利用银表面分子印迹聚合物进行表面增强拉曼散射光谱检测的方法

摘要

利用银表面分子印迹聚合物进行表面增强拉曼散射光谱检测的方法，涉及利用分子印迹聚合物进行表面增强拉曼散射光谱检测的方法。本发明是要解决现有的方法都需要将分子印迹聚合物和银胶等其他物质混合或将分子印迹聚合物涂覆在银等其他金属膜上，方法复杂并且还存在分子印迹物与金属膜的结合不良而影响检测效果的问题。方法：一、制备500nm-5μm银粒子；二、对银粒子表面进行改性；三、制备目标分子与功能单体的预组装溶液；四、制备银分子印迹聚合物的预聚合溶液；五、制备银核分子印迹膜壳的粒子；六、制备银表面分子印迹聚合物；七、进行拉曼检测。本发明应用于临床药物分析、定量分析、痕量分析和单分子水平等领域。

说明书

技术领域

本发明涉及利用分子印迹聚合物进行表面增强拉曼散射光谱检测的方法。

背景技术

分子印迹聚合物具有亲合性和选择性高，抗恶劣环境的能力强，稳定性高和使用寿命 长等优点，因此，它在许多领域如色谱分析中对映异构体分离、临床药物分析、化学仿生 传感器、模拟酶催化、膜分离和固相萃取等领域都展现了良好的应用前景。表面增强拉曼 散射(SERS)技术增强了基底与分子间的能量转移，避免了荧光背景的干扰，增大了样 品的散射面积，从而增强了样品的信号，使拉曼散射光谱检测的精度产生了飞跃。由此可 见，SERS在单分子检测方面有着巨大的应用前景。

将分子印迹技术和表面增强拉曼散射技术相结合，可以提供一种具有高灵敏度、高选 择性、稳定性好的检测技术，但现有的方法都需要将分子印迹聚合物和银胶等其他物质混 合将分子印迹聚合物涂覆在银等其他金属膜上，才可具有表面增强拉曼效应，方法复杂并 且还存在分子印迹物与金属膜的结合不良而影响检测效果的现象，并且提高对痕量物质的 检测限。

发明内容

本发明是要解决现有的方法都需要将分子印迹聚合物和银胶等其他物质混合或将分 子印迹聚合物涂覆在银等其他金属膜上，方法复杂并且还存在分子印迹物与金属膜的结合 不良而影响检测效果的问题，提供利用银表面分子印迹聚合物进行表面增强拉曼散射光谱 检测的方法。

本发明利用银表面分子印迹聚合物进行表面增强拉曼散射光谱检测的方法，按以下步 骤进行：一、制备500nm-5μm银粒子：a、配制5～10mL浓度为1mol/L的AgNO₃溶液， 20～35mL浓度为1mol/L的抗坏血酸溶液，1～5mL浓度为0.35mol/L的柠檬酸溶液b、将 1～2g的聚乙烯吡咯烷酮溶于3～8mL的蒸馏水中，得到聚乙烯吡咯烷酮溶液；c、将容器 放入冰水浴中，向容器中加入60～100mL蒸馏水、步骤a配制的AgNO₃溶液、步骤a配 制的柠檬酸溶液和步骤b的聚乙烯吡咯烷酮溶液混合，然后在搅拌下，加入步骤a配制的 抗坏血酸溶液，反应15～30min，进行离心，取固相物，用蒸馏水离心洗涤2～4次，再用 无水乙醇离心洗涤2～4次，然后进行干燥，即得500nm-5μm银粒子；

二、对银粒子表面进行改性：将100～150mL的混合溶液A、1～2g步骤一制备的银粒 子和8～12mL的双键硅烷试剂混合，在温度为40～90℃，氮气氛围保护下，搅拌20～28h， 然后无水乙醇洗涤2～4次，再干燥即可得到表面硅烷化的银粒子；其中混合溶液A是由 乙醇和水按体积比为(3～5)∶1混合而成；

三、制备目标分子与功能单体的预组装溶液：将目标分子溶于三氯甲烷溶液中，得到 浓度为0.005～0.007mol/L的目标分子三氯甲烷溶液，然后加入功能单体，搅拌30分钟， 得到目标分子与功能单体的预组装溶液，其中目标分子与功能单体的摩尔比为1∶(1.3～6)；

