一种杀伤慢性粒细胞白血病细胞的小分子多肽

摘要

本发明公开了一种杀伤慢性粒细胞白血病细胞的小分子多肽，其特征在于：由OD2和S5连接构成SAH-OD2。本发明一种杀伤慢性粒细胞白血病细胞的小分子多肽，具有制备简单，药物使用浓度低，稳定性高，OD2不需要连接转导肽CTP就能进入细胞，能有效的抑制CML细胞的增殖，促进CML细胞的凋亡，对于治疗CML的研究及药物的开发具有很大的研究价值。

说明书

技术领域

本发明属于医学基础研究领域，具体的说，涉及一种杀伤慢性粒细胞白血 病细胞的小分子多肽。

背景技术

慢性粒细胞白血病是一种影响血液及骨髓的恶性肿瘤，它的特点是产生大 量不成熟的白细胞，这些白细胞在骨髓内聚集，抑制骨髓的正常造血；并且能 够通过血液在全身扩散，导致病人出现贫血、容易出血、感染及器官浸润等。 而由t(9；22)(q34；q11)形成的Bcr-Abl融合蛋白是慢性粒细胞白血病(CML) 的主要特征，其异常激活Abl蛋白激酶会引起血细胞恶性增殖、凋亡减少等一 系列变化。STI571可以特异性抑制Abl激酶，作为CML的经典治疗药物，广泛 应用于临床，大多数病人的病情得到控制，但当Abl激酶活化位点发生突变后 就会产生STI571耐药而导致复发。

研究表明Abl激酶的活化需要Bcr_1-72单体形成反向平行的同源二聚体再形 成同源四聚体。从晶体结构的研究中可知Bcr_1-72单体主要由a1螺旋(5-15位氨 基酸)，a2螺旋(28-67位氨基酸)及a1、a2之间可变的环状区(16-27位氨基 酸)组成。其中Bcr_30-63是最关键的部位。

因此，在前期设计CTP-OD-HA融合蛋白的基础上，将OD分成两个部分， 一部分为30-63位氨基酸，定义为OD2，其余部分1-29位和64-72位拼接在一 起定义为OD1，并将其分别与一种新近报道的能携带蛋白类大分子穿越细胞膜 并定位于细胞浆中的新型转导肽CTP连接。使用pCOLD-TF-DNA原核表达载 体，可以高效表达可溶性的外源性融合蛋白，作为携带胞浆蛋白治疗肽的穿膜 系统，可以使CTP-OD1-HA和CTP-OD2-HA融合蛋白定位在胞浆，与细胞中的 Bcr-Abl融合蛋白的单体形成反向平行的异源二聚体后再形成异源聚体而抑制 Bcr-Abl激酶的活性使细胞调亡增加，增殖减少。但是，其中TF-CTP-OD2-HA 在使用时需要的浓度高(60μmol/L)，易降解，因此产生的生物学效应持续时 间短。

现有技术的缺点：现有的治疗CML的药物中，OD2需要连接转导肽CTP 才能进入细胞，而且使用药物的浓度大，稳定性低，容易产生耐药性，导致疾 病的复发。

发明内容

为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种不连接转导肽CTP就能 使OD2穿过细胞膜进入细胞，可以抵抗蛋白酶的降解、小分子量较小的稳定性 高的杀伤慢性粒细胞白血病细胞的小分子多肽。

本发明目的是这样实现的：

一种杀伤慢性粒细胞白血病细胞的小分子多肽的课题思路为：

研究表明，OD2的结构是α-螺旋，BCR_1-72晶体结构中各氨基酸对于其自 身螺旋结构稳定性的作用中发现，第38，52，54，57位氨基酸是螺旋结构中最 重要，其突变后将不能维持自身螺旋结构，而第41，45，60位氨基酸被其它氨 基替换后会使其螺旋结构更加紧密，而第47和51位氨基酸的改变对螺旋结构 不影响，(请参见：Christina M.Taylor and Amy E.Keating.Orientation and  Oligomerization Specificity of the Bcr Coiled-Coil Oligomerization Domain. Biochemistry.2005,44(49):16246–16256.)因此将OD2结构的第30-63位氨基 酸缩减为第34-60位，有利于通过化学修饰的方法增加OD2结构的稳定性，而 在目前存在的多种化学修饰方法中，以烯烃键的修饰增加a螺旋的稳定性并使 其本身具备穿膜能力而最为显著。

本课题组在OD2本身结构是a螺旋的基础上，在a螺旋肽的i，i+4位插入 S型的含戊烯支链的甲基化的a，a-二取代甘氨酸，通过烯烃闭环复分解反应(ring  close metatiesis，RCM)将两个非天然氨基酸侧链戊烯基的碳原子连接形成C=C 双键，就像是钉书钉(staple)一样稳定其螺旋结构，使OD2顺利穿过细胞膜进 入细胞而不被蛋白酶降解，与Bcr-Abl寡聚化区域形成异源二聚体，从而抑制其 同源二聚体的形成；异源二聚体抑制其自身四聚体化，进而抑制Bcr-Abl激酶的 活化；Bcr-Abl激酶被抑制后导致细胞凋亡增加，增殖减少，如图1所示。

