淡色生赤壳菌Bo-1菌株及其培养物和在拮抗病原细菌中的应用

摘要

本发明涉及植物内生真菌淡色生赤壳菌（Bionectriaochroleuca）Bo-1菌株及其培养物和在拮抗病原细菌中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2013027，保藏日期：2013年1月18日。本发明的淡色生赤壳菌Bo-1菌株具有高效拮抗水稻白叶枯病菌的性能，同时对白色念珠菌（M.albican）、大肠杆菌（E.coli）、金黄色葡萄球菌（S.aureus）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）等病原细菌均有较强抑制作用。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术农业生产领域，尤其涉及植物内生真菌淡色生赤壳菌（Bionectria ochroleuca）Bo-1菌株及其培养物和在拮抗病原细菌中的应用。

背景技术

水稻白叶枯病是我国水稻生产中的主要病害之一，可导致水稻减20%-30%，严重时甚至颗粒无收。水稻白叶枯病又称为白叶瘟、茅草瘟、地火烧等，是由水稻黄单胞杆菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）引起的，在我国各稻区均有发生，为水稻的主要病害。现阶段的主要防治途径是化学防治，但过量施用杀枯净、噻枯唑等药剂会导致病原菌抗性增强和生态环境的严重破坏。

近几年，植物内生真菌在农业中的应用备受关注。植物内生菌是指寄生在健康植物茎干或叶片及根部，完成其全部或部分生活周期，但不形成明显侵染的一类真菌。研究发现，寄生在植物体内的内生真菌可以产生多种活性物质，如吡咯烷类生物碱、并吡咯吡嗪、麦角碱、吲哚二萜等活性物质，可以提高植物的抗病菌、抗线虫的能力，并对草食性昆虫有较强的毒性，如Shu等从栓皮栎内生镰刀菌（Fusarium spp.）中分离到2种具有拮抗细菌活性和抑制黄嘌呤氧化酶活性的脑苷脂类化合物。Rice等研究还发现，植物内生真菌不但可以分泌植物激素如赤霉素、吲哚乙酸等活性物质促进植物的生长，而且还可以提高植物的抗逆性。此外，植物内生真菌产生的次生代谢物丰富、化学结构特殊、生物活性多样以及结构类型新颖，为寻找新生物活性物质及天然药物开发和应用开辟新的途径。同时也将成为发展绿色农业，开发绿色农产品有效手段。因此，植物内生真菌具有作为新型抗菌药物筛选源的巨大潜力。

生赤壳属（Bionectria）是1999年Rossman等根据形态学及分子生物学特征将一部分丛赤壳科（Nectriaceae）菌种独立出来建立的一个属，被归类为生赤壳科（Bionectriaceae），肉座菌目（Hypocreales），子囊菌纲（Ascomycetes），子囊菌门（Ascomycota）。据相关研究报道，某些生赤壳菌（Bionectriaspp.）所产生的抗生素类物质可以对某些病原菌起特异性拮抗作用，可以抑制病原微生物的生长和繁殖，如曹晋忠从黄芩内分离出的淡色生赤壳菌N.SBA35对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、镰刀菌（Fusarium）等具有较好抑菌效果。但有关拮抗白叶枯病菌活性的植物内生真菌—生赤壳属（Bionectria）菌鲜见报道。

发明内容

针对化学农药不安全与微生物源农药种类较少的问题，本发明的第一个目的是提供一种淡色生赤壳菌（Bionectria ochroleuca）Bo-1菌株，本发明的第二个目的是提供淡色生赤壳菌Bo-1菌株发酵液及其粗浸膏，本发明的第三个目的是提供淡色生赤壳菌Bo-1菌株或该菌株的培养物用于抗病原细菌的方法，本发明的第四个目的是提供一种生物抗病原细菌制剂。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

淡色生赤壳菌（Bionectria ochroleuca）Bo-1菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2013027，保藏日期：2013年1月18日。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

淡色生赤壳菌Bo-1菌株发酵液，该发酵液由所述的淡色生赤壳菌Bo-1菌株通过利用有机碳源和氮源发酵制备得到，所述的菌株生长温度范围为10 ℃-35 ℃，pH范围为5-9。

作为优选，所述的菌株生长温度为30 ℃，pH为6.0。

作为优选，所述的有机碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和淀粉中的一种或多种；氮源选自胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉浸膏和硫酸铵中的一种或多种。

