.BMC Microbiol9:252），含有cap5K的整 个CP5嵌合簇和pACYC177（GeneBank登录号#X06402）被亚克隆到质 粒pDOC-C中。

如图8A和图8B所示，所有这些质粒确认了CP5聚合物生产，通过 SDS-PAGE、电转移和利用抗CP5特异性抗血清的免疫检测来分析。在图 8A中，用蛋白酶K处理来自含有不同嵌合簇的细胞的全细胞提取物并通过 SDS-PAGE和银染色进行分析。质粒含有不同的金黄色葡萄球菌特异性基 因和不同的抗性基因用于抗性筛选被标注：四环素（Tet）和HIJ，SEQ ID NO: 2；Tet HIJK，SEQ ID NO:3，Tet和没有基因，空质粒对照，对应于分子量 标记的数量。标记卡那霉素（Kan）的泳道含有SEQ ID NO:3的变体，其 中四环素抗性表达盒替换为卡那霉素抗性基因。

如图8A一样，在图8B中，宿主菌株是大肠杆菌W3110ΔwecA。图8B 中的左侧泳道对应于分子量标记，如图8A一样。在图8B中，用蛋白酶K 处理来自含有不同嵌合簇的细胞的总细胞提取物并通过SDS-PAGE和银染 色（左图）和通过电转移之后的CP5免疫印迹（右图）来分析。所用的质 粒含有嵌合CP5簇，在SEQ ID NO:3中被标注，或者存在于含有卡那霉素 表达盒而不是四环素的修饰的pLAFR1质粒骨架中（参见图8A）或者在含 有氯霉素抗性表达盒的pACYC中。

另外，测试了不同的启动子来表达嵌合O11-CP5LPS。在这些测试中， 宿主菌株是带有嵌合CP5簇的大肠杆菌W3110ΔwecA。在该菌株中，该嵌 合簇取代了wecAwzzE基因。用蛋白酶K处理来自含有pLAFR1表达的不 同嵌合簇的细胞的全细胞提取物并通过SDS-PAGE和电转移后的抗CP5免 疫印迹来分析。该质粒含有O11簇，其中wbjA和wzy被替换为不同的金黄 色葡萄球菌特异性基因（具有cat表达盒），如图9中的泳道下所标注的。 另外，cap5特异性基因之前的DNA被改变，并分析了其对于脂类糖基化的 影响。分析这些不同启动子区域的效果并在图9中标注。Wzz/wzx表示cap 基因之前起始同源重组之后的原始基因（参见图6）（图9对应于前两个泳 道）。这两个基因被移除（图9对应于中间的三个泳道），并替换为0.6kb 区域（PO121）（图9对应于最后三个泳道），在大肠杆菌O121O-抗原簇 之前并表达强启动子序列。图9中标注了wzz/wzx和HIJ的泳道来自表达 SEQ ID NO:2的细胞，标注了wzz/wzx和HIJK的泳道来自SEQ ID NO:3。 在图9中，分子量标记标注在凝胶框的左侧。

如图9所示，结果显示了位于wzx基因的相关启动子活性（图9前两 个泳道-wzz/wzx），其可以被来自大肠杆菌的构成性启动子功能性取代，例 如，血清型O121wb启动子（PO121，图9的最后三个泳道），而不损失 LPS生成。总而言之，这些结果意味着本文所述用于O11O-抗原和CP5荚 膜聚合物生产的O11和金黄色葡萄球菌元件可以在很多不同的大肠杆菌表 达系统中组合，并生成重组金黄色葡萄球菌多糖。

这些结果首次显示了在大肠杆菌中源自革兰氏阳性生物的荚膜多糖结 构的生产。这意味着与现有技术和惯常的预期相反，可以组合O11簇的酶 和金黄色葡萄球菌cap簇的酶来构建嵌合多糖，即，这些酶在体内在相同结 构上工作。

实施例3：重组聚糖的分子结构确认

为了在分子水平上确认大肠杆菌中嵌合CP5/O11簇的活性，发展了通 过利用在具有2-氨基苯甲酰胺（2-AB）的还原性末端处的荧光标记的糖来 分析UndPP连接的糖的新方法。为了增加分析的解析度，使用了含有删除 的嵌合簇，所述删除增加了未聚合RU的量。来自表达包含在pLAFR1质 粒中的嵌合簇并缺乏cap5K翻转酶（SEQ ID NO:2）的不同大肠杆菌的糖 脂如下文所述来分析。

为了提取UndPP-连接的聚糖，用0.9%NaCl洗涤大肠杆菌细胞并冻干。 干细胞用30ml有机溶剂（85-95%的甲醇=M）萃取一次。冻干的细胞团块 进一步用5ml的氯仿:甲醇:水（C:M:W=10:10:3；v/v/v）萃取两次。（M） 萃取物用氯仿和水转变至终比例为3:48:47（C:M:W）。10:10:3（C:M:W） 萃取物通过添加水转换为两相Bligh/Dyer（Bligh，E.G.和W.J.Dyer.1959.A rapid method of total lipid extraction and purification.Can J Biochem Physiol 37(8):911-7）体系，使得终比例为10:10:9（C:M:W）。各相通过离心来分 离，保留上面的水相以用于进一步过程。

为了纯化提取的糖脂，使水相经历tC₁₈Sep-PAK管。该管用10ml甲 醇调适，然后用10ml3:48:47（C:M:W）平衡。上样之后，用10ml3:48:47 （C:M:W）洗涤该筒，并用5ml甲醇和5ml10:10:3（C:M:W）洗脱。合并 的洗脱液在N₂中干燥。糖脂样品通过以下步骤来水解：将干燥的样品溶解 在2ml正丙醇:2M三氟乙酸（1:1）中，加热至50°C15分钟，然后在N₂下蒸发至干燥（Glover，K.J.，E.Weerapana和B.Imperiali.2005.In vitro  assembly of the UndPP-linked heptasaccharide for prokaryotic N-linked  glycosylation.Proc Natl Acad Sci U S A102(40):14255-9）。干燥的样品用 2-AB标记，利用描述的纸板法（paper disk method）来实现聚糖的清除 （Bigge，J.C，T.P.Patel，J.A.Bruce，P.N.Goulding，S.M.Charles，R.B. Parekh.1995.Nonselective and efficient fluorescent labeling of glycans using 2-amino benzamide and anthranilic acid.Anal Biochem230(2):229-38；Merry， A.H.，D.C.Neville，L.Royle，B.Matthews，D.J.Harvey，R.A.Dwek和 P.M.Rudd.2002.Recovery of intact2-aminobenzamide-labeled O-glycans  released from glycoproteins by hydrazinolysis.Anal Biochem304(1):91-9）。 2-AB标记的聚糖通过HPLC利用GlycoSep-N正相柱根据Royle等人的方 法来分离，但是改为三溶剂体系（Royle，L.，T.S.Mattu，E.Hart，J.I. Langridge，A.H.Merry，N.Murphy，D.J.Harvey，R.A.Dwek，P.M.Rudd. 2002.An analytical and structural database provides a strategy for sequencing  O-glycans from microgram quantities of glycoproteins.Anal Biochem304(1): 70-90）。溶剂A是10mM甲酸铵pH4.4在80%乙腈中。溶剂B是30mM 甲酸铵pH4.4在40%乙腈中。溶剂C是0.5%的甲酸。柱温为30°C，2-AB 标记的聚糖通过荧光来检测（激发λex=330nm，发射λem=420nm）。梯度 条件是线形梯度，100%A至100%B，在流速0.4ml/min下经过160分钟， 然后是2分钟的100%B至100%C，增加流速至1ml/min。柱用100%C 洗涤5分钟，经2分钟回到100%A并在100%A下以1ml/min的流速跑 15分钟，然后回到流速0.4ml/min5分钟。样品在水中注入。

