一种转基因抗虫玉米转化体特异性质粒分子pMD-ESM及其构建方法与应用

摘要

本发明公开了一种转基因玉米MIR162转化体特异性质粒分子pMD-ESM，其空白载体为质粒载体pMD19-T载体，包含有转基因玉米MIR162转化体特异性序列和玉米内标基因序列，如序列表中1所示。构建方法为：首先，设计特异性PCR引物，从转基因玉米MIR162基因组DNA中扩增获得目的片段，然后，利用分子克隆技术将这目的片段构建到pMD19-T载体中，获得质粒分子pMD-ESM。本发明的质粒分子pMD-ESM，可作为转基因玉米MIR162标准品的替代品，用于转基因玉米MIR162的定性、定量检测，适用性强，稳定性好，对实际样品分析的结果比较准确，很好的解决了该品系检测过程中阳性标准物质缺乏的问题，具有极高的应用价值与市场前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于转基因玉米MIR162转化体特异性检测的质粒分子pMD-ESM，及其 构建方法，以及其在定量检测中的应用，属于分子生物学领域。

背景技术

转基因玉米MIR162是美国先正达公司应用现代分子生物学技术将含有抗鳞翅目昆虫蛋 白基因质粒载体pNOV13000通过农杆菌介导转化到玉米幼胚中培育而成。其含有两个外源 基因（Vip3Aa和manA）表达盒（Gene expression cassette），插入序列约为9.4kb。Vip3Aa基 因表达盒包含抗虫蛋白Vip3Aa20编码基因、ZmUbiInt启动子和35S终止序列；manA基因表 达盒包含manA编码基因、ZmUbiInt启动子和NOS终止序列。

目前转基因玉米MIR162已在美国、加拿大、巴西和阿根廷获得商业化种植的批准，越 南也于近期批准了该转基因品种的田间试验申请。由于该玉米品系已进行大面积商业化生产， 其产品有可能出现在我国进口玉米及其加工品之中，根据我国《农业转基因生物安全管理条 例》及《农业转基因生物标识管理办法》规定，转基因产品必须进行必要的标识管理。

质粒分子（Plasmid Molecule）作为一种新的DNA标准物质具有容易获得、使用方便、 纯度易控制和均匀性好等优点，被越来越多的应用在转基因产品定量检测中。研究、构建转 植酸酶基因玉米阳性质粒分子，对于加强该品种的安全管理，保护消费者利益，消除公众对 于转基因作物安全性的疑虑，营造良好的转基因作物产业化氛围具有重要意义。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种用于转基因玉米MIR162转化体特异性检测的质 粒分子pMD-ESM，本发明还提供了其构建方法，以及其在定量检测中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种转基因玉米MIR162转化体特异性质粒分子pMD-ESM，其空白载体为质粒载体 pMD19-T载体，包含有转基因玉米MIR162转化体特异性序列和玉米内标基因序列，该质粒 分子的特异性序列如下：

ACACCAATGATGCAAATAGGCTGGGAATAGTCTGTCTAATAGTTTGAGTGAATCATG TCACTGATAGTTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGATCATGAGCGGAGAATTAA GGGAGTCACGTTATGACCCCCGCCGATGACGCGGGACAAGCCGTTTTACTGAAGCCAG AGCCCGCAGGCCATCGCTGAACCGGTGGATGCTAAGGCTGATGCAGCTCCGGCTACAGA TGCGGCGGCGAGTGCTCCTTATGACAGGGAGGATAATGAACCTGGCCCTTTGGCTGGGC CTAATGTGATGAACGTCGTCGT，如序列表中1所示。

所述转基因玉米MIR162转化体特异性质粒分子pMD-ESM的构建方法为：首先，设计 特异性PCR引物，从转基因玉米MIR162基因组DNA中扩增获得转基因玉米MIR162转化体 特异性序列和玉米内标基因序列，然后，利用分子克隆技术将这两段DNA片段构建到 pMD19-T载体中，获得新的质粒分子pMD-ESM（常规方法，工艺步骤均为常规的，但PCR 特异性引物和新的质粒分子序列为本发明的发明点之一）。

具体构建步骤如下：

（1）设计PCR特异性引物：利用GenBank等数据库进行生物信息学分析，获得转基因 玉米MIR162转化体特异性序列和玉米内标基因序列，根据序列设计PCR特异性引物；

