一种新颖的糖苷水解酶家族44的纤维素酶及其编码基因和应用

摘要

本发明公开了一种新颖的糖苷水解酶家族44的纤维素酶及其编码基因和应用。本发明得到了一种新颖的糖苷水解酶家族44的纤维素酶MgCel44（其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示）及其编码基因mgcel44（其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示），该新颖的糖苷水解酶家族44的纤维素酶MgCel44能够水解纤维素，因此本发明的新颖的糖苷水解酶家族44的纤维素酶MgCel44可以在纤维素的水解中具有广泛的用途。

说明书

技术领域：

本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种新颖的糖苷水解酶家族44的纤维 素酶及其编码基因和应用。

背景技术：

纤维素是世界上最多的可再生生物质资源。每年由植物体光合作用生成的生物质高达 1500亿吨，但是由于纤维素的结构复杂，目前这一巨大资源的绝大部分还不能被人类所综合 利用。纤维素是以葡萄糖为单元通过β-1,4-糖苷键连接而成的大分子。纤维素酶能将纤维素 降解并最终转化成葡萄糖的一类酶的总称，包括内切纤维素酶（endo-1,4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.4，简称EG）；外切纤维素酶（exo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.91，简称CBH）；β- 葡糖苷酶（β-D-glucosidase，EC3.2.1.21，简称BG）。内切葡聚糖酶是纤维素酶系中最重要 的酶，其作用于纤维素分子内的无定形区，随机水解β-1，4-糖苷键，产生大量的短链的小分 子纤维素物质，即纤维素末端，可为外切葡聚糖酶提供大量的反应末端，同时它也能水解小 分子的纤维素寡糖；外切纤维素酶作用于纤维素分子的末端，以两个葡萄糖残基为单位依次 从纤维素分子的末端切下，生成纤维二糖；β-葡糖苷酶作用于纤维二糖，将其水解成葡萄糖， 葡萄糖进行发酵很容易就可以转化成各种有用的化工产品。纤维素的转化利用对解决世界能 源危机、粮食问题、环境污染等有着重要的意义。

获取纤维素酶的传统方法是从纯培养微生物出发，筛选高产纤维素酶菌株，通过发酵进 行产酶，这在工业中获得了重要的应用，但是严峻的能源危机使得对新型工业用酶的需求日 益旺盛。自然环境中99%的微生物在目前的实验条件下不易获得纯培养，未培养微生物也是 地球上最大的尚未开发的生物资源。近年来出现的宏基因组学不依赖于微生物培养，以特定 环境中微生物总DNA为对象，增加了获得新的生物活性物质的机会，是一条找寻新基因及 新酶的新途径。红树林处于周期性遭受海水浸淹的环境，兼有陆地和海洋的性质但又与二者 不同，具有沼泽化和盐渍化等特征，其植物凋落物非常丰富，纤维素、木质素等有机质含量 高，造就丰富又不失特色的微生物资源，通过构建宏基因文库，可以从中筛选到新颖的性质 优良的纤维素酶基因。

发明内容：

本发明的目的是提供一种新颖的糖苷水解酶家族44的纤维素酶及其编码基因和应用。

本发明通过构建红树林宏基因组文库，利用纤维素酶活性平板筛选方法，获得了新的纤 维素酶MgCel44及其编码基因mgcel44，该编码基因mgcel44可在宿主细胞中大量表达以生 产纤维素酶MgCel44，用于纤维素的降解，从而实现了本发明的目的。

本发明的新颖的糖苷水解酶家族44的纤维素酶的编码基因mgcel44，其特征在于，其核 苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其由1947个碱基组成。

本发明的新颖的糖苷水解酶家族44的纤维素酶MgCel44，其特征在于，其氨基酸序列如 SEQ ID NO.2所示，其由648个氨基酸组成，自N端的第33-87位氨基酸为多配体聚糖区域， 自N端的第147-399位氨基酸为家族44糖基水解酶功能域。纤维素酶MgCel44与其它内切 葡聚糖酶具有一定的相似性，与Micromonospora lupini str.Lupac08的胞外纤维素酶、 Streptomyces bingchenggensis BCW-1的内切葡聚糖酶、Amycolatopsis mediterranei U32的内切 葡聚糖酶有最高一致性，一致性为48%，所以纤维素酶MgCel44是一种新颖的糖苷水解酶家 族44的纤维素酶。