在目标板上，将干燥的流分重悬于5μl10%乙腈（ACN）、0.1%三氟 乙酸（TFA）并与基质溶液（40mg/ml DHB在50%ACN，0.1%TFA中）以 1:1混合。在Ultraflex-II MALDI-ToF/ToF质谱仪（Bruker Daltonik GmbH， Bremen，Germany）上在阳离子模式下手动获取MS和MS/MS数据。MS/MS 利用LIFT法来获得。标准肽混合物（Bruker Daltonik GmbH）用于外部校 准。谱图用Flex分析软件（Bruker Daltonik GmbH）来输出并手动分析。

用tC₁₈管纯化来自包含含有或（粗线）或不含（细虚线）嵌合簇的质 粒的大肠杆菌W3110ΔwecA（CP5）的甲醇提取物，并通过正相HPLC分 析。在37'，40'和45'洗脱液中发现的对应于图10A中显示的峰，通过 MALDI-MS/MS来分析。在37分钟和40分钟洗脱的样品鉴别为分别具有 或不具有O-乙酰基团附着的重组CP5RU。45分钟洗脱的样品鉴别为非乙 酰化金黄色葡萄球菌RU结构并延长一个脱氧-N-乙酰己糖胺（如图11E所 示）。在CP5嵌合簇中，cap5HIJ替换了pLAFR上O11簇的wbjA和wzy 基因。该替换除了cap5HIJ基因（SEQ ID NO:2）之外还含有cat表达盒。

用tC₁₈管纯化来自包含含有或（粗线）或不含（细虚线）嵌合簇的质 粒的大肠杆菌W3110ΔwecAΔwzzE的甲醇提取物，并通过正相HPLC分析。 图10B显示了利用嵌合簇（SEQ ID NO:4，不含聚合酶）产生的CP8的重 组RU的HPLC分析结果。对表达重组糖的细胞特异的峰鉴别为23'、32'、 38'和45'的洗脱液，收集并通过MALDI-MS和MALDI-MS/MS来分析。在 CP8嵌合簇中，cap8HJK替换了O11簇的wbjA和wzy基因，即，不含聚合 酶的构建体以聚集的单个RU用于分析。该替换在cap基因之外含有cap 表达盒。

图11A示出了通过大肠杆菌中表达本发明的嵌合CP5簇的实施方式洗 脱在37分钟产生的特定峰的MALDI-MS/MS分析结果。主要质量m/z=772 （[M+H]⁺）被选择通过MS/MS分析，其示出了与乙酰化CP5RU结构一致 的片段化方式，这是在本说明书中公开的发明的教导下所期望的。O-乙酰 化种类表征为在RU的中间位置失去42加单糖FucNAc（dHexNAc(OAc)） 的质量。片段离子根据功能糖组学论坛（consortium for functional glycomics） CFG的命名法来标注

（www.functionalglycomics.org/static/consortium/Nomenclature.shtml）。2-AB 为2-氨基苯甲酰胺。片段离子的图例在图11A的图注中给出。

图11B示出了通过大肠杆菌中表达本发明的嵌合CP5簇的实施方式洗 脱在40分钟产生的特定峰的MALDI-MS/MS分析结果。主要质量m/z=730 （[M+H]⁺）被选择通过MS/MS分析，其示出了与乙酰化CP5RU结构一致 的片段化离子系列，这是在本说明书中公开的发明的教导下所期望的。2-AB 为2-氨基苯甲酰胺。片段离子的图例在图11B的图注中给出。

图11C示出了通过大肠杆菌中表达本发明的嵌合CP8簇的实施方式洗 脱在32分钟产生的特定峰的MALDI-MS/MS分析结果。主要质量m/z=794 （[M+H]⁺）被选择通过MS/MS分析，其示出了与乙酰化CP8RU结构一致 的片段化离子系列，这是在本说明书中公开的发明的教导下所期望的。O- 乙酰化种类表征为在RU的最远处位置失去42加单糖FucNAcA （dHexNAcA(OAc)）的质量。片段离子根据CFG的命名法来标注。2-AB 为2-氨基苯甲酰胺。片段离子的图例在图11C的图注中给出。

图11D示出了通过大肠杆菌中表达本发明的嵌合CP8簇的实施方式洗 脱在38分钟产生的特定峰的MALDI-MS/MS分析结果。主要质量m/z=730 （[M+H]⁺）被选择通过MS/MS分析，其示出了与乙酰化CP8RU结构一致 的片段化离子系列，这是在本说明书中公开的发明的教导下所期望的。其 他分析显示后面的洗脱峰（示出在图10A中的40分钟和图10B的38分钟） 含有CP5和8RU的非O-乙酰化三糖。片段离子根据CFG的命名法来标注。 2-AB为2-氨基苯甲酰胺。片段离子的图例在图11D的图注中给出。

MS结果显示质量和片段化离子系列符合O-乙酰化的CP5RU寡糖的分 子结构，其具有中间FucNAc残基（即，图10A和图11A中的37’的峰） 或不具有中间FucNAc残基的O-乙酰化（即，图10A和图11B中的40’的 峰）。图10A中45分钟的信号鉴别为四糖，其在下文进一步分析。用缺少 聚合酶基因的嵌合CP8簇重复相同的分析，在这样的提取物中，在洗脱的 23’和32’发现了与O-乙酰化RU结构一致的信号，这是在本说明书中公开 的发明的教导下期望的，显示在图10B和图11C中。通过MALDI-MS/MS 鉴别的相同聚糖序列的两种不同洗脱时间的存在指示了在样品制备期间发 生了O-乙酰基转移事件。鉴别了CP5和CP8提取物的非乙酰化的RU，在 40’和38’，分别如图11B和图11D所示。CP5和CP8RU结构存在于不同 的大肠杆菌菌株中，包括例如，W3110、W3310ΔwecA，、3310ΔwecAΔwzzE 和W3310ΔwecAΔwzzEΔwaaL。

实施例4：重复单元结构的改进及其分析

图10B中在45分钟洗脱的HPLC峰，源自表达嵌合CP8簇（SEQ ID NO: 4）但是缺少wzy聚合酶基因cap8I的大肠杆菌细胞，也通过MALDI-MS/MS 来分析。在全扫描MS中最强的离子为m/z=939（[M+H]⁺），序列分析通 过MS/MS进行。MS/MS分析的结果显示在图11E中，展现了与在非还原 末端延伸脱氧-N-乙酰己糖胺的质量的非乙酰化金黄色葡萄球菌荚膜RU一 致的片段化离子系列，这是本说明书公开的发明的教导下所期望的。对应 于假定结构的片段离子根据CFG的命名法在峰上标注。2-AB为2-氨基苯 甲酰胺。片段离子的图例在图11D的图注中给出。

图11E中显示的结果暗示了大肠杆菌糖基转移酶能够修饰CP8RU的 ManNAcA残基。这样改变的RU有最大可能性不会被cap8I聚合。大肠杆 菌宿主W3110中糖基转移酶特异性的分析表明来自ECA簇的酶可以干扰 重组糖，尤其是wecF基因产物，一种推定的4-N-乙酰岩藻糖胺转移酶。 WecF天然地将4-N-乙酰岩藻糖胺添加至包含在ECA中的ManNAcA上， 最有可能的是该酶也能够延长CP8和CP5RU。