四、制备银分子印迹聚合物的预聚合溶液：向步骤二制得的表面硅烷化的银粒子中加 入交联剂，然后再加入步骤三制备的目标分子与功能单体的预组装溶液，超声20～40min， 得到银分子印迹聚合物的预聚合溶液；其中表面硅烷化的银粒子和交联剂的质量体积比为 1g∶(15～30)mL，交联剂与功能单体的摩尔比是(1.5～6)∶1；

五、制备银核分子印迹膜壳的粒子：向步骤四制备的银分子印迹聚合物的预聚合溶液 中加入含有引发剂的三氯甲烷溶液，通入N₂，搅拌，在温度为40～90℃时反应24h，得到 银核分子印迹膜壳的粒子；其中交联剂和引发剂的质量比为1∶(0.01～0.05)，三氯甲烷和 交联剂的体积比为(20～40)∶1；

六、制备银表面分子印迹聚合物：d、将银核分子印迹膜壳的粒子加入至甲醇溶液中 洗涤1次，然后蒸馏水洗涤4～6次；e、步骤d重复2～4次；f、放入70～160mL的混合溶 液B中，振荡2～4h后更换混合溶液B；g、重复步骤f操作直至检测混合溶液B中无目 标分子为止，然后进行干燥，得到银表面分子印迹聚合物；其中混合溶液B为乙酸和甲 醇按体积比为1∶(4～9)混合而成；

七、配制浓度为10^-2～10^-15mol/L的目标分子有机溶液，然后向1～8ml的目标分子有 机溶液中加入0.01～0.15g银表面分子印迹聚合物，振荡吸附6～24h，进行拉曼检测，得到 增强后的拉曼谱图，即完成利用银表面分子印迹聚合物进行表面增强拉曼散射光谱检测的 方法。

本发明是一种具有高灵敏度、高选择性、稳定性好的检测技术，最低检测限可以达到 10^-15mol/L。本发明利用分子印迹技术对不同的待测分子进行印迹，由于分子印迹聚合物 中所具有的功能单体的特定基团可以和待测分子之间发生一定的相互作用，再加上分子印 迹聚合物中所存有的孔洞与待印迹的待测分子的大小匹配，导致了该分子印迹聚合物对待 测分有很高的提取效率。将银做为核，分子印迹聚合物做为壳，改变了传统的将分子印迹 聚合物和银胶等其他物质混合，才可具有表面增强拉曼效应的方法，从而大大提高了使用 的便捷性，也改变了将分子印迹聚合物涂覆在银等其他金属膜上，才具有表面增强拉曼效 应的方法，从而避免了分子印迹物与金属膜的结合不良的现象。

附图说明

图1为试验步骤一制备的银粒子的扫描电子显微镜图；

图2为试验步骤一制备的银粒子的透射电子显微镜图；

图3为试验步骤六制备的银表面分子印迹聚合物的扫描电子显微镜图；

图4为试验步骤六制备的银表面分子印迹聚合物的透射电子显微镜图；

图5为试验步骤六制备的银表面分子印迹聚合物的拉曼谱图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式利用银表面分子印迹聚合物进行表面增强拉曼散射光谱 检测的方法，按以下步骤进行：一、制备500nm-5μm银粒子：a、配制5～10mL浓度为 1mol/L的AgNO₃溶液，20～35mL浓度为1mol/L的抗坏血酸溶液，1～5mL浓度为0.35mol/L 的柠檬酸b、将1～2g的聚乙烯吡咯烷酮溶于3～8mL的蒸馏水中，得到聚乙烯吡咯烷酮溶 液；c、将容器放入冰水浴中，向容器中加入60～100mL蒸馏水、步骤a配制的AgNO₃溶 液、步骤a配制的柠檬酸和步骤b的聚乙烯吡咯烷酮溶液混合，然后在搅拌下，加入步骤 a配制的抗坏血酸溶液，反应15～30min，进行离心，取固相物，用蒸馏水离心洗涤2～4 次，再用无水乙醇离心洗涤2～4次，然后进行干燥，即得500nm-5μm银粒子；

二、对银粒子表面进行改性：将100～150mL的混合溶液A、1～2g步骤一制备的银粒 子和8～12mL的双键硅烷试剂混合，在氮气氛围保护下，温度为40～90℃，搅拌20～28h， 然后无水乙醇洗涤2～4次，再干燥即可得到表面硅烷化的银粒子；其中混合溶液A是由 乙醇和水按体积比为(3～5)∶1混合而成；

