坛紫菜中红藻糖苷和异红藻糖苷含量的检测方法

摘要

本发明涉及一种利用液质联用方法检测坛紫菜中红藻糖苷和异红藻糖苷含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：样品处理、液相色谱和质谱检测条件设置、标准曲线绘制、测定待测样品、结果计算等步骤。与现有技术相比，本发明用于坛紫菜中红藻糖苷和异红藻糖苷的定量检测，样品处理和检测方法简单、快速，准确度和灵敏度高，重复性好；红藻糖苷和异红藻糖苷的标准溶液在0.08μg/mL～91.9μg/mL之间线性良好。

说明书

技术领域

本发明涉及一种海洋生物有效成分的定量检测方法，具体指一种坛紫菜中红藻糖苷和异 红藻糖苷含量的方法。

背景技术

红藻糖苷，英文名为O-α-D-galactopyranosylglycerol，其分子式为C₉H₁₈O₈，分子量 为254，是一类半乳糖甘油类糖苷异构体，目前存在三种异构形式，分别为红藻糖苷(α-D- 半乳糖基-(1→2)-D-甘油,floridoside)、D型异红藻糖苷(α-D-半乳糖基-(1→1)-D-甘油, D-isofloridoside)和L型异红藻糖苷(α-D-半乳糖基-(1→1)-L-D-甘油,L-isofloridoside)。

红藻中一般缺少大多数光合自养生物累积的游离单糖和寡糖，而以一种特殊的低分 子红藻苷糖游离状态存在。上个世纪初，Kylin首次报道分离出这种糖苷类物质，此 后Colin等证明其结构为α-氧-甘油-D-半乳吡喃糖苷。依据Majak等和Cra]gie等报道， 在以红藻为材料的放射性同位素标记试验中，红藻糖苷标记得快，标记量大，说明红藻 糖苷是红藻重要的光合同化产物，所以分析红藻中的红藻糖苷，对于研究红藻的光合作 用、碳代谢及其它生理生化过程具有重要意义。此外，Reed和Kasten等报道了红藻糖 苷在调节渗透压方面重要作用，特别在高渗条件下，这类糖苷的浓度会急剧增加。另外 Kirst等经过多年研究发现大多数红藻中都含有红藻糖苷，并起到调节渗透压的作用，除 了仙菜目（海人草素起类似作用）。紫菜是我国最重要的经济海藻之一，近年来随着全 球气候变暖等自然和人为因素的影响，致使紫菜幼苗烂苗或成菜烂菜、减产，严重威胁 着紫菜养殖业的持续发展。因此为适应我国海藻，特别是紫菜的生理和生态研究发展， 建立红藻糖苷的分析方法是十分必要的。

目前关于这种红藻糖苷和异红藻糖苷的检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、 气相色谱法（GC）和气相色谱质谱联用法（GC-MS）。Colin等利用液相色谱研究在不 同盐度培养条件下鲂生蜈蚣藻中的红藻糖苷含量变化情况。范晓等利用衍生气相色谱法 对龙须菜中红藻糖苷进行定性定量研究。Reed等采用GC-MS和核磁共振(NMR)方法分 析鉴定了红藻中的红藻糖苷的结构。上述方法不仅检测时间长，而且样品检测前处理步 骤复杂。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状提供一种样品进行处理简单且 检测用时短的检测坛紫菜中红藻糖苷和异红藻糖苷的方法，其利用液相色谱-三重四级 杆串联质谱联用技术选择反应监测模式（HPLC-QqQ-SRM-MS），对坛紫菜中红藻糖苷 和异红藻糖苷能够操作简便、快速且灵敏度高的进行定量检测。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该利用液质联用方法检测坛紫菜中 红藻糖苷含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（一）、样品处理过程：