为了解决这一问题，发展了另一种新的途径。特别地，位于wecC基因 下游包括wecF的ECA簇的基因被删除。这利用Datsenko等人描述的方法 来实现（Datsenko，K.A.和B.L.Wanner(2000)."One-step inactivation of  chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products."Proc Natl  Acad Sci U S A97(12):6640-6645）。不同的大肠杆菌表达宿主在waaL和 rmlB-wecG基因区域被删除，并且在一些菌株中在wecA-wzzECA也被删除。 来自表达聚合酶突变体CP8嵌合簇的这些突变细胞的Sep-PAK纯化的萃取 物（甲醇和10:10:3萃取物）通过如上文所述的正相HPLC来分析。

图11F示出了来自表达SEQ ID NO:4（细线，虚线）的聚合酶突变体 的大肠杆菌W3110ΔwaaL细胞的甲醇萃取物相比于具有ECA簇基因 rmlB-wecG的另外删除的细胞（W3110ΔwaaLΔrmlB-wecG::cat）（粗线） 的HPLC分析结果。萃取物经tC18管来纯化并通过正相HPLC来分析。如 图11F所示，在图10B的45’出现的主要峰在乙酰化和非乙酰化CP8RU（图 11F）的特定峰中不存在，表明ECA糖基转移酶——最可能是wecF——决 定了异常延伸表型。类似的结果也在CP5嵌合簇在不同菌株中测试时获得。 这暗示了删除大肠杆菌运载的糖基转移酶和核苷酸活化糖的生物合成所需 的酶是优化大肠杆菌中重组生产的多糖的品质和数量的可能策略。靶标酶 最可能是在O-抗原簇、ECA簇和可拉酸（colanic acid）或荚膜簇中表达。

与UndPP连接的重组多糖的质量的进一步证据从来自染色体优化的前 文所述的表达宿主的Sep-PAK纯化、荧光标记的糖脂提取物的优化的正相 HPLC分析来获得。为了优化SepPAK柱纯化带电荷的CP5和CP8寡糖和 多糖连接的脂类的表现，将叔丁基磷酸铵（TBAP）加入到提取物帐，之后 上样于Sep-PAK管。如Trent等人所报道，该盐的阳离子通过用疏水丁基 链屏蔽负电荷而改善了带电荷化合物的柱结合（Trent，M.S.，A.A.Ribeiro 等人(2001)."Accumulation of a polyisoprene-linked amino sugar in  polymyxin-resistant Salmonella typhimurium and Escherichia coli:structural  characterization and transfer to lipid A in the periplasm."J Biol Chem276(46): 43132-43144.）。该优化的方法用于通过从表达含CP5和CP8嵌合簇并具 有聚合酶的细胞的甲醇萃取物来获得的CP5和CP8样品。

图11G提供了HPLC分析的结果，其示出了大肠杆菌细胞中UndPP上 存在的全部CP5聚糖组成。来自表达嵌合CP5簇SEQ3（实线）或空质粒 对照（虚线）的大肠杆菌W3110ΔwaaLΔwecAwzzECAΔrmlB-wecG::cat的 甲醇萃取物在Sep-PAK管固相萃取并用弱酸处理以从UndPP上水解糖。获 得的材料与2AB通过还原性胺化来反应以标记聚糖的还原性末端，并通过 正相HPLC分析。在实线中存在而在虚线中不存在的信号代表CP5特异性 材料。大写字母代表含有乙酰化的和/或非乙酰化的CP5RU的聚合物的峰， 通过收集部分的MALDI-MS/MS来鉴别。图11G的图例示出了从MS/MS 分析推导的假定分子结构。应当注意，乙酰化的和非乙酰化的MS/MS确认 的相同聚合度的结构的RU聚合物在色谱中聚集在一起，由粗线条表示。大 写字母示出了下列长度：A和B：一个UR；C，D和E：两个RU；F和G： 三个RU；H：四个RU。图11G中95’和125’之间的宽峰最可能代表没有被 柱分解的5个或更多个聚合的RU。

图11H示出了进一步的HPLC结果，显示乙酰化的CP5聚糖和RU同 源性。为了准备该HPLC分析，用NaOH水溶液处理2AB标记的表达嵌合 CP5簇SEQ ID NO:3（根据上文所述参照图11G的过程来制备）的大肠杆 菌W3110ΔwecAwzzECAΔrmlB-wecG::cat的样品并重新标记。如图11H所 显示，碱处理之前（虚线）和之后（实线）的样品通过HPLC来分析。图 11H中的数字代表对应峰中的RU数目。可以观察到，在图11H中，图11G 中显示的乙酰化峰与非乙酰化聚合物的信号合并起来，而去乙酰化使RU 单元在洗脱时间95分钟后分解了RU单元。

图11I提供了HPLC分析的结果，其示出了大肠杆菌细胞中UndPP上 存在的CP8聚糖组成。来自表达嵌合CP8簇SEQ ID NO:4（实线）或空质 粒对照（虚线）的大肠杆菌W3110ΔwaaLΔwecAwzzECAΔrmlB-wecG::cat 的甲醇萃取物在Sep-PAK管固相萃取并用弱酸处理以从UndPP上水解糖。 获得的材料与2AB通过还原性胺化来反应以标记聚糖的还原性末端，并通 过正相HPLC分析。在实线中存在而在虚线中不存在的信号代表CP8特异 性材料。标注了通过收集部分的MALDI-MS/MS来鉴别的乙酰化和/或非乙 酰化CP8RU的推定结构。从MS/MS分析推导的假定分子结构。应当注意， 如同图11G中显示的CP5的HPLC结果，乙酰化的和非乙酰化的具有相同 聚合度的CP8RU聚合物在图11H的色谱中聚集在一起，由粗线条表示。 110’之后检测到的材料代表更长的CP8聚合物。

图11J示出了进一步的HPLC结果，显示乙酰化的CP8聚糖和RU同 源性。2AB标记的表达嵌合CP8簇SEQ ID NO:4的大肠杆菌W3110 ΔwecAwzzECAΔrmlB-wecG::cat的样品用NaOH水溶液处理并重新标记。碱 处理之前（虚线）和之后（实线）的样品通过HPLC来分析。数字代表对 应峰中的RU推定数目。可以观察到，乙酰化的信号基本上消失，而非乙酰 化聚合物的信号增加，并且去乙酰化使RU单元在洗脱时间110分钟后分解 了RU单元。

图11H和图11J示出了HPLC结果，其表明了O-抗原的特征性梯状带 型，当碱处理在这些CP5和CP8样品上进行以移除寡-和多糖的乙酰化修饰。 该结果示出了具有恒定的洗脱时间增量的减少的离散顶峰。这意味着这样 处理的糖链是由相同的RU组成的线形聚合物。这些结果示出了大肠杆菌中 生产的重组CP5和CP8糖被规则地聚合并部分乙酰化。非乙酰化的CP5和 CP8聚合物类似地从HPLC柱上洗脱下来，这是由于其结构上的相似性而 所期望的；然而，正相色谱也示出了不同之处：例如，CP5聚合了比CP8 少的长度，而且CP5中的乙酰化更频繁；在RU长度大于4时，CP5具有 形成7RU的聚合物的明确优先性，而CP8聚合至更广泛的程度；并且由 HPLC和MS/MS结果所指示，对于聚糖生产而言，CP5比CP8更高效。

在wzy依赖性聚合途径中，Marolda等人报道了特定的酶（用于链长度 确定的wzz或cld）决定了确定发生的RU聚合步骤的平均数目（Marolda， C.L.，L.D.Tatar等人(2006)."Interplay of the Wzx translocase and the  corresponding polymerase and chain length regulator proteins in the  translocation and periplasmic assembly of lipopolysaccharide o antigen."J  Bacteriol188(14):5124-5135.）。Wzz酶引起特定重复数目平均值，例如， 短，长或非常长的糖聚合物已知转移其长度特异性至外源性多糖途径。CP8 糖脂的长度和量在链生产中分析，其导致更长和更少量的该糖。为了增加 分子的量并从而增加蛋白糖基化的糖转移效率，利用特异性Wzz酶进行了 CP8糖长度的下调。

