虫生菌四脊裸胞壳（Emericella quadriclineata）Dh菌株生理特性、致病性和分子生物学研究

摘要

由于化学农药的大量使用对生态环境造成了严重的影响，生物防治日益受到人们的重视。虫生真菌以其安全有效，流行潜力显著，容易生产等优点，在害虫的生物防治中占有越来越重要的地位。四脊裸胞壳(Emericellaquadriclineata)Dh菌株作为虫生真菌，对尺蠖等鳞翅目害虫具较强的致病性，用其控制草地、林地生态系统中的害虫种群数量，有较广阔的应用前景。 本论文对Dh菌株生物学特性，培养条件对菌丝生长、孢子萌发的影响，胞外酶产生的特性等进行了系统深入的研究；测定了该菌株对几种害虫的致病作用及苜蓿钩麦蛾幼虫受感染后体内保护酶活性变化；利用RAPD多态性技术及rDNAITS序列分析，对Dh菌株及其相近种进行了亲缘关系和遗传性分析。主要结果如下： 1.通过对Dh菌株生物学特性测定，表明该菌株喜温，生长温度范围为15～45℃，最适温度为30℃；在pH4～8之间生长良好；孢子萌发温度范围为8～45℃，以30℃为最适；能利用葡萄糖、蔗糖等多种碳源，在可溶性淀粉、甘露醇和麦芽糖为碳源的培养基上生长最好；可利用多种氮源，尤其对尿素、氯化铵的利用最好。 2.该菌株胞外蛋白酶在粘虫虫尸培养基和明胶培养基上均可产生，在明胶—琼脂平板培养基上不同温度条件下培养3d后，用15﹪HgCl处理，菌落周围显示出清晰透明的环状，在33℃温度下产酶量达到最大值，随后减少；几丁质酶产酶高峰出现在4～5d。在含1.5×106个分生孢子/mL的PD培养液中，恒温(25℃±1℃)下振荡(120r/min)培养3.5d，产淀粉酶量最大，为272.42U/mg；培养液初始pH4～6最有利淀粉酶的产生，培养4d产酶量为1377.20～1528.99u/mg。温度和pH对淀粉酶活性的稳定性有一定的影响，在50℃，pH6.0条件下酶活性最高，在pH4～7范围内20℃下处理20min，或37℃下处理1h酶活性较为稳定，保持在65﹪以上。一定浓度的Cu2+和Ba2+有利于酶活性的提高，但Mg2+，Fe2+，Ca2+，NH4+对酶活性的抑制作用依次增强。 3.通过在液体和平板培养中研究光周期对Dh菌株菌丝生长及产孢量的影响，结果表明，①光照对液培菌丝生物量和平板培养产孢有明显的影响，长光照液培有利于菌丝生长，其菌丝生物量明显高于短光照和全黑暗；培养96h菌丝生物量最大，其中以18h光照与6h黑暗交替菌丝生物量最大，通过拟合逻辑斯蒂生长模型，也以上述组合的K值最大，菌丝生物量达35mg/ml左右，与观察值相吻合。②光照对Dh菌株平板产孢具有一定的促进作用。连续光照与各温度组合的累积产孢量显著高于连续黑暗下各温度组合。以全光照25℃培养7d产孢量最高，为31.29×107孢子/ml；从产孢速率变化可看出，25℃全光照下最适宜产孢，产孢增长率曲线呈近似的抛物线状，第3～5d时增长率达到顶点；30℃和35℃无论是光照还是黑暗条件均不适合产孢，其产孢速率呈持续下降状态。③紫外光对Dh菌株生长的影响程度与照射时间有关，25℃下，在供试范围内，照射时间越长菌落生长越慢。照射45min和60min的处理对菌落生长具明显地抑制作用。 4.在温度22℃(±2℃)和12L(光照)：12D(黑暗)条件下，Dh菌株接于PD液中进行振荡(100r/min)培养，研究不同接种量和液培养时间对菌丝生物量的影响。结果表明，将含干菌丝23.8mg/ml的母液按1﹪～15﹪(V/V)的比例接种后培养60h以上，9﹪、12﹪和15﹪接种量处理能产生30mg/ml以上的菌丝生物量，通过拟合逻辑斯蒂生长模型，发现该菌在上述液培条件下最大菌丝生物量为36mg/ml左右。 研究了5种配方的培养液对Dh菌株生长的影响，供试的5种培养液中，在含营养丰富的马铃薯蔗糖蛋白胨培养液中Dh菌株的菌丝生物量最大，其次为胡萝卜蔗糖蛋白胨培养液；在既缺蛋白胨，又缺蔗糖的面粉和玉米粉培养液中菌丝生物量最小。 5.通过氨基酸、维生素、糖类、矿物质和脂肪酸对Dh菌株孢子萌发影响的研究发现，它们均在不同程度上对Dh菌株孢子萌发有影响。供试的6种氨基酸中只有0.1﹪和1﹪的亮氨酸处理对Dh菌株孢子萌发有利，其余对孢子萌发均有抑制作用。维生素中除抗坏血酸对孢子萌发有抑制作用外其余均对孢子萌发有促进作用，其中10﹪的VB1和VB6溶液对孢子萌发具较强的刺激作用，处理36h孢子萌发率分别达98.67﹪和85﹪；1﹪的叶酸、核黄素和烟酸溶液对孢子萌发也有明显的促进作用。供试的9种糖类中，山梨糖和甘油对孢子萌发有抑制作用，1﹪的菊糖液、10﹪的半乳糖液及1﹪的麦芽糖液对孢子萌发有刺激作用，36h孢子萌发率分别达84.33﹪、76﹪和47﹪；蔗糖液在10﹪时对孢子萌发有利，而葡萄糖在0.1时有利于孢子萌发。矿物