（2）获取目的片段：利用上述PCR特异性引物特异性的扩增目的片段：转基因玉米 MIR162转化体特异性序列和玉米内标基因序列；回收这两个目的片段，以此为模板采用引物 C-MIR162-1F/C-zSSIIb-2R进行重叠PCR扩增；

（3）质粒的构建：上述得到的PCR产物回收后，通过连接酶连接到pMD19-T载体 （2692bp）上；连接后的产物转化至大肠杆菌DH5α，采用凝胶电泳法鉴定阳性质粒并测序 验证，鉴定为阳性质粒的即为转基因玉米MIR162转化体特异性质粒分子pMD-ESM。

所述步骤（1）中，PCR特异性引物为两对，序列如下：

C-MIR162-1F:5'-ACACCAATGATGCAAATAGGCT-3'；

C-MIR162-2R:5'-GCGGGCTCTGGCTTCAGTAAAACGGCTTGTCCCGC-3'；

C-zSSIIb-1F:5'-GCGGGACAAGCCGTTTTACTGAAGCCAGAGCCCGC-3'；

C-zSSIIb-2R:5'-ACGACGACGTTCATCACATTAGG-3'，如序列表中2、3、4、5所示。

所述步骤（2）中，获取目的片段的具体步骤如下：扩增所用引物为 C-MIR162-1F/C-MIR162-2R和C-zSSIIb-1F/C-zSSIIb-2R，扩增体系为PremixExTaq(Takara) 20μL，上、下游引物(10μmol/L)各2.5μL，转基因玉米MIR162模板DNA(50ng/μL)2μL， 加水补足至50μL；反应程序为：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环； 72℃7min。重叠PCR扩增的扩增体系和反应程序如下：扩增体系为PremixrTaq(Takara) 15μL，上、下游引物(10μmol/L)各1.5μL，回收的目的片段2μL，加水补足至30μL；反应 程序为：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃45s，35个循环；72℃7min。

本发明所构建的质粒分子pMD-ESM，可作为转基因玉米MIR162标准品的替代品，用于 转基因玉米MIR162的定性、定量检测；定量检测包括SYBR Green I实时荧光定量检测和 TaqMan探针实时荧光定量检测。

定性检测时，方法如下：

首先，提取待检测样品的基因组DNA，以此为模板，使用MIR162转化体特异性引物进 行PCR扩增，以转基因玉米MIR162转化体特异性质粒分子pMD-ESM作为阳性对照；然后， 待检测样品的PCR扩增产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物，若 存在扩增产物，则待检测样品中含有转基因玉米MIR162转化事件；若不存在扩增产物，则 待检测样品中不含有转基因玉米MIR162转化事件。

所述MIR162转化体特异性引物序列如下（即专利申请号为201210053592.4、公开号为 102586442A的发明专利申请中公开的特异性引物）：

MIR162-F:5'-CTGTCTAATAGTTTGAGTGA-3'；

MIR162-R:5'-GTGACTCCCTTAATTCTC-3'。

SYBRGreenI实时荧光定量检测时，具体方法如下：

（1）建立MIR162基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的 SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线：

①对质粒分子pMD-ESM进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入MIR162转化体特异性 引物，以及zSSIIb基因的国家标准引物，进行扩增；

②扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线 性关系，据此绘制MIR162转化事件的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb 基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线；

（2）提取待检测样品基因组DNA，得基因组DNA提取液，然后向基因组DNA提取液 中加入MIR162转化体特异性引物，以及zSSIIb基因的国家标准引物，进行扩增；扩增后， 测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的MIR162基因的 SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR 标准曲线，计算出相应的拷贝数，则转基因玉米MIR162基因的拷贝数与玉米内标准基因 zSSIIb基因的拷贝数之比，即为待检测样品中转基因玉米MIR162的百分含量。

所述步骤（1）①和（2）中，zSSIIb引物序列（国家标准）如下：

zSSIIb-F:5'-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'；

zSSIIb-R:5'-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'。

所述步骤（1）①和（2）中，扩增的参数如下：扩增反应体积为20μL，2×Premix Ex Taq (Rox)10μL，浓度为10μmol/L的Forward primer0.4μL，浓度为10μmol/L的Reverse primer 0.4μL，ddH₂O8.2μL，DNA模板1μL；扩增反应条件：95℃10min预变性；95℃15s，60℃30s， 在60℃收集荧光信号，共计40个循环。

所述步骤（1）①和（2）中，MIR162转化体特异性引物序列如下（即专利申请号为 201210053592.4、公开号为102586442A的发明专利申请中公开的特异性引物）：