为了检测Wzz蛋白对在脂类上的CP8糖的大小和量的影响，由分离的 质粒（SEQ ID NO:19）进行了来自大肠杆菌wzz O7的Wzz的共表达。图 11K示出了该检测的结果。来自表达嵌合CP8簇SEQ ID NO:4和质粒运载， IPTG可诱导的wzz O7拷贝（SEQ ID NO:21，实线），或空质粒对照（虚 线）的大肠杆菌W3110ΔwaaLΔwecAwzzECAΔrmlB-wegG::cat的甲醇提取 物在Sep-PAK管上固相提取并用弱酸处理以从UndPP上水解糖。2AB标记的聚糖通过正相HPLC分析。CP8样品的碱处理显示95和115’之间多于85% 的区域示出了CP8的7RU或8RU聚合物，表明了乙酰化的广泛种类。这 些结果也表明嵌合CP8簇诱导：a）最丰富的聚糖的重复数目增强至从7到 8，和b）在色谱下由面积判断的荧光信号的更高的总密度。

碱处理证实了图11I和图11J中的缩短的聚糖的乙酰化，其表明重组多 糖的长度可以通过外源Wzz酶来调节。也可以通过O-抗原来源的Wzz酶 来调节荚膜多糖聚合物长度。进一步地，在嵌合簇前面不同的启动子存在 于质粒上时引起不同的表达水平和不同的聚合度。

实施例5:CP5和CP8聚糖的蛋白糖基化和产品的表征

测试了嵌合簇的不同变体的生物缀合产物。嵌合O11/CP5基因簇（SEQ  ID NO:2和3），其含有Ol1O-抗原簇代替的wbjA和wzy的金黄色葡萄球 菌特异性区域的不同变体，在宿主菌株大肠杆菌W3110ΔwaaL ΔwecAwzzE::cat中在PglB（SEQ ID NO:27？）和EPA（SEQ ID NO:13） 存在下表达。W3110ΔwaaLΔwecAwzzE::cat宿主细胞从pLAFR1质粒之外 的具有Ol1O-抗原簇的分离的质粒表达具有两个酰基化位点的EPA（来自 SEQ ID NO:13）和PglB（SEQ ID NO:27），其中wbjA和wzy基因用不同 的cap5基因集（和cat盒，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3）。

EPA蛋白表达为含有：a）N-端信号肽序列以输出至周质，b）两个细 菌N-糖基化共有序列加工纸蛋白序列中（SEQ ID NO:13），如WO 2009/104074的实施例10所阐述，以其整体并入本文作为参考，和c）六聚 组氨酸标签以用于纯化。细胞在5L锥形烧瓶中在LB培养基中生长。过夜 培养液稀释至OD_600nm=0.05。在OD_600nm在0.5左右时，PglB表达通过加入 1mM IPTG来诱导，EPA表达通过加入阿拉伯糖（0.2%终浓度）来诱导。 细胞生长4小时，重复培养，细胞生长另外的16小时。细胞通过离心来结 块；洗涤细胞病悬浮于0.2体积的蔗糖缓冲液中，周质蛋白上样于Ni²⁺亲和 色谱。不具有或具有金黄色葡萄球菌翻转酶基因cap5K（SEQ ID NO:2或3） 的EPA-CP5生物缀合物用0.5M咪唑洗脱，收集洗脱峰并通过SDS-PAGE 分析并用考马斯蓝染色或银染色（图12）。

图12示出了SDS-PAGE结果。左面板示出了考马斯染色，右面板显示 了银染色。中间的数字表示分子量标记的大小。泳道下的字母代表用于生 物缀合物生产的菌株中表达的嵌合簇中存在的基因。宿主菌株是大肠杆菌 W3110ΔwaaLΔwecAwzzE::cat。结果显示70kDa（电泳迁移率）的蛋白信 号最可能对应于未糖基化的EPA，和上方的条带阶梯（100-170kDa）。阶 梯可能对应于用CP5重组金黄色葡萄球菌聚糖糖基化的EPA蛋白。另外， 结果表明系统中包括翻转酶基因能增加糖蛋白产率（中间和右边泳道）。

在分别的分析中，CP5-EPA生物缀合物在W3110ΔwaaL ΔwecAwzzE::cat中通过从质粒pEXT21共表达嵌合CP5基因簇（SEQ ID NO: 3）、PglB（SEQ ID NO:27）和从分离的质粒表达EPA（含有两个糖基化 位点，SEQ ID NO:13）来生产。为了获得生物缀合物生产的更受控制的过 程，细胞在2L生物反应器中在37°C下生长至OD_600nm＝30，PglB和EPA 的表达通过加入1mM IPTG和0.2%阿拉伯糖来诱导。细胞在37°C下在限 氧条件下生长18小时。细胞通过离心来结块，洗涤并以OD_600nm=200重悬 于25%蔗糖缓冲液中，4°C下孵育30分钟后悬浮液结块，并通过渗透休克 来使细胞溶解。原生质体通过离心来结块，上清液中存在的周质蛋白上样 于Ni²⁺亲和色谱。糖基化的和未糖基化的EPA从亲和柱上用0.5M咪唑洗 脱，并上样于SourceQ阴离子交换柱。通过应用增加浓度的NaCl的梯度而 使糖基化的EPA从未糖基化EPA分离出来。

如图13A所示，纯化的糖基化EPA（CP5-EPA）通过SDS-PAGE分离 并通过考马斯（左侧泳道）染色或转移至消化纤维膜并用抗CP5抗体（中 间泳道）或抗EPA抗体（右侧泳道）来孵育。纯化的生物缀合物被EPA- 特异性抗体（右侧泳道）以及CP5-特异性多克隆抗血清（中间泳道）所识 别。箭头代表凝胶的位置，从该位置切下一小块并用于胰蛋白酶化和通过 MALDI-MS/MS的糖蛋白分析。图13B示出了N-糖苷键连接至O-乙酰化的 RU质量（m/z=2088([M+H]⁺)）的胰蛋白酶化的肽DNNNSTPTVISHR中的 糖基化位点发现的M/Z质量的MALDI-MS/MS。m/z=2088的MS/MS分析 示出了所标示的糖部分的部分片段。插注阐述了结合至源自图13A的纯化 CP5-EPA的胰蛋白酶化的多肽的RU结构。ManNAcA（HexNAcA，217Da） 和乙酰化FucNAc（dHexNAc(OAc)，229Da）的连续缺失支持了期望的聚 糖结构。图13C示出了N-糖苷键连接至O-乙酰化的RU质量（m/z=1165 ([M+H]⁺)）的胰蛋白酶化的肽DQNR中的糖基化位点发现的M/Z质量的 MALDI-MS/MS。m/z=1165的MS/MS分析示出了全部Y-离子片段离子系 列与CP5RU结构相一致。插图阐述了结合至源自图13A的纯化CP5-EPA 的胰蛋白酶化的的多肽的RU结构。示出了ManNAcA（HexNAcA，217Da）， 乙酰化FucNAc（dHexNAc(OAc)，229Da）和FucNAc（dHexNAc，187Da） 的连续缺失，确认了肽DQNR的期望的聚糖结构（m/z=532Da([M+H⁺])）。