本发明还提供了一种表达载体，其特征在于，含有上述新颖的糖苷水解酶家族44的纤维 素酶的编码基因mgcel44。

本发明还提供了一种宿主细胞，其特征在于，含有上述表达载体的原核细胞或真核细胞。

所述的原核细胞可以为各种细菌，如大肠杆菌BL21（DE3）。

本发明还提供了上述新颖的糖苷水解酶家族44的纤维素酶MgCel44在纤维素降解中的 应用。

本发明得到了一种新颖的糖苷水解酶家族44的纤维素酶MgCel44及其编码基因 mgcel44，该新颖的糖苷水解酶家族44的纤维素酶MgCel44能够水解纤维素，因此本发明的 新颖的糖苷水解酶家族44的纤维素酶MgCel44可以在纤维素的水解中具有广泛的用途。

附图说明：

图1为从红树林土壤中提取的总DNA，1：λMix（片段从大到小依次为48.5kb,38.4kb,33.5 kb,29.9kb,24.5kb,24.0kb,19.4kb,17.1kb,15.0kb,12.2kb,10.1kb,8.6kb,8.3kb）；2：λ-HindⅢ digest（片段从大到小依次为23.1kb,9.4kb,6.6kb）；3：红树林土壤总DNA。

图2为用限制性内切酶BamHⅠ对红树林土壤微生物宏基因文库克隆进行酶切分析以判断文 库质量，M1：λMix（片段从大到小依次为48.5kb,38.4kb,33.5kb,29.9kb,24.5kb,24.0kb,19.4 kb,17.1kb,15.0kb,12.2kb,10.1kb,8.6kb,8.3kb）；M2：λ-HindⅢdigest（片段从大到小依次为 23.1kb，9.4kb，6.6kb，4.4kb，2.3kb，2.0kb）；其他泳道分别为文库克隆。

图3为文库中纤维素酶活性阳性克隆的筛选。

图4为能降解羧甲基纤维素的文库克隆质粒FosSCSIO1的BamHⅠ酶切带型，1：λ-HindⅢ digest（片段从大到小依次为23.1kb,9.4kb,6.6kb，4.4kb，2.3kb，2.0kb）；2：DL2000（片 段从大到小依次为2.0kb，1.0kb，0.75kb，0.5kb，0.25kb，0.1kb）；3：FosSCSIO1/BamHⅠ。 图5为重组质粒pET-mgcel44转化大肠杆菌后的转化子能降解羧甲基纤维素（上），而空载体 转化大肠杆菌后的转化子不能降解羧甲基纤维素（下）。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述，提供的实施例是为了更好 地理解本发明，而不应该被解释为限制本发明。

在本发明的实施例中所用到的材料包括：红树林土壤样品，EPI300-T1R菌株、Copycontrol  PCC2Fos载体购自Epicentre公司，限制性内切酶、修饰酶等试剂购自Promega、Takala、Sigma。

实施例1：红树林土壤微生物宏基因组文库的构建

1、红树林土壤微生物总DNA的提取

(l)称取5g红树林土壤样品，放置于50mL无菌离心管中；

(2)加入13.5ml红树林土壤DNA提取缓冲液：(100mmol Tris-HCl，100mmol EDTA[乙 二胺四乙酸钠]，100mmol sodium phosphate[磷酸钠]，1.5mol/L NaCl，1%CTAB[十六烷基三 甲基溴化铵]，2%PVPP[交联聚乙烯吡咯烷酮]，其余为水，pH8.0)，漩涡震荡5-10min，使 土壤颗粒充分分散于缓冲液中；

(3)将震荡后的样品置于摇床中，常温下振摇45min，使得土壤匀质化，加入1.5mL20% SDS，轻柔颠倒混匀，65℃水浴3h，每隔30min轻柔颠倒混匀样品；