取1g坛紫菜粉和4～6ml纯度为65～75wt%的乙醇于反应瓶中，用铝箔纸封口； 置于水浴摇床，在110～130转/分、65～75℃下水浴5～7小时，取出；

过滤得到的固相用热乙醇（60～70℃）冲洗2～4次，每次10～20mL；

过滤所得冲洗液，过滤得到的液相在4500～5500转/分下离心8～12分钟，取液相 置于烧瓶中，旋转蒸干后，用0.4～06ml乙腈和0.4～06ml水溶解，得到的溶液用 0.40～0.50μm滤膜过滤，得到的液相部分即为待测样品。

（二）、检测：

液相色谱和质谱条件：

（1）所用仪器：TSQ Quantum Access液相色谱-三重四极杆质谱联用分析系统；

（2）液相条件：固定相为Waters XBridgeTM Amide柱（100mm×3.0mm,3.5μm）； 流动相为体积比为90：10的乙腈-0.1%乙酸铵水溶液等度洗脱；进样量10μL，柱温40℃；

（3）质谱条件：采用电喷雾电离源负离子电离模式，喷雾电压2.5KV，鞘气流量 25L/min，辅助气流量5L/min，离子传输毛细管温度350℃，扫描采用选择反应监测SRM 模式，母离子为[M-H]-离子m/z277，子离子m/z119和89，碰撞能量分别为20eV和 21eV，采集时间均为0.2s，碰撞气采用氩气，碰撞气压力1.5mTorr；Q1和Q3分辨率 均设定为半峰宽0.7Da；

（三）、标准曲线绘制：

标准曲线的绘制可以使用现有技术中的任意一种方法，较好的，可以采用下述方法：

红藻糖苷标准品为红藻糖苷和异红藻糖苷混合物，其中异红藻糖苷的纯度为8.1%， 红藻糖苷的纯度为91.9%；分别称取1.0μg、5.0μg、10.0μg、50.0μg和100.0μg该混合 标准品，分别用1mL体积比为1：1的乙腈/水溶液配置，得到异红藻糖苷浓度分别为 0.08μg/mL、0.4μg/mL、0.8μg/mL、4.1μg/mL和8.1μg/mL，红藻糖苷浓度分别为 0.92μg/mL、4.6μg/mL、9.2μg/mL、45.9μg/mL和91.9μg/mL的标准溶液，然后在步骤(二) 中的色谱和质谱条件下测定，记录峰面积，绘制峰面积-浓度标准曲线，即得到所述的 标准曲线。

（四）、计算含量：

样品中红藻糖苷和异红藻糖苷含量X=C*V*n/m，式中：

X—样品中红藻糖苷和异红藻糖苷的含量，单位μg/mg;

C—由标准曲线测得的待测液中红藻糖苷和异红藻糖苷浓度，单位为μg/mL；

V—待测液体积，单位为mL；

n—待测液稀释倍数

m—样品质量，单位为mg。

本发明所提供的定量检测采用有机溶剂浸泡提取坛紫菜中红藻糖苷和异红藻糖苷； 建立液相色谱-三重四级杆串联质谱联用方法分别定量检测红藻糖苷和异红藻糖苷浓 度，液相色谱以氨基柱为固定相，乙腈、水、乙酸铵溶液或混合液为流动相，色谱分离 进行等度洗脱，质谱检测采用电喷雾电离源（ESI）和选择离子模式（SRM）检测坛紫 菜中的红藻糖苷和异红藻糖苷浓度。

（3）质谱条件：采用电喷雾电离源负离子电离模式，喷雾电压2.5KV，鞘气流量 25L/min，辅助气流量5L/min，离子传输毛细管温度350℃，扫描采用选择反应监测 （SRM）模式。碰撞能量见表，采集时间均为0.2s，碰撞气采用氩气，碰撞气压力1.5 mTorr。Q1和Q3分辨率均设定为半峰宽0.7Da。