在图13D中，大肠杆菌中的CP8生物缀合物利用生产CP5生物缀合物 相同的策略来生产。CP8-EPA生物缀合物在大肠杆菌中通过共表达嵌合 CP8基因簇（SEQ ID NO:4）、PglB（在pEXT21质粒中（SEQ ID NO:27）） 和含有两个糖基化位点的EPA（SEQ ID NO:13）来生产。细胞在生物反应 器以7L的起始体积在半确定培养基中生长，所述半确定培养基含有甘油， 蛋白胨和酵母提取物作为碳源。细胞在37°C下批次或脉冲批次模式生长至 OD_600nm为30，PglB和EPA的表达通过加入1mM IPTG和10%阿拉伯糖来 诱导。诱导之后，细胞进一步在补料批次模式下在限氧条件下培养15个小 时。细胞通过离心来结块；洗涤细胞并悬浮于0.2体积的蔗糖缓冲液中，结 块，并通过渗透休克来使细胞溶解。原生质体通过离心来结块，周质蛋白 上样于Ni²⁺亲和色谱。糖基化的和未糖基化的EPA从亲和柱上用0.5M咪 唑洗脱，并上样于SourceQ阴离子交换柱。通过应用增加浓度的NaCl的梯 度而使糖基化的EPA从未糖基化EPA分离出来。

如图13D所述，纯化的蛋白通过SDS-PAGE分离并通过考马斯染色（左 侧泳道）或转移至消化纤维膜并用抗CP8抗体（右侧泳道）或抗EPA抗体 （中间泳道）孵育。

测试了用于进一步改进糖基化系统的不同策略。在一种策略里，为了 减少生产系统中的质粒数目以降低其他抗生素负担并维持另外的质粒，pglB 的表达盒克隆进含有CP5（SEQ ID NO:17）或CP8（SEQ ID NO:18）的嵌 合簇的质粒中。表达盒由大肠杆菌O121基因组的galF和wbqA之间存在的 基因间区域（作为启动子序列），和其下游的pglB序列组成。表达盒克隆 进CP5和CP8嵌合簇紧接着的下游。我们测试了含有嵌合CP5簇（SEQ ID NO:13）和pglB（SEQ ID NO:27）在分离的质粒上或者相同质粒上（SEQ ID NO:17）的大肠杆菌W3110ΔwaaLΔwecAwzzECA::cat。另外，EPA（SEQ  ID NO:13）从在阿拉伯糖可诱导启动子控制下的质粒而表达。细胞在5L 锥形烧瓶中在LB培养基中在37°C下生长。过夜培养液稀释至 OD_600nm＝0.05。在OD_600nm在0.5左右时，PglB表达通过加入1mM IPTG来 诱导，EPA表达通过加入阿拉伯糖（0.2%终浓度）来诱导。细胞生长4小 时，重复培养，细胞生长另外的16小时。细胞通过离心来结块；洗涤细胞 病悬浮于0.2体积的蔗糖缓冲液中，结块，并通过渗透休克来使细胞溶解。 周质蛋白通过离心来结块，并且周质细胞上样于Ni²⁺亲和色谱。EPA-CP5 用0.5M咪唑洗脱，收集洗脱峰并通过SDS-PAGE和考马斯蓝分析。图13E 描述了SDS-PAGE结果。示出了含有3个（左侧泳道）或2个（右侧泳道） 用于糖缀合物生产的质粒的细胞。结果显示保持了CP5-EPA的糖脂和缀合 物生产。

该系统的进一步优化是将wzz（聚合长度调节因子）蛋白序列整合进用 于蛋白糖基化的质粒。通关过CP8-EPA生产系统来示例，wzz被整合进运 载嵌合CP8簇（SEQ ID NO:19）的质粒并在载体蛋白的表达质粒内的epa 基因下游（SEQ ID NO:20）。CP8-EPA生物缀合物在大肠杆菌W3110ΔwaaL ΔwecAwzzECAΔrmlB-wecG::cat中生产，该菌株含有两个质粒：一个质粒含 有除了嵌合CP8基因簇之外还有wzz O7基因和的一个拷贝和用于构成性表 达pglB基因（SEQ ID NO:19）的DNA表达盒；第二个质粒含有首先表达 和分泌含有两个糖基化位点的解毒EPA蛋白的基因，和其次wzz O7拷贝在 相同的启动子的控制之下（SEQ ID NO:20）。结果的菌株，含有上述质粒 的大肠杆菌W3110ΔwaaLΔwecAwzzECAΔrmlB-wecG::cat，在生物反应器 以7L的起始体积在半确定培养基中生长，所述半确定培养基含有甘油，蛋 白胨和酵母提取物作为碳源。细胞批次或脉冲批次模式生长至OD_600nm为 30，诱导PglB和EPA的表达。诱导之后，细胞进一步在补料批次模式下在 限氧条件下培养15个小时，并通过离心来收集。细胞通过离心来结块；洗 涤细胞并悬浮于0.2体积的蔗糖缓冲液中，结块，并通过渗透休克来使细胞 溶解。原生质体通过离心来结块，周质蛋白上样于Ni²⁺亲和色谱。糖基化 的和未糖基化的EPA从亲和柱上用0.5M咪唑洗脱糖缀合物CP8-EPA的形 成在图13F中示出，通过考马斯或蛋白质印迹，利用抗his和抗CP8抗血 清。图13F示出了纯化的蛋白经SDS-PAGE分离的结果以及通过考马斯染 色（左侧泳道），或者转移至硝化纤维膜并用抗组氨酸标签抗体（中间泳 道）或抗CP8抗体（右侧泳道）来标记。

CP5-EPA糖缀合物的表征通过多种分析方法来进一步优化。CovalX （Schlieren，瑞士）进行了纯化的CP5-EPA样品的高质量MALDI分析， 所述CP5-EPA样品利用图13A中表述的分析中所用的3质粒系统在W3110 ΔwaaLΔwecAwzzECA::cat中生产。图14A描述了高质量MALDI的结果。 A+和B+分别指向对应于未糖基化EPA和糖基化EPA的质量蛋白种类。寡 聚形式可以存在于高分子量中，而低MW区域的信号是污染物或降解产物。 图14A中示出的结果显示，上述制备的蛋白含有大部分是单体的蛋白族， 其比单独的EPA蛋白大4kDa，表示5.2重复单元的中等糖长度。这与通过 SDS-PAGE、考马斯亮兰染色和计数主要糖缀合物形式中的重复单元而分析 的制剂中的主要糖缀合物的5-7的糖长度相一致，

CP5-EPA通过大小排阻色谱（SEC-HPLC）来进一步表征。我们使用 了在图13A表述的分析中所使用的在W3110ΔwaaLΔwecAwzzECA::cat中 的3质粒系统。样品通过阴离子交换色谱来纯化以移除未糖基化EPA。分 析在Supelco TSK G2000SWXL柱上进行。显示了在280nm测量的UV痕 迹。粗实线来自分析3.25μg纯化的CP5-EPA，细线来自5μg纯化的未糖 基化EPA。显示出在11.5分钟洗脱的主要的、均质的峰，然而未糖基化EPA 在12.9分钟洗脱（图14B）。这两种分子的水动力学半径的计算结果为未 糖基化EPA是42kDa的代销，而糖基化EPA是166kDa。这表示糖基化 EPA显示为在溶液中延长的、单聚蛋白，与根据聚糖的线形结构的期望一 致。

从而我们的分析确认了由EPA蛋白和正确的、O-乙酰化聚糖结构组成 的CP5-EPA生物缀合物。基于该结果，也可以预言由EPA蛋白和正确的、 O-乙酰化的聚糖结构组成的CP8-EPA生物缀合物。