(4)水浴裂解后，冷却至室温，10000g离心10min离心取上清液；

(5)加入预冷的氯仿/异戊醇(24:l)，颠倒混匀，室温下10000g离心10min.收集上清， 加入0.6倍体积的预冷的异丙醇，室温下沉淀40min；

(6)室温下，10000g离心15min收集核酸沉淀；

(7)核酸沉淀用70%冰乙醇洗涤2次，10000g离心5min，重悬于100μl无菌TE缓冲液， 得红树林土壤总DNA，0.8%电泳检测（见图1）。

2、插入片段的切割及末端修复

对提取的红树林土壤总DNA用枪头反复吹打进行机械性切割，使得其大小在35kb左右， 脉冲场电泳进行DNA片段的分离（脉冲场电泳设置为电压：6V/cm,脉冲值：5-15s，温度： 16℃，时间16h），回收35kb左右的DNA片段，对回收的片段进行末端修复反应，在冰上 依次向微量离心管中加入：8μl10×μ末端修复缓冲液，8μl2.5mM dNTP混合物，8μl10mM ATP，20μg插入片段，4μl末端修复酶，加去离子水至总体积为80μl。在室温下反应45min， 然后转移至70℃水浴10min以灭活末端补平酶，沉淀并回收DNA。

3、连接及Copycontrol Fosmid克隆的包装

连接反应的体系为：1μl10x快速连接缓冲液，1μl ATP，1μl PCC2Fos预处理好的克 隆载体（0.5μg/μl），插入DNA(0.25μg of≈35kb步骤2的回收DNA)，1μl快速连接酶， 加去离子水至体积为10μl，16℃连接20h，将反应体系转移到70℃，10min，使快速连接 酶失活，得到连接反应液。

Copycontrol Fosmid克隆的包装的步骤如下：

（1）冰上融化1管噬菌体包装提取物用于连接反应，该连接反应可以扩大或缩小反应体 系；

（2）在融化过程中，立即转移25μl噬菌体包装提取物到另一个1.5ml的离心管中；

（3）加入10μl连接反应液至25μl已经冰上融化了的噬菌体包装提取物中；

（4）用移液枪轻轻混匀液体数次，注意避免产生气泡，短暂离心使溶液都到小管底部；

（5）30℃下包装90min；

（6）加入剩余的25μl噬菌体包装提取物至管中；

（7）30℃下额外包装90min；

（8）加入噬菌体稀释缓冲液至1ml，温和混匀，每管加入25μl氯仿，得到包装好的噬 菌体。

4、文库的评估

将包装好的噬菌体侵染大肠杆菌EPI300，共获得100，000个克隆的文库，随机挑取18 个克隆，经过诱导，使其产生高拷贝质粒后提取质粒DNA，然后用内切酶BamHⅠ酶切，脉 冲电泳检测（见图2）。结果所有质粒除了都有一个8.1kb的载体片段外，都含有插入片段， 而且带型各不相同（见图2），说明文库含有随机的插入片段，插入片段大小在20-55kb之间， 平均长度约为30kb，文库容量达3Gb，说明文库的容量非常大，质量非常好。

实施例2：表达纤维素酶活性阳性克隆的筛选

将保存在96孔板中的文库克隆子挑取到含有1%的羧甲基纤维素钠(CMC)的卡那霉素抗 性LA平板上，将平板在37℃培养箱中培养72h，用0.5%刚果红溶液染色20min，1M NaCl 溶液脱色15min，检测平板上是否有透明圈，结果筛选到1个CMCase阳性克隆子（见图3）， 该阳性克隆的质粒命名为fosSCSIO1。为了证实fosSCSIO1确实含有纤维素酶基因，用提取 的fosSCSIO1质粒重新转化大肠杆菌EPI300，结果重组子在含羧甲基纤维素钠的平板上检测 到清晰的水解圈，而不含质粒的大肠杆菌EPI300在平板上则没有检测到水解圈，说明 fosSCSIO1质粒上确实含有纤维素酶基因。用限制性内切酶BamHⅠ完全酶切fosSCSIO1后， 电泳检测分析，结果除了有一个8.1kb的载体片段外，还有另外6条片段，大小分别为6.0kb、 5.0kb、4.1kb、3.5kb、3.0kb、2.2kb（见图4），说明fosSCSIO1含有约23.8kb的插入片段。