MIR162-F:5'-CTGTCTAATAGTTTGAGTGA-3'；

MIR162-R:5'-GTGACTCCCTTAATTCTC-3'。

TaqMan探针实时荧光定量检测时，方法如下：

（1）建立转基因玉米MIR162的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基 因的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线：

①对质粒分子pMD-ESM进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入转基因玉米MIR162转 化体特异性引物和荧光标记探针，以及zSSIIb基因的国家标准引物和荧光标记探针，进行扩 增；

②扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线 性关系，据此绘制转基因玉米MIR162的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb 基因的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线；

（2）提取待检测样品基因组DNA，得基因组DNA提取液，然后向基因组DNA提取液 中加入转基因玉米MIR162转化体特异性引物和荧光标记探针，以及zSSIIb基因的国家标准 引物和荧光标记探针，进行扩增；扩增后，测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct 值，然后根据上述绘制的转基因玉米MIR162定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR 标准曲线，计算出相应的拷贝数，则转基因玉米MIR162拷贝数与玉米内标准基因zSSIIb基 因的拷贝数之比，即为待检测样品中转基因玉米MIR162的百分含量。

所述步骤（1）①和（2）中，zSSIIb引物和探针序列（国家标准）如下：

zSSIIb-1F:5'-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'；

zSSIIb-2R:5'-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'；

zSSIIb-P:FAM-5'-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-3'-TAMRA。

所述步骤（1）①和（2）中，扩增的参数如下：扩增反应体积为20μL，2×PremixEx Taq (Rox)12.5μL，浓度为10μmol/L的Forward primer1μL，浓度为10μmol/L的Reverse primer 1μL，浓度为10μmol/L的TaqMan probe0.5μL,ddH2O4μL，DNA模板1μL；扩增反应条件： 95℃10min预变性；95℃15s，60℃30s，在60℃收集荧光信号，共计40个循环。

所述步骤（1）①和（2）中，MIR162转化体特异性引物和探针序列如下（即专利申请号 为201210053592.4、公开号为102586442A的发明专利申请中公开的特异性引物和探针）：

MIR162-1F:5'-CTGTCTAATAGTTTGAGTGA-3'；

MIR162-2R:5'-GTGACTCCCTTAATTCTC-3'；

MIR162-P:FAM-5'-CAGATTGTCGTTTCCCGCCTTC-3'-Eclipse。

本发明利用重叠PCR和分子亚克隆的方法首次构建了含有转基因玉米MIR162转化体特 异性序列和玉米内标基因序列的标准质粒分子pMD-ESM。本发明构建的质粒分子pMD-ESM 可作为转基因玉米MIR162标准品的替代品用于SYBRGreenI实时荧光定量PCR和TaqMan 探针实时荧光定量检测玉米及其相关产品中转基因玉米MIR162含量，其适用性强，稳定性 好，对实际样品分析的结果比较准确，很好的解决了该品系检测过程中阳性标准物质缺乏的 问题，具有极高的应用价值与市场前景。

附图说明

图1为实施例1中所构建的质粒分子pMD-ESM图谱。

图2为实施例2中内标准基因zSSIIb的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线。

图3为实施例2中转基因玉米MIR162SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线。

图4为实施例3中内标准基因zSSIIb的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线。

图5为实施例3中转基因玉米MIR162TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1构建质粒pMD-ESM

步骤如下：

（1）设计PCR特异性引物：利用GenBank等数据库进行生物信息学分析，获得转基因 玉米MIR162转化体特异性序列和玉米内标基因序列，根据序列设计PCR特异性引物，序列 如下：

C-MIR162-1F:5'-ACACCAATGATGCAAATAGGCT-3'；

C-MIR162-2R:5'-GCGGGCTCTGGCTTCAGTAAAACGGCTTGTCCCGC-3'；

C-zSSIIb-1F:5'-GCGGGACAAGCCGTTTTACTGAAGCCAGAGCCCGC-3'；

C-zSSIIb-2R:5'-ACGACGACGTTCATCACATTAGG-3'。

（2）获取目的片段：利用上述PCR特异性引物特异性的扩增目的片段：转基因玉米 MIR162转化体特异性序列和玉米内标基因序列；回收这两个目的片段，以此为模板采用引物 C-MIR162-1F/C-zSSIIb-2R进行重叠PCR扩增；