实施例6：金黄色葡萄球菌蛋白糖基化和产物表征

为了促进“体内”糖基化的易变性以产生糖缀合物疫苗候选，数种载体蛋 白被用作被CP5糖基化的底物。为了进一步增加生物缀合物疫苗针对金黄 色葡萄球菌的免疫应答，载体蛋白EPA替换为来自空肠弯曲菌的AcrA和 来自金黄色葡萄球菌的两种蛋白：Hla和ClfA。为了用作载体蛋白，Hlla 和ClfA通过插入细菌N-糖基化位点来修饰。该过程根据WO2006/119987 的描述来进行，产生4种版本的Hla H35L：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16和三种ClaA：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO:12。

为了Hla H35L位点130的糖基化，使用了包含两个表达质粒的大肠杆 菌细胞（W3110W3110ΔwaaLΔwecAwzzEΔrmlB-wecG）：一个质粒用于 Hla H35L的生产（SEQ ID NO:16），其中Hla H35L的表达在ParaBAD启 动子的控制之下，其中Hla H35L含有为了向周质分泌的N-端信号肽、一个 N-糖基化位点和一个六HIS-标签用于纯化，以及第二个用于表达CP5嵌合 簇和pglB（SEQ ID NO.:17）。该系统对应于提前优化的具有替换的蛋白载 体表达质粒的CP5-EPA的2质粒表达系统。细胞在12L生物反应器中在富 培养基中生长至OD_600nm=30，Hla的表达通过加入0.2%阿拉伯糖来诱导。 细胞通过离心来结块；洗涤细胞并悬浮在0.2体积的蔗糖缓冲液中，结块， 通过渗透休克来使细胞溶解。原生质体通过离心来结块，上清液中的周质 蛋白上样于Ni²⁺亲和色谱。糖基化的（CP5-Hla）和未糖基化的Hla从亲和 柱上被0.5M咪唑洗脱，并上样于阴离子交换色谱。蛋白用从0-0.7M NaCl 的线性梯度洗脱以从Hla中分离CP5-Hla。获得的蛋白通过SDS-PAGE分 离并通过考马斯染色或转移至硝化纤维膜并用抗His，抗Hla，或抗CP5抗 血清来探针探测，如图14C所示。图14C的结果通过考马斯（左侧泳道） 和蛋白质印迹利用抗His（左侧中间泳道）和抗Hla（中间泳道）和抗CP5 （右）抗血清显示了糖缀合物（CP5-Hla）的形成。

具有工程化的糖基化位点130的Hla H35L的鉴别通过凝胶内胰蛋白酶 化和MALDI-MS/MS来确认。

为了进一步显示载体蛋白对于CP5和CP8的糖基化是可替换的，空肠 弯曲菌AcrA蛋白被用作糖基化受体（参见图14D）。利用3质粒系统）（SEQ  ID NO:3、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:27），该缀合物的生产菌株是 W3110ΔwaaL，其具有CP5嵌合簇（SEQ ID NO:3），IPTG诱导的PglB 蛋白（SEQ ID NO:27）和在分离的质粒中在阿拉伯糖诱导之下的AcrA（SEQ  ID NO:15）。细胞在生物反应器中以7L的起始体积在半确定培养基中生长， 所述培养基含有甘油、蛋白胨和酵母提取物作为碳源。细胞以批次或脉冲 批次方式生长值OD_600nm为30，PglB和AcrA的表达通过添加1mM IPTG 和10%阿拉伯糖来诱导。诱导之后，细胞进一步在补料批次模式中在限氧 条件下培养一段15个小时的时间并通过离心来手机。细胞通过离心来结块； 洗涤细胞并悬浮在0.2体积的蔗糖缓冲液中，结块，通过渗透休克来使细胞 溶解。原生质体通过离心来结块，上清液中的周质蛋白上样于Ni²⁺亲和色 谱。CP5-AcrA糖蛋白从亲和柱上被0.5M咪唑洗脱。纯化的蛋白通过 SDS-PAGE分离并通过考马斯染色或转移至硝化纤维膜并用抗AcrA，或抗 CP5抗血清来探针探测，如图14D所示。

在ClfA中细菌N-糖基化位点的插入根据WO2006/119987的描述来进 行，产生了SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12。载体蛋白在 大肠杆菌细胞中由阿拉伯糖可诱导启动子来表达。基因设计为用于向周质 分泌的生产N-端信号肽，数个N-糖基化位点和六HIS标签用于纯化。纯化 从大肠杆菌细胞的周质提取物开始。

对于ClfA327的糖基化，利用了之前优化的CP5-EPA的优化表达系统。 利用2质粒系统（SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:11），含有CP5嵌合簇和 pglB（构成性表达盒）以及ClfA327表达质粒（在ParaBAD启动子的控制 之下）的大肠杆菌细胞（W3110ΔwecAwzzEΔrmlB-wecGΔwaaL）在1L锥形 烧瓶中在LB培养基中生长。过夜培养之后稀释至OD_600nm=0.05。在OD_600nm 在0.5附近，ClfA的表达通过添加阿拉伯糖（0.2%终浓度）来诱导。细胞 生长20小时。细胞通过离心来结块；洗涤细胞并悬浮于0.2体积的蔗糖缓 冲液中，结块，并通过渗透休克来使细胞溶解。原生质体通过离心来结块， 上清液中的周质蛋白上样于Ni²⁺亲和色谱。ClfA-CP5被0.5M咪唑洗脱，通 过SDS-PAGE分离并通过考马斯染色或转移至硝化纤维膜并用抗His，或 抗CP5抗血清来探针探测。图14E显示了用具有插入在蛋白的氨基酸位置 327附近的糖基化位点的ClfA变体（SEQ ID NO:11）获得的结果。其通过 考马斯染色和抗His蛋白质印迹而显示了ClfA的形成，以及通过利用抗CP5 抗血清显示了糖缀合物（CP5-ClfA）。

实施例7：CP5-EPA作为糖缀合物疫苗的活性

包含cap5K在内的CP5嵌合簇（SEQ ID NO:3）、PglB蛋白（SEQ ID  NO:27）和具有信号2糖基化位点在pEC415（SEQ ID NO:13）的W3110 ΔwecAwzzECA::cat细胞在1L锥形烧瓶中在LB培养基中生长。过夜培养之 后稀释至0.05。在OD_600nm在0.5附近，EPA和PglB的表达分别通过添加 阿拉伯糖（0.2%终浓度）和1mM IPTG来诱导。细胞生长20小时。细胞通 过离心来结块；洗涤细胞并悬浮于0.2体积的蔗糖缓冲液中，结块，并通过 渗透休克来使细胞溶解。原生质体通过离心来结块，上清液中的周质蛋白 上样于Ni²⁺亲和色谱。糖基化的和未糖基化的EPA从亲和柱上被0.5M咪 唑洗脱，并上样于SourceQ阴离子交换色谱。糖基化EPA用增加浓度的NaCl 的梯度从未糖基化EPA中分离。洗脱蛋白的量通过BCA分析来确定，并 且基于由SDS-PAGE通过考马斯染色获得的条带的大小，计算了糖的理论 质量。与蛋白的确定一起，在该制剂中评估了多糖抗原的量。评估的量化 通过高质量MALDI MS方法来确认（参见图14A）。