根据以上思路按以下步骤进行了实际操作：

1、化学烯烃修饰OD2结构

根据OD2的结构，设计并合成含有戊烯支链的甲基化的a，a-二取代甘氨 酸，命名为S₅；再将设计好的含有S₅的OD2采用Fmoc固相合成技术合成 SAH-OD2，并需要不脱保护，即在OD2结构的14和18位非关键氨基酸上插入 S5，并将OD2序列中第8、12、27位的S、L、Q分别转换成R、D、E，最后 构成SAH-OD2；然后在二氯乙烷中，将上述合成的仍存在于固相中的含有非天 然氨基酸S₅的多肽与催化剂混合，室温下反应2h，经TFA脱保护。

2、获得高纯度的SAH-OD2

采用反相HPLC中使用C18柱进行纯化和质谱鉴定，获得纯化率达到90% 或90%以上的SAH-OD2。

3、检测SAH-OD2在细胞内的定位

先在SAH-OD2的前端加上检测标签His，His标签具体为：HHHHHH；然 后将SAH-OD2与K562细胞作用6h，并设立PBS作为阴性对照，收集细胞， 做细胞免疫荧光检测。即利用DAPI对细胞核染色，利用Cy3检测SAH-OD2， 荧光显微镜观察红色荧光的位置，结果如图2所示。结果表明SAH-OD2在没有 CTP信号肽的情况下能穿过细胞膜进入细胞。

4、SAH-OD2和TF-CTP-OD2-HA融合蛋白对Bcr-Abl细胞增殖的影响

a、构建pTF-CTP-OD2-HA原核表达载体：用PCR和直接退火延伸方法扩 增OD2和HA，再将OD2和HA插入质粒pCOLD-TF-DNA中，构建 pTF-CTP-OD2-HA，然后筛选和鉴定正确后转化表达菌BL21(DE3)并鉴定其 正确性；

b、TF-CTP-OD2-HA融合蛋白的表达、纯化与鉴定：利用IPTG诱导表达可 溶性的TF-CTP-OD2-HA融合蛋白，再利用Ni-NTA亲和柱纯化，超滤浓缩后 Bradford法测定浓度，由SDS-PAGE鉴定其纯度，western-bolt检测其特异性获 得高纯度的TF-CTP-OD2-HA融合蛋白；

C、将浓度为4、8、10、20、40μmol/L的SAH-OD2和60μmol/L的 TF-CTP-OD2-HA融合蛋白与K562细胞作用48h，然后收集细胞，MTT检测其 增殖情况，结果如图3所示。结果表明SAH-OD2和TF-CTP-OD2-HA融合蛋白 对K562细胞的增殖均具有抑制作用，但是SAH-OD2与TF-CTP-OD2-HA相比， SAH-OD2在低浓度4μmol/L时对K562细胞增殖的抑制作用与TF-CTP-OD2-HA 在高浓度(60μmol/L)时的抑制作用相当，说明低浓度的SAH-OD2具有高浓度 TF-CTP-OD2-HA的抑制增殖作用，能大大的减少了药物的使用量，提高生物学 效应。

5、SAH-OD2和TF-CTP-OD2-HA融合蛋白对Bcr-Abl细胞凋亡的影响

将浓度为4、8、10、20、40μmol/L的SAH-OD2和60μmol/L的 TF-CTP-OD2-HA融合蛋白与K562细胞作用48h，并分别设立对照组，SAH-OD2 的阴性对照为DMSO，TF-CTP-OD2-HA融合蛋白的阴性对照为PBS，然后收集 细胞，流式细胞仪检测其凋亡情况，结果如图4所示，箭头所指处为细胞凋亡 碎片：细胞形态不完整，出现细胞碎片，核脱落，胞核裂解，胞浆芽突并脱落， 形成含核碎片和(或)细胞器成份的膜包被凋亡小体样形态。

结果表明：4、8、10、20、40μmol/L5种浓度的SAH-OD2和60μmol/L浓 度的TF-CTP-OD2-HA融合蛋白对K562细胞的凋亡均具有促进作用，但是低浓 度的SAH-OD2具有和高浓度TF-CTP-OD2-HA相同的促进凋亡作用，故能大大 的减少了药物的使用量，提高生物学效应。

有益效果：

本发明一种杀伤慢性粒细胞白血病细胞的小分子多肽，具有制备简单，药 物使用浓度低，稳定性高，OD2不需要连接转导肽CTP就能进入细胞，能有效 的抑制CML细胞的增殖，促进CML细胞的凋亡，对于治疗CML的研究及药 物的开发具有很大的研究价值。

附图说明

图1为SAH-OD2和CTP-OD2-HA作用模似图；

图2为SAH-OD2在K562细胞中的定位图；

图3为比较SAH-OD2和TF-CTP-OD2-HA融合蛋白对K562细胞增殖抑制 情况的柱形图；

图4为SAH-OD2和TF-CTP-OD2-HA融合蛋白对K562细胞凋亡促进情况 的比较图。

具体实施方式

实施例：

一种杀伤慢性粒细胞白血病细胞的小分子多肽，由OD2和S5连接构成 SAH-OD2；所述OD2的14和18位非关键氨基酸上插入S5，并将OD2序列中 第8、12、27位的S、L、Q分别转换成R、D、E，最后构成SAH-OD2。

所述S5的结构式为：

所述OD2的氨基酸序列为：

ELERCKASIRRLEQEVNQERFRMIYLQ。