淡色生赤壳菌Bo-1菌株发酵液粗浸膏，其特征在于该发酵液粗浸膏由所述的发酵液经过过滤、萃取、然后蒸发浓缩制得。

作为优选，该发酵液粗浸膏由以下的方法制备得到：

1）挑取已纯化淡色生赤壳菌Bo-1菌株菌丝体接种到装有PD液体培养基中，于摇床上，200~250 r/min、25~30℃，振荡培养；

2）培养6~8 天后，获得发酵液；

3）所得发酵液在室温下经纱布过滤后得滤液，滤液经乙酸乙酯多次萃取，直至上层乙酸乙酯层无色为止；

4）将得到的乙酸乙酯层溶液合并，在旋转蒸发仪上蒸发浓缩至干即得粗浸膏。

为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：

淡色生赤壳菌Bo-1菌株或该菌株的培养物用于抗病原细菌的方法，但是本方法用于疾病的诊断和治疗排除在外。

作为优选，所述的病原细菌为水稻白叶枯病菌（Xanthomonas campestris pv.oryzae）、大肠杆菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Monilia albican）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、沙门氏菌（Salmonella）、志贺氏菌（Shigella）、李斯特氏菌（Listeria monocytogenes或金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）。

为了实现上述的第四个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种生物抗病原细菌制剂，该生物抗病原细菌制剂包括所述的淡色生赤壳菌Bo-1菌株或该菌株的培养物。

作为优选，所述的病原细菌为水稻白叶枯病菌（Xanthomonas campestris pv.oryzae）、大肠杆菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Monilia albican）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、沙门氏菌（Salmonella）、志贺氏菌（Shigella）、李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）或金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）。

本发明的淡色生赤壳菌Bo-1菌株具有高效拮抗水稻白叶枯病菌的性能，同时对白色念珠菌（M. albican）、大肠杆菌（E. coli）、金黄色葡萄球菌（S. aureus ）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）等病原细菌均有较强抑制作用。因此Bo-1菌株及其培养物在拮抗病原细菌中的具有广阔的应用前景。有望为新型微生物生防制剂的研发增添新的途径，为水稻白叶枯病等的生防工作推进奠定基础。

附图说明

图1 为淡色生赤壳菌（Bionectria ochroleuca）Bo-1菌株的培养特征，左：菌落正面；右：菌落反面。

图2 为淡色生赤壳菌Bo-1菌株的显微形态特征；左：分生孢子梗；右：分生孢子。

图3 为基于ITS rDNA基因序列建立的淡色生赤壳菌Bo-1菌株系统发育树。

图4 为淡色生赤壳菌Bo-1菌株发酵液粗浸膏拮抗Xoo P6生理小种抑菌圈；上：0.2%丙酮对照，左右下：100 mg/L粗浸膏。

图5 为氯霉素拮抗Xoo P6生理小种抑菌圈；左：0.2%丙酮对照，右：100 mg/L氯霉素。

图6 为淡色生赤壳菌Bo-1菌株发酵液粗浸膏拮抗白色念珠菌抑菌圈；左：0.2%丙酮对照，右：100 mg/L粗浸膏。

图7为 淡色生赤壳菌Bo-1菌株发酵液粗浸膏拮抗枯草芽孢杆菌抑菌圈；（左：0.2%丙酮对照，右：100 mg/L粗浸膏）。

图8为淡色生赤壳菌Bo-1菌株发酵液粗浸膏拮抗大肠杆菌抑菌圈；左：0.2%丙酮对照，右：100 mg/L粗浸膏。

图9 为淡色生赤壳菌Bo-1菌株发酵液粗浸膏拮抗金黄色葡萄球菌抑菌圈；（左：0.2%丙酮对照，右：100 mg/L粗浸膏）。

生物材料保藏说明

淡色生赤壳菌（Bionectria ochroleuca）Bo-1菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2013027，保藏日期：2013年1月18日。

具体实施方式

实施例1

从水稻田健康水稻叶片内部分离筛选得到一株拮抗水稻白叶枯病菌淡色生赤壳菌（B.ochroleuca）Bo-1菌株。

（一）供试植物病原菌

水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）P6生理小种。

（二）培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯（200 g），葡萄糖（20 g），琼脂（15-20 g），水（1000 mL），pH 6.0~ 6.5。

马铃薯葡萄糖液态发酵培养基（PD）：马铃薯（200 g），葡萄糖（20 g），水（1000 mL），pH 6.0~ 6.5。

改良PDA固体培养基：马铃薯（300 g），蛋白胨（5.0 g），蔗糖（15.0 g），Ca(NO₃)₂·4H₂O（0.5 g），NaHPO₄·12H₂O（2.0 g）， 琼脂（15.0 g），水（1000 mL），pH 6.0~ 6.5。

改良PD液体培养基：马铃薯（300 g），蛋白胨（5.0 g），蔗糖（15.0 g），Ca(NO₃)₂·4H₂O（0.5 g），NaHPO₄·12H₂O（2.0 g）， 水（1000 mL），pH 6.0~ 6.5。

（三）实验方法

1. 水稻内生真菌的分离

先用自来水将水稻叶片冲洗干净，并用75%的乙醇处理4 min，无菌水冲洗3次，再用2.5% 次氯酸钠处理3 min，无菌水洗涤3次，去除叶片表皮，取0.01 g放入无菌研钵中并加入10 mL无菌水研磨成匀浆，吸取0.5 mL浆液于加有青霉素（100 μg/mL）的PDA培养皿中，涂布均匀，28 ℃恒温培养。用无菌水作为对照。3 d~5 d后观察，待菌体长出后，挑取所需菌落边缘菌丝纯化培养，所得纯菌株编号（Bo-1菌株）保存于-20℃冰箱中，备用。