三、制备目标分子与功能单体的预组装溶液：将目标分子溶于三氯甲烷溶液中，得到 浓度为0.005～0.007mol/L的目标分子三氯甲烷溶液，然后加入功能单体，搅拌30分钟， 得到目标分子与功能单体的预组装溶液，其中目标分子与功能单体的摩尔比为1∶(1.3～6)；

四、制备银分子印迹聚合物的预聚合溶液：向步骤二制得的表面硅烷化的银粒子中加 入交联剂，然后再加入步骤三制备的目标分子与功能单体的预组装溶液，超声20～40min， 得到银分子印迹聚合物的预聚合溶液；其中表面硅烷化的银粒子和交联剂的质量体积比为 1g∶(15～30)mL，交联剂与功能单体的摩尔比是(1.5～6)∶1；

五、制备银核分子印迹膜壳的粒子：向步骤四制备的银分子印迹聚合物的预聚合溶液 中加入含有引发剂的三氯甲烷溶液，通入N₂，搅拌，在温度为40～90℃时反应24h，得到 银核分子印迹膜壳的粒子；其中交联剂和引发剂的质量比为1∶(0.01～0.05)，三氯甲烷和 交联剂的体积比为(20～40)∶1；

六、制备银表面分子印迹聚合物：d、将银核分子印迹膜壳的粒子加入至甲醇溶液中 洗涤1次，然后蒸馏水洗涤4～6次；e、步骤d重复2～4次；f、放入70～160mL的混合溶 液B中，振荡2～4h后更换混合溶液B；g、重复步骤f操作直至检测混合溶液B中无目 标分子为止，然后进行干燥，得到银表面分子印迹聚合物；其中混合溶液B为乙酸和甲 醇按体积比为1∶(4～9)混合而成；

七、配制浓度为10^-2～10^-15mol/L的目标分子有机溶液，然后向1～8ml的目标分子有 机溶液中加入0.01～0.15g银表面分子印迹聚合物，振荡吸附6～24h，进行拉曼检测，得到 增强后的拉曼谱图，即完成利用银表面分子印迹聚合物进行表面增强拉曼散射光谱检测的 方法。

本实施方式是一种具有高灵敏度、高选择性、稳定性好的检测技术，检测限可以达到 10^-15mol/L。本实施方式利用分子印迹技术对不同的待测分子进行印迹，由于分子印迹聚 合物中所具有的功能单体的特定基团可以和待测分子之间发生一定的相互作用，再加上分 子印迹聚合物中所存有的孔洞与待印迹的待测分子的大小匹配，导致了改分子印迹聚合物 对待测分有很高的提取效率。将银做为核，分子印迹聚合物做为壳，改变了传统的将分子 印迹聚合物和银胶等其他物质混合，才可具有表面增强拉曼效应的方法，从而大大提高了 使用的便捷性，也改变了将分子印迹聚合物涂覆在银等其他金属膜上，才具有表面增强拉 曼效应的方法，从而避免了分子印迹物与金属膜的结合不良的现象。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤c中的干燥为40℃ 真空干燥箱中干燥12h。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二中双键硅烷试剂为 甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三中的目标分子为罗 丹明6G、苯甲酸、苯硫酚，4-巯基吡啶，巯基乙胺或吡啶。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三中的功能单体为 a-甲基丙烯酸、4-乙烯吡啶或4-乙烯苯基硼酸。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤四中的交 联剂为二乙烯基苯或二甲基苯烯酸乙二酯。其它与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤五中的引 发剂为偶氮二异丁腈。其它与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤五中搅拌 的速度350r/min。其它与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤六中用紫外 分光光度计检测混合溶液中有无目标分子。其它与具体实施方式一至八之一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤七中配制 浓度为10^-2～10^-15mol/L的目标分子有机溶液。其它与具体实施方式一至九之一相同。