为了测量活动物中CP5-EPA的免疫原性，1μg纯化的糖缀合物在氢氧 化铝作为佐剂存在的情况下在第1天（首次注射）、第21天（第二次注射） 和第56（第三次注射）天通过IP（腹膜内）途径注射至小鼠内。35天和61 天后，也就是分别第二次和第三次注射的两周之后，IgG应答通过ELISA 利用聚-L-赖氨酸修饰的CP5包被来测量（Gray，B.M.1979.ELISA  methodology for polysaccharide antigens:protein coupling of polysaccharides  for adsorption to plastic tubes.J.Immunol.28:187-192）。来自CP5-生物缀合 物免疫的小鼠的血液被分析其针对CP5荚膜多糖的特异性IgG抗体。图15A 示出了小鼠中CP5-EPA引起的IgG滴度。ELISA平板用聚-L-赖氨酸修饰的 CP5包被，用CP5-EPA免疫两次（每个稀释的第二个小棒（空的））或三 次（每个稀释的第一个小棒（正向对角线））的小鼠中的IgG应答测量三 次。免疫前血清获得的信号作为对照通过每个稀释的第三个小棒（反向对 角线）来表示。小鼠IgG应答用碱性磷酸酶-缀合蛋白G来测量。如图15A 所示，CP5-EPA生物缀合物引起了6.4×10³的血清抗体滴度。图15A中示 出的结果显示，CP5-EPA在小鼠中引起CP5特异性抗体该实验显示了大肠 杆菌中生产的生物缀合物在小鼠中是免疫原性的。

相似的实验在兔中作为宿主生物来进行。CP5-EPA（15μg CP5）在弗 氏完全佐剂存在下在第1天皮内注射进兔中，并且在弗式不完全佐剂存在 下在第20天、第30天第和40天皮下注射。61天之后，通过ELISA利用 聚-L-赖氨酸修饰的CP5包被来测量IgG应答（Gray，B.M.1979.ELISA  methodology for polysaccharide antigens:protein coupling of polysaccharides  for adsorption to plastic tubes.J.Immunol.28:187-192）。图15B示出了兔中 CP5-EPA引起的IgG滴度。图15B中示出的结果显示，CP5-EPA在兔中引 起CP5特异性抗体。对CP5-EPA生物缀合物的免疫应答是每个稀释的第二 个小棒（正向对角线）。对照血清包括CP5-特异性吸附的血清以杀死金黄 色葡萄球菌（WC提取物，每个稀释的第一个小棒（点））和免疫前血清（每 个稀释的第三个小棒（空的））。来自用各种抗原免疫的兔的血清被分析 其对纯化的CP5的特异性抗体。平板用聚-L-赖氨酸修饰的CP5包被。用免 疫前血清获得的信号作为对照在每个稀释中以第三个小棒（反向对角线） 表示。兔IgG应答用碱性磷酸酶-缀合蛋白G测量三次。CP5-EPA生物缀合 物引起的滴度为1×10⁶，这比对照血清（通过用完全杀死的金黄色葡萄球菌 免疫然后用Wood46吸附并且胰蛋白酶化的等基因无荚膜突变体来制备， 从而抗血清呈现CP5-特异性）的滴度高4倍。该实验显示了生物缀合物能 够引起高滴度的CP5-特异性IgG应答。

实施例8：CP5抗体的功能活性

体外活性

如实施例7所述引起的兔多克隆抗血清通过蛋白A亲和柱来纯化以富 集IgG特异性抗体。来自用金黄色葡萄球菌生物缀合物CP5-EPA免疫的兔 的IgG用于在经典的体外调理吞噬杀死分析中测试其功能活性（Thakker， M.，J.-S.Park，V.Carey和J.C.Lee.1998.Staphylococcus aureus serotype5 capsular polysaccharide is antiphagocytic and enhances bacterial virulence in a  murine bacteremia model.Infect Immun66:5183-5189）。金黄色葡萄球菌在 哥伦比亚琼脂+2%NaCl上培养24小时。细菌悬浮于矿物基本培养基+1% BSA（MEM-BSA）中。PMN（多形核嗜中性粒细胞）从新鲜人血中分离， 洗涤，计数，并悬浮于MEM-BSA中。从用金黄色葡萄球菌CP5-EPA免疫 的兔纯化的IgG制剂或者作为对照从用Shigella Ol-EPA免疫的兔纯化的 IgG制剂以MEM-BSA中制备的10倍稀释系列添加于分析物中，其中所述 Shigella Ol-EPA如WO2009/104074中所述被纯化。豚鼠血清（Pel-Freez） 用作C’源。每个分析样品（0.5ml总体积）含有约5×10⁶PMN、1×10⁶CFU 金黄色葡萄球菌、0.5%-1%豚鼠血清、和不同浓度的IgG，从140μg/ml到 1μg/ml。对照样品含有1）用C’和PMN孵育的金黄色葡萄球菌，但是没有 抗体；2）用IgG和C’孵育的金黄色葡萄球菌，但是没有PMN；和3）只 有金黄色葡萄球菌。样品在37°C下颠倒旋转（12rpm）2小时。样品稀释 液在无菌水中涡旋振荡，细菌杀死通过将稀释的样品置于双倍TSA来评价。 杀死百分比定义为2小时后相比于开始时CFU/ml的减少。

在实验的第一个系列，测试了杀死甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌 （MSSA）菌株Reynolds，CP5分离物的原型的调理吞噬，结果显示于图 16A中。在兔中引起的CP5-EPA的抗体的调理活性针对金黄色葡萄球菌血 清型5菌株Reynolds来测试。CP5-EPA抗体在低至1.4μg/ml的浓度是调理 性的，然而O1-EPA抗体在140μg/ml显示了几乎没有调理活性。针对金黄 色葡萄球菌全细胞提取物（获自Brigham and Women's Hospital医学部的J.C. Lee处，哈佛医学院，波士顿，MA，USA）引起的阳性对照血清显示了与 抗CP5-EPA血清（WC抗血清1%）相似的活性。

如图16A所示，当用CP5-EPA的抗体和具有补体活性的1%豚鼠血清 孵育时，65-75%之间的金黄色葡萄球菌Reynolds被PMN杀死。在分析中 抗血清以终浓度1%来使用，在这些条件下89%的金黄色葡萄球菌培菌液被 杀死。当金黄色葡萄球菌用C’单独（1%豚鼠血清）或抗体和C’而没有PMN 调理时，几乎没有杀死被观察到。显示的结果是2-5次试验的平均值。所有 图表的样品包括豚鼠血清C’，并且在C’不存在下没有观察到杀死。单独的 抗体或单独的补体均不是调理性的，该特征是囊膜细菌病原体特有的。相 反，由对照疫苗（Shigella Ol抗原偶联至EPA）引起的抗体不显示调理活 性，即使在C’存在下。作为该分析中的阳性对照，我们也测试了CP5-特异 性兔抗血清（获自Brigham and Women's Hospital医学部的C.Lee处，哈佛 医学院，波士顿，MA，USA）。这些结果显示CP5-EPA生物缀合物引起 的抗体显示了针对囊膜金黄色葡萄球菌的调理活性，相比于具有已证明的 调理活性的CP5抗体（Thakker，M.，J.-S.Park，V.Carey和J.C.Lee.1998. Staphylococcus aureus serotype5capsular polysaccharide is antiphagocytic and  enhances bacterial virulence in a murine bacteremia model.Infect Immun 66:5183-5189）。

测试了CP5-EPA抗体针对MRSA菌株USA100的CP5-EPA的调理活 性。图16B示出了测试针对金黄色葡萄球菌菌株USA100，一种CP5+分离 物的IgG和C’的调理活性的结果，也称为NRS382。显示的数据是2-5次试 验的平均值。所有图表样品包括豚鼠血清C’，在C’不存在下没有观察到死 亡。如图16B所示，约60%的USA100培菌液被0.5%豚鼠补体孵育的PMN 杀死，其中CP5-EPA IgG的浓度从100到1μg/ml。在PMN不存在或IgG 从分析中省略时观察到最少的杀死。当Ol-EPA缀合物疫苗引起的IgG被加 入PMN+C’时没有杀死出现（细菌在该样品中繁殖）。当金黄色葡萄球菌 用C’单独或者抗体和C’而没有PMN调理时观察到非常少的杀死。因而， CP5-EPA在从100到1μg/ml范围的浓度下是调理性的，然而O1-EPA抗体 在100μg/ml显示出非常少的调理活性。该结果显示了CP5-EPA抗体展现 了针对MSSA和MRSA菌株两者的调理活性。