实施例3：纤维素酶基因的获得

提取纤维素酶活性克隆fosSCSIO1质粒，用Sau3AⅠ进行酶切，酶切体系为：5μl10× 酶切缓冲液，适量质粒DNA，0.5μl稀释100倍的内切酶Sau3AⅠ，加入ddH₂O至总体积为 50μl，37℃反应3min，回收长度为1-5kb的DNA片段。同时PUC19载体进行BamHⅠ酶 切，酶切后再进行去磷酸化反应，反应体系为：2μl10×缓冲液，适量酶切后PUC19载体，1 μl CIAP，加入ddH₂O至总体积为20μl。磷酸化处理后的PUC19载体与回收的Sau3AⅠ酶切 的质粒酶切片段进行连接，然后转化大肠杆菌宿主细胞，利用刚果红平板进行纤维素酶活性 阳性克隆子筛选，用琼脂糖凝胶电泳对阳性克隆子质粒大小进行分析，如果插入片段过大， 则重复以上步骤进行下一轮亚克隆，直到阳性克隆子质粒大小符合测序要求。最终获得一个 插入片段长度为3kb左右的阳性克隆子，将该片段送去华大基因进行测序，经过拼接得到完 整的含有mgcel44基因的片段。

实施例4：纤维素酶基因mgcel44的核苷酸序列分析

用NCBI(National Center for Biotechnology Information,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的 软件如ORF finder,Blast对步骤3的测序的完整的含有mgcel44基因的片段进行序列分析。纤 维素基因mgcel44的开放阅读框由1947个脱氧核苷酸组成，序列如SEQ ID NO.1所示，其中 起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。

实施例5：纤维素酶基因mgcel44编码产物纤维素酶MgCel44的氨基酸序列分析

利用密码子规则，纤维素酶基因mgcel44编码一个含648个氨基酸的蛋白质，其序列如 SEQ ID NO.2所示，命名为纤维素酶MgCel44，使用Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索 GenBank数据库，纤维素酶MgCel44属于糖苷水解酶44家族，与其它内切葡聚糖酶具有一 定的相似性，与Micromonospora lupini str.Lupac08的胞外纤维素酶、Streptomyces  bingchenggensis BCW-1的内切葡聚糖酶、Amycolatopsis mediterranei U32的内切葡聚糖酶有 最高一致性，一致性为48%，因此纤维素酶MgCel44是一种新颖的糖苷水解酶家族44的纤 维素酶。用组件结构研究工具Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/search)分析MgCel44的组件结构， 自N端的第33-87位氨基酸为多配体聚糖区域，自N端的第147-399位氨基酸为家族44糖基 水解酶功能域。

实施例6：纤维素酶基因mgcel44的克隆和表达

用上游引物mgcel44-S：CTCCGGAATTCATGGGTTTGGCCCTGGATGC，下游引物 mgcel44-A：CTCCGCTCGAGTCTAATGACGATTGAGTGCCGAAAG，以实施例3的纤维素 酶阳性克隆子质粒为模板PCR扩增纤维素酶基因mgcel44（经测序验证，PCR扩增得到的片 段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，为纤维素酶基因mgcel44），用限制性内切酶EcoRⅠ 和XhoⅠ酶切扩增产物，与经相同内切酶酶切的pET-22b表达载体进行连接，将连接产物转 化至大肠杆菌DH5α中，涂布到含50μg/ml卡那霉素的LB培养基平板上筛选阳性克隆，进一 步提取质粒DNA，双酶切验证正确后命名重组质粒为pET-mgcel44，该重组质粒是将纤维素 酶基因mgcel44插入pET-22b表达载体中。将质粒pET-mgcel44转化至大肠杆菌BL21（DE3） 中，转化子用IPTG诱导后，在平板上能降解羧甲基纤维素，而含有未插入纤维素酶基因 mgcel44的pET-22b空载体的大肠杆菌转化子则不能降解羧甲基纤维素（图5），由此说明纤 维素内切酶基因mgcel44在大肠杆菌中成功表达，该纤维素酶基因mgcel44的表达产物纤维 素酶MgCel44能够降解羧甲基纤维素。