通过以下试验验证本发明的有益效果：

试验：利用银表面分子印迹聚合物进行表面增强拉曼散射光谱检测的方法，按以下步 骤进行：一、制备银粒子：a、配制8mL浓度为1mol/L的AgNO₃溶液，30mL浓度为1mol/L 的抗坏血酸溶液，2mL浓度为0.35mol/L的柠檬酸b、将1.35g的聚乙烯吡咯烷酮溶于 5mL的蒸馏水中，得到聚乙烯吡咯烷酮溶液；c、将容器放入冰水浴中，向容器中加入80mL 蒸馏水、步骤a配制的AgNO₃溶液、步骤a配制的柠檬酸溶液和步骤b的聚乙烯吡咯烷 酮溶液混合，然后在搅拌下，加入步骤a配制的抗坏血酸溶液，反应20min，进行离心， 取固相物，用蒸馏水离心洗涤3次，再用无水乙醇离心洗涤3次，然后40℃真空干燥箱 中干燥12h，即得银粒子；

二、对银粒子表面进行改性：将140mL的混合溶液A、1.75g步骤一制备的银粒子 和10mL的甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷混合，在温度为60℃，氮气氛围保护下， 搅拌24h，然后无水乙醇洗涤3次，再干燥即可得到表面硅烷化的银粒子；其中混合溶液 A是由乙醇和水按体积比为4∶1混合而成；

三、制备目标分子与功能单体的预组装溶液：是将1mmol的分子印迹溶于150mL的 三氯甲烷溶液中，然后加4mmol的a-甲基丙烯酸混合，搅拌30min，进行对巯基苯甲酸 和功能单体的预组装，得到预组装溶液。

四、制备银分子印迹聚合物的预聚合溶液：向步骤二制得的表面硅烷化的银粒子中加 入20mmol的二乙烯基苯，然后再加入步骤三制得的预组装溶液，超声30min得到预聚合 溶液。

五、制备银核分子印迹膜壳的粒子：向步骤四制备的银分子印迹聚合物的预聚合溶液 中加入含有0.090g偶氮二异丁腈的三氯甲烷溶液，通入N₂，搅拌，在温度为90℃时反 应24h，得到银核分子印迹膜壳的粒子；

六、制备银表面分子印迹聚合物：d、将银核分子印迹膜壳的粒子加入至甲醇溶液中 洗涤1次，然后蒸馏水洗涤5次；e、步骤d重复3次；f、放入100mL的混合溶液B中， 振荡3h后更换混合溶液B；g、重复步骤f操作直至检测混合溶液B中无目标分子为止， 然后进行干燥，得到银表面分子印迹聚合物；其中混合溶液B为乙酸和甲醇按体积比为 1∶4混合而成；

七、配制浓度为10^-3、10^-9、10^-12、10^-15mol/L的对巯基苯甲酸乙醇溶液，然后向5ml 的对巯基苯甲酸乙醇溶液中加入0.01g银表面分子印迹聚合物，振荡吸附8h，进行拉曼检 测，得到增强后的拉曼谱图(图5)，即完成利用银表面分子印迹聚合物进行表面增强拉 曼散射光谱检测的方法。

对本试验步骤一制备的银粒子进行电子扫描电镜，结果如图1所示，由图1可知： Ag颗粒为规则的球形结构且分布均匀，平均粒径为2.5μm，Ag微球表面粗糙且凹凸不 平，每个Ag微球都是由大量的Ag纳米自组装。对银粒子进行透射电镜扫描，结果如图 2所示，由图2可知：通过微球边缘的TEM表征更进一步证明了SEM的结论。

对本试验步骤六制备的银表面分子印迹聚合物进行电子扫描电镜，结果如图3所示， 由图4可知：Ag粒子表面发生了明显的变化，通过表面分子印迹法在Ag粒子表面接枝 了MIP层，得到了尺寸均匀、分散均匀的核-壳式Ag-MIP微球。对银粒子进行透射电镜 扫描，结果如图2所示，由图2可知：更清晰的看到Ag微球表面包覆一层MIP薄膜，透 光率低的黑色部分为Ag，在其表面包覆的MIP薄膜厚度约为40nm。

本试验所用的拉曼光谱仪是共聚焦拉曼光谱仪，检测采用的激发光源波长范围为 400-1000纳米。由图5可知，随着对巯基苯甲酸溶液的浓度下降，吸附了对巯基苯甲酸 的银-分子印迹聚合物表面增强拉曼光谱的轻度也随之减弱。从图5中可以看出这种检测 方法的最低检测限可以达到10^-15mol/L。