体内活性

为了确定生物缀合物CP5-EPA疫苗引起的IgG的调理活性是否预示着 在葡萄球菌感染的小鼠模型中的保护，进行了被动免疫实验。在起始的研 究中，Swiss-Webster雄性小鼠（6周龄）IV（尾静脉）注射1.4-2mg的IgG， 所述IgG来自用CP5-EPA或Shigella Ol-EPA免疫的兔。24小时后，小鼠 通过腹膜内（IP）途径用约3.6×10⁷CFU的金黄色葡萄球菌Reynolds激发。 菌血症水平在激发2小时之后测量以评价抗体介导的菌血症的清除。培养 检测的更低限制是5CFU/ml血液。图17A显示了获得的菌血症水平。每个 点表示定量血液培养，通过细菌接种2小时之后个体小鼠尾静脉穿刺而进 行。水平线代表CFU/ml中值。空心圆圈是来自获得抗CP5-EPA抗体的小 鼠的血液样品，黑色填充的圆圈是来自获得对照抗体制剂的动物的样品， 所述对照抗体制剂由EPA缀合至不同的聚糖而引起（痢疾志贺菌（S. dysenteriae）Ol）。图17A的结果显示，相比于给予O1-特异性抗体的小鼠， 给予CP5抗体的小鼠显示出菌血症水平显著的（Mann-Whitney检验P= 0.0006）降低。事实上，用CP5-EPA被动免疫的小鼠对比给予O1-EPA IgG 的小鼠CFU/ml血液降低98%。

在后继的被动免疫试验中，小鼠经IP以更低接种量（约5.5×10⁶CFU/ 小鼠）的金黄色葡萄球菌Reynolds激发。CP5-EPA抗体的被动免疫用经IP 以5-6×10⁶CFU金黄色葡萄球菌Reynolds激发的小鼠进行测试。小鼠在细 菌激发之前24小时时静脉内（IV）注射2mg的CP5-EPA IgG或Ol-EPA IgG。 图17B显示了获得的菌血症水平。每个点表示定量血液培养，通过细菌接 种2小时之后个体小鼠尾静脉穿刺来进行。水平线代表CFU/ml中值。空圈 是来自获得抗CP5-EPA抗体的小鼠的血液样品，黑色填充的圆圈是来自获 得对照抗体制剂的动物的样品，所述对照抗体制剂由EPA缀合至不同的聚 糖而引起（痢疾志贺菌Ol）。如图17B所显示，给予2mg CP5EPAIgG的 小鼠具有菌血症水平显著的（Mann-Whitney检验P=0.0001）降低，相比 于给予2mg O1-EPA IgG的小鼠。事实上，7只用CP5-EPA抗体被动免疫 的小鼠中的6只具有无菌培养物（检测的更低限制6-30CFU/ml血液，依赖 于从每只小鼠收集和取用的血液体积）。由于CP5抗体而引起的菌血症水 平的降低为98%，相比于给予Ol-EPA IgG的对照小鼠。

为了确定是否可以通过更低水平的IgG来授予对菌血症的保护，进行 了后继的实验，其中小鼠通过IV途径用300μgCP5-EPA或Ol-EPA IgG被 动免疫。24小时之后，小鼠经IP灌输6×10⁶CFU金黄色葡萄球菌Reynolds。 培养物的检测的更低限制是13-67CFU/ml血液。图17B显示了获得的菌血 症水平。每个点表示定量血液培养，通过细菌接种2小时之后个体小鼠尾 静脉穿刺而进行。水平线代表CFU/ml中值。空心圆圈是来自获得抗 CP5-EPA抗体的小鼠的血液样品，黑色填充的圆圈是来自获得对照抗体制 剂的动物的样品，所述对照抗体制剂由EPA缀合至不同的聚糖而引起（痢 疾志贺菌Ol）。与图17B相同，图17C的结果显示CP5抗体介导的针对菌 血症的保护以这让更低抗体剂量也能达到。由CP5生物缀合物疫苗引起的 抗体获得的菌血症水平降低98%，9只小鼠中的8只具有无菌血液培养物， 相比于给予Shigella Ol-EPA抗体的8只小鼠中的0只。

实施例9：小鼠中的自动免疫

为了显示生物缀合物CP5-EPA小鼠疫苗介导的针对与被动免疫分析中 相同的细菌激发的保护，进行了主动免疫研究。

在大肠杆菌W3110ΔwaaLΔwecAwzzE::cat中通过从质粒pEXT21共表 达嵌合CP5基因簇（SEQ ID NO:3）、PglB（SEQ ID NO:27）和从分离的 质粒表达EPA（含有两个糖基化位点，SEQ ID NO:13）。细胞在生物反应 器中以7L的初始体积在半确定培养基中生长，所述半确定培养基含有甘油、 蛋白胨和酵母提取物作为碳源。细胞以批次或脉冲批次模式生长至OD_600nm为30，PglB和EPA的表达通过加入1mM IPTG和10%阿拉伯糖来诱导。 诱导之后，细胞在限氧条件下以补料批次模式进一步培养一段15小时的时 间并通过离心来收集。洗涤细胞并重悬于25%蔗糖缓冲液至OD_600nm=200， 结块，通过渗透休克来使细胞溶解。原生质体通过离心来结块，周质蛋白 上样于Ni²⁺亲和色谱。糖基化的和未糖基化的EPA从亲和柱上被0.5M咪 唑洗脱并上样于SourceQ阴离子交换柱。糖基化的通过应用增加浓度的 NaCl的梯度而从未糖基化EPA中分离。

CP5-EPA被确定用作缀合物疫苗以保护免受CP5金黄色葡萄球菌菌 株。为了测试这样的主动免疫是否有功能，我们用三种不同剂量的CP5-EPA 免疫了不同组的雌性Swiss Webster小鼠并用菌血症模型分析免疫。三种剂 量在第0、14和28天皮下注射。小鼠在第42天用金黄色葡萄球菌菌株JL278 腹膜内激发，如图18所示。5个组的小鼠用三种不同剂量的CP5-EPA免疫， 在x轴的下方标注（点圈；空心圆圈；和后斜线圈）。两个对照组接受单 独的佐剂（前斜线圈）或PBS（填充黑色的圈）。每个点代表来自单独小 鼠的血液样品。最低剂量的疫苗（0.2μg）在组的所有小鼠中诱导了保护。 激发2小时之后血液样品通过ELISA利用聚-L-赖氨酸修饰的CP5包被 （Gray等人(1979)）来分析cfu形成和抗CP5抗体。在CP5-EPA免疫的所 有组中，观察到预想的血液中cfu的降低。然而，仅在接受最低剂量的疫苗 的组中，在所有5只小鼠中均有对菌血症的常规保护。抗CP5抗体的血液 分析导致不同小鼠组中保护和平均ELISA滴度的正相关性。图18示出的结 果表明在免疫的小鼠中抗体诱导对菌血症的保护。

这些研究表明CP5-EPA生物缀合物疫苗诱导抗体，其通过PMN调理 金黄色葡萄球菌被吞噬杀死，并且在被动和自动免疫研究中保护小鼠免于 菌血症。这些数据提供了强有力的证据，即本发明的生物缀合物将保护免 受多种金黄色葡萄球菌菌株引起的疾病。

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