与现有技术相比，本发明用于坛紫菜中红藻糖苷和异红藻糖苷的定量检测，样品处 理和检测方法简单、快速，准确度和灵敏度高，重复性好；红藻糖苷和异红藻糖苷的标 准溶液在0.08μg/mL～91.9μg/mL之间线性良好，回归方程异红藻糖苷为 Y=239684X+8176，R²=0.9992和红藻糖苷Y=112313X+155368,R²=0.9989；样品回收率 在81.3%-116.2%之间(异红藻糖苷)和87.3%-108.7%之间(红藻糖苷)；精密度在1.6%-8.4% 之间(异红藻糖苷)和1.7%-6.3%之间(红藻糖苷)；检测限分别为15.8ng/mL(异红藻糖苷) 和46.0ng/mL(红藻糖苷)；定量限分别为31.6ng/mL(异红藻糖苷)和91.9ng/mL(红藻糖 苷)。

附图说明

图1为本发明实施例中红藻糖苷和异红藻糖苷标准色谱图；

图2和图3分别为本发明实施例中红藻糖苷和异红藻糖苷标准质谱图；

图4为本发明实施例中待测样品红藻糖苷和异红藻糖苷色谱图；

图5和图6分别为本发明实施例中待测样品红藻糖苷和异红藻糖苷质谱图；

图7和图8为本发明实施例中红藻糖苷和异红藻糖苷标准曲线。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实验仪器与试剂如下

1）仪器：TSQ Quantum Access液相色谱一三重四极杆质谱联用分析系统（美国 THERMO FISHER SCIENTIFIC公司）。色谱柱为Waters XBridgeTM Amide柱（100 mm×3.0mm,3.5μm）；针筒式微孔滤膜0.45μm有机滤膜；旋转蒸发仪；电子天平（梅 特勒-托利多仪器有限公司）；低俗离心机；水浴摇床；超声仪；超纯水系统（法国 MILLIPORE公司）。

2）实验试剂：红藻糖苷和异红藻糖苷标准品，乙腈、超纯水、无水乙醇。

2.实验方案如下：

2.1用红藻糖苷和异红藻糖苷标准品确定最佳的色谱和质谱条件。

2.2上述方法测定待测坛紫菜样品，确定其中是否含有红藻糖苷和异红藻糖苷。

2.3在待测坛紫菜样品中添加红藻糖苷和异红藻糖苷标准品，测定方法的回收率、 精密度、检测限以及定量限。

3.试验方法如下：

3.1色谱与质谱条件

所用仪器为TSQ Quantum Access液相色谱一三重四极杆质谱联用分析系统（美国 THERMO FISHER SCIENTIFIC公司）

质谱条件：

正离子模式，电喷雾离子源（ESI），质量分析器为四级杆，喷雾电压2.5KV，鞘 气流量25L/min，辅助气流量5L/min，离子传输毛细管温度350℃，扫描采用选择反应 监测（SRM）模式，母离子为[M-H]^-离子m/z277，子离子m/z119和89，碰撞能量分 别为20eV和21eV，采集时间均为0.2s，碰撞气采用氩气，碰撞气压力1.5mTorr。Q1 和Q3分辨率均设定为半峰宽0.7Da。

液相条件：

A、色谱柱：Waters XBridgeTM Amide柱（100mm×3.0mm,3.5μm）。

B、流动相：乙腈：0.1%乙酸铵水溶液=90:10等度洗脱。

C、柱温：40℃。

D、进样量：10μL。

3.2标准曲线绘制

标准品为异红藻糖苷和红藻糖苷混合物，其中异红藻糖苷的纯度为8.1%，红藻糖 苷的纯度为91.9%。称取1.0μg，5.0μg,10.0μg,50.0μg,100.0μg该混合标准品，分别用 1mL乙腈/水（v/v50/50）溶液配置，可以得到异红藻糖苷的标准溶液浓度分别为 0.08μg/mL,0.4μg/mL,0.8μg/mL,4.1μg/mL,8.1μg/mL；红藻糖苷的标准溶液浓度分别为 0.92μg/mL,4.6μg/mL，9.2μg/mL，45.9μg/mL，91.9μg/mL。在上述色谱和质谱条件下测 定，记录峰面积，绘制峰面积-浓度标准曲线。