获取目的片段的具体步骤如下：采用DNA提取试剂盒（Omega）提取转基因玉米MIR162 种子DNA，使用引物C-MIR162-1F/C-MIR162-2R和C-zSSIIb-1F/C-zSSIIb-2R进行PCR扩增， 扩增体系为PremixExTaq(Takara)20μL，上、下游引物(10μmol/L)各2.5μL，MIR162模板 DNA(50ng/μL)2μL，加水补足至50μL；反应程序为：95℃5min；95℃30s，58℃30s， 72℃30s，35个循环；72℃7min。重叠PCR扩增的扩增体系和反应程序如下：扩增体系 为PremixrTaq(Takara)15μL，上、下游引物(10μmol/L)各1.5μL，回收的目的片段2μL，加 水补足至30μL；反应程序为：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃45s，35个循环； 72℃7min。

（3）质粒的构建：上述得到的PCR产物回收后，通过连接酶连接到pMD19-T载体 （2692bp）上；连接后的产物转化至大肠杆菌DH5α，采用凝胶电泳法鉴定阳性质粒并测序 验证，鉴定为阳性质粒的即为转基因玉米MIR162转化体特异性质粒分子pMD-ESM，经测序， 其序列如下：

ACACCAATGATGCAAATAGGCTGGGAATAGTCTGTCTAATAGTTTGAGTGAATCATG TCACTGATAGTTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGATCATGAGCGGAGAATTAA GGGAGTCACGTTATGACCCCCGCCGATGACGCGGGACAAGCCGTTTTACTGAAGCCAG AGCCCGCAGGCCATCGCTGAACCGGTGGATGCTAAGGCTGATGCAGCTCCGGCTACAGA TGCGGCGGCGAGTGCTCCTTATGACAGGGAGGATAATGAACCTGGCCCTTTGGCTGGGC CTAATGTGATGAACGTCGTCGT。

所构建的质粒分子图谱如图1所示。

实施例2质粒分子pMD-ESM在转基因玉米MIR162SYBR Green I实时荧光定量PCR检 测中的应用

将质粒分子pMD-ESM按5倍倍比分别稀释至25000、5000、1000、200和40copies/μL， 每个浓度设3个重复，检测扩增的重复性。

引物和探针由大连Takara公司合成，稀释成10μmol/L备用。

合成的转基因玉米MIR162转化体特异性引物序列如下：

MIR162-1F:5'-CTGTCTAATAGTTTGAGTGA-3'；

MIR162-2R:5'-GTGACTCCCTTAATTCTC-3'。

玉米内标引物与探针（zSSIIb）采用国家标准引物，其序列如下：

zSSIIb-F:5'-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'；

zSSIIb-R:5'-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'。

扩增反应体积为20μL，扩增反应体积为20μL,2×Premix Ex Taq(Rox)10μL，浓度为 10μmol/L的Forward primer0.4μL，浓度为10μmol/L的Reverse primer0.4μL，ddH₂O8.2μL， DNA模板1μL。扩增反应条件：95℃10min预变性；95℃15s，50℃30s，72℃30s，在72℃收 集荧光信号，共计40循环。每个试样重复3次，同时设立无菌双蒸水（ddH₂O，空白）和非 转基因样品（郑单958，阴性）对照。

结果：通过对不同质粒分子pMD-ESM拷贝数为25000、5000、1000、200和40的DNA进 行SYBR Green I实时荧光定量PCR扩增，计算机软件自动生成标准曲线，纵坐标为Ct,横坐 标为起始拷贝数的自然对数。根据标准曲线所得的线性计算公式，通过对不同转基因含量的 转基因玉米MIR162标准品（3%,1%,0.5%,0.1%）、阳性样品、阴性样品及空白对照的测定，将 样品的Ct值代入公式，即可得到待测样品转基因成分的百分含量。

对玉米内标准基因zSSIIb和转基因玉米MIR162的特异性引物对同一组标准品DNA和不 同百分含量的转基因玉米DNA进行SYBR GreenI实时荧光定量PCR扩增，分别得到PCR扩增 曲线，并由系统软件自动生成标准曲线。玉米内标准基因zSSIIb的标准曲线如图2所示，该 曲线的斜率为-3.375系数R²为0.998，转植酸酶基因玉米基因特异性引物的标准曲线如图3 所示，该曲线的斜率为-3.485,相关系数R²为0.999；两条标准曲线的标准偏差(SD)均小于 0.08，相对标准偏差(RSD)均小于0.21%，因此根据未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计 算出该样品的起始拷贝数。根据公式：