拮抗XooP6生理小种活性的测定

挑取已纯化Bo-1菌株菌丝接种到装有约100 mL PD液体培养基的250 mL锥形瓶中，于摇床上（220 r/min、28 ℃）振荡培养7 d后，获得Bo-1菌株发酵液。所得发酵液经纱布过滤、乙酸乙酯萃取、旋转蒸发仪蒸发浓缩至干，即得Bo-1菌株发酵粗浸膏。

采用牛津杯法测定发酵液粗浸膏对Xoo P6生理小种的拮抗活性，具体操作如下：（1）取保藏于-80 ℃冰箱Xoo P6生理小种接种于改良PD液态培养基摇床括化培养（28 ℃，120 r/min），当菌悬液浓度达到OD值0.6时，取100 μL菌液均匀涂布到PDA固体培养基上，待用。（2）把Bo-1菌株发酵液粗浸膏及氯霉素（正对照）分别用2%丙酮稀释成浓度为100 μg/mL的药液，待用。（3）采用牛津杯法测定抑菌效果，并用十字交叉法测量抑菌圈的大小。

菌株的鉴定

对Bo-1菌株进行形态学、生理生化和ITS rNDA序列鉴定，确定其种属。

（四）实验结果

1. 高拮抗XooP6生理小种Bo-1菌株的筛选

经平板涂布，分离、纯化和拮抗XooP6生理小种活性的测定，获得一株编号为Bo-1菌株植物内生真菌，其发酵液粗浸膏对XooP6生理小种具有较强抑菌活性，最大抑菌圈直径为22.4 mm（附图4），而阳性对照组氯霉素最大抑菌圈直径为23.1 mm（附图5）。

菌株的鉴定

形态特征：Bo-1菌株接种于PDA培养基上，30 ℃培养7 d后，其菌落直径约为45.5 mm，菌落呈圆形，边缘较光滑，菌丝呈絮状或绒状，浓密；培养初期，菌落正面颜色为白色，后逐渐变为粉色，最后呈橘红色；菌落背面颜色由无色逐渐转变为橘红色且有少量的辐射状沟纹；培养7 d后菌株分泌色素，使培养基变成黄绿色（附图1）。显微镜下观察：Bo-1菌株菌丝较粗，分枝较少，无色，有隔膜；分生孢子梗发生于基质或表面菌丝，孢梗茎（160 μm-400 μm）×（3.5 μm -4 μm），壁光滑或近于平滑，有的分离物则粗糙；大部分为单轮生的帚状枝，少量的双轮生（附图2）；分生孢子呈宽椭圆形或椭圆形，大小为（3.0 μm-4.5 μm）×（2.5 μm-3 μm）（附图2），有性产生闭囊壳，球形或近球形，子囊孢子球形或近球形，单细胞。

生理生化特征：菌株生长温度范围为10 ℃-35 ℃，最适温度30 ℃；适宜pH范围为5-9，最适生长pH为6.0；菌株能利用的碳源有葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉等；能利用的氮源有胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉浸膏和硫酸铵等。

ITS rDNA电泳和测序分析结果表明，其长度为542 bp，与淡色生赤壳菌（Bionectria ochroleuca）同源性达99%（附图3）。      

实施例2

淡色生赤壳菌（B. ochroleuca）Bo-1菌株发酵液粗浸膏对常见病原细菌的抑制作用。

（一）供试植物病原菌：大肠杆菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Monilia albican）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、沙门氏菌（Salmonella）、志贺氏菌（Shigella）、李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）。

（二）培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、Half Fraser肉汤培养基、缓冲蛋白胨水培养基、GN增菌液培养基。

（三）实验方法：将上述待测病原细菌分别接种于相应的液态培养基摇床（120 r/min）活化培养，当菌悬液浓度达到OD值0.6时，取100 μL菌液均匀涂布到相应的固体培养基，待用；将Bo-1菌株发酵液粗浸膏用2%的丙酮配成100 μg/mL溶液，待用；以牛津杯法分别测定抑菌效价，并用十字交叉法测量抑菌圈的大小。

（四）实验结果：Bo-1菌株发酵液粗浸膏对白色念珠菌（M. albican）、大肠杆菌（E. coli）、金黄色葡萄球菌（S. aureus ）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）均有较强抑制作用，抑菌圈直径分别为38.9 mm、26.4 mm、28.1 mm和27.6 mm（附图6、7、8、9）；对李斯特氏菌（L. monocytogenes）、沙门氏菌（Salmonella）、志贺氏菌（Shigella）作用稍弱，抑菌圈直径分别为15.1 mm、15.9 mm、14.5 mm。