根据其保留时间对应的峰面积与其浓度进行回归分析，得到线性方程：

Y=239684X+8176，R²=0.9992(异红藻糖苷)；

和

Y=112313X+155368,R²=0.9989(红藻糖苷),在范围内呈线性。

其中Y表示峰面积，X表示浓度，R²表示相关系数

3.3待测样品测定

3.3.1坛紫菜样品中红藻糖苷和异红藻糖苷的提取：取1g坛紫菜粉、5ml纯度为70% 的乙醇于三角瓶中，用铝箔纸封口，橡皮筋扎住，置于水浴摇床，120转/分，70℃水浴 6小时，取出。将溶液用多层纱布(4层纱布中间夹棉花或16层纱布)过滤，残渣用热乙 醇（60～70℃）冲洗3次,每次10～20mL，所得溶液过滤。得到的液相在5000转/分离心 10分钟，取离心溶液置于圆底烧瓶，旋转蒸干，用1ml乙腈/水(v/v1/1)溶液溶解，0.45μm 滤膜过滤，待测。

3.3.2按上述3.1的条件对处理得到的待测样品进行检测，记录峰面积。异红藻糖苷 的峰面积为2162816，代入线性方程式Y=239684X+8176，可以得出异红藻糖苷的浓度 C为9.0μg/mL。红藻糖苷的峰面积为19971942.5，代入线性方程式Y=112313X+155368， 可以得出红藻糖苷的浓度C为176.4μg/mL。待测液稀释倍数n=50倍，待测液体积为 V=1mL，紫菜干重为m=100mg，因此经计算，样品中异红藻糖苷的含量为 9.0μg/mL*1mL*50/100mg=8.7μg/mg，红藻糖苷的含量为176.4μg/mL *1mL*50/100mg=88.2μg/mg。

经计算，该样品中红藻糖苷和异红藻糖苷的含量如表1所示。

表1

4、方法的精密度

称取0.4μg，50.0μg,100.0μg红藻糖苷和异红藻糖苷混合标准品，分别用1mL乙腈 /水（v/v50/50）溶液配置，可以得到0.03μg/mL（异红藻糖苷）+0.37μg/mL（红藻糖 苷），4.0μg/mL（异红藻糖苷）+46.0μg/mL（红藻糖苷）,8.1μg/mL（异红藻糖苷） +91.9μg/mL（红藻糖苷）三个标准溶液,进行重复性测试，每个浓度取五个平行样。根 据测定结果计算精密度，结果如表2所示。

表2

5方法的回收率

称取0.4μg，50.0μg,100.0μg红藻糖苷和异红藻糖苷混合标准品，分别用1mL乙腈 /水（v/v50/50）溶液配置，可以得到0.03μg/mL（异红藻糖苷）+0.37μg/mL（红藻糖 苷），4.0μg/mL（异红藻糖苷）+46.0μg/mL（红藻糖苷）,8.1μg/mL（异红藻糖苷） +91.9μg/mL（红藻糖苷）三个标准溶液，分别添加于空白坛紫菜残渣中（经测定确定其 中不含红藻糖苷和异红藻糖苷），利用上述“坛紫菜样品中红藻糖苷和异红藻糖苷的提 取”步骤操作，进行回收率实验，每个浓度取三个平行样。根据测定结果计算回收率， 结果如表3所示。

表3

6、方法的检测限与定量限

根据仪器响应值与噪音的比值为3计算方法的检测限，异红藻糖苷的检测限为 15.8ng/mL；红藻糖苷的检测限为46.0ng/mL根据仪器响应值与噪音的比值为10计算方 法的定量限，异红藻糖苷的定量限为31.6ng/mL；红藻糖苷的定量限为91.9ng/mL。

由上述4、5和6的结果可以看出，该检测方法的稳定性好、准确性高。