样品中转基因玉米MIR162含量=(MIR162转化体特异性拷贝数/内标基因zSSIIb拷贝数) ×100％

可以计算出待测样品中转基因玉米MIR162的百分含量。对转基因玉米MIR162含量为3%、 1%、0.5%的混合样品的定量结果为3.17%、1.03%和0.47%，百分偏差分别为5.6%、3%和6%， 三次重复的标准偏差(SD)均小于0.049，相对标准偏差(RSD)均小于10.4%；上述定量结果准 确度和精确度较高，均符合欧盟的定量检测标准。

实施例3质粒分子pMD-ESM在转基因玉米MIR162TaqMan探针实时荧光定量PCR检测中 的应用

将质粒分子pMD-ESM按5倍倍比分别稀释至25000、5000、1000、200和40copies/μL， 每个浓度设3个重复，检测扩增的重复性。

引物和探针由大连Takara公司合成，稀释成10μmol/L备用。

合成的转基因玉米MIR162转化体特异性引物与探针序列如下：

MIR162-1F:5'-CTGTCTAATAGTTTGAGTGA-3'；

MIR162-2R:5'-GTGACTCCCTTAATTCTC-3'；

MIR162-P:FAM-5'-CAGATTGTCGTTTCCCGCCTTC-3'-Eclipse。

玉米内标引物与探针（zSSIIb）采用国家标准引物与探针，其序列如下：

zSSIIb-F:5'-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'；

zSSIIb-R:5'-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'；

zSSIIb-P:FAM-5'-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-3'-TAMRA。

扩增反应体积为20μL，扩增反应体积为20μL，2×Premix Ex Taq(Rox)12.5μL，浓度 为10μmol/L的Forward primer1μL，浓度为10μmol/L的Reverse primer1μL，浓度为10μmol/L 的TaqMan probe0.5μL,ddH₂O4μL，DNA模板1μL。扩增反应条件：95℃10min预变性；95℃ 15s，60℃30s，在60℃收集荧光信号,共计40个循环。每个试样重复3次，同时设立无菌双 蒸水（ddH₂O，空白）和非转基因样品对照。

结果：通过对不同质粒分子pMD-ESM拷贝数为25000、5000、1000、200和40的DNA进 行TaqMan实时荧光定量PCR扩增，计算机软件自动生成标准曲线，纵坐标为Ct,横坐标为起 始拷贝数的自然对数。根据标准曲线所得的线性计算公式，通过对不同转基因含量的转基因 玉米MIR162标准品（3%,1%,0.5%）、阳性样品、阴性样品及空白对照的测定，将样品的Ct值 代入公式，即可得到待测样品转基因成分的百分含量。

对玉米内标准基因zSSIIb和转植酸酶基因玉米的基因特异性引物对同一组标准品DNA和 不同百分含量的转基因玉米DNA进行TaqMan实时荧光定量PCR扩增，分别得到PCR扩增曲线， 并由系统软件自动生成标准曲线。三次重复实验所得玉米内标准基因zSSIIb的标准曲线如图 4所示，该曲线的斜率为-3.572系数R²为0.998，转植酸酶基因玉米基因特异性引物的标准 曲线如图5所示，该曲线的斜率为-3.483,相关系数R²为0.999，两条标准曲线的标准偏差(SD) 均小于0.11，相对标准偏差(RSD)均小于0.34%，因此根据未知样品的Ct值，即可从标准曲 线上计算出该样品的起始拷贝数。根据公式：

样品中转基因玉米MIR162含量=(MIR162转化体特异性拷贝数/内标基因zSSIIb拷贝数) ×100％

可以计算出待测样品中转基因玉米MIR162的百分含量。对转基因玉米MIR162含量为3%、 1%、0.5%的混合样品的定量结果为3.12%、1.06%和0.56%，百分偏差分别为4%、6%和12%， 三次重复的标准偏差(SD)均小于0.106，相对标准偏差(RSD)均小于10.9%；上述定量结果准 确度和精确度较高，均符合欧盟的定量检测标准。

以上结果可以证明，本发明为转基因玉米MIR162SYBR Green I实时荧光定量PCR和 TaqMan探针实时荧光定量PCR检测提供了适用性强、稳定性好的阳性替代品。为转基因标识 提供了一种强有力的技术支撑，为转基因产品的控制提供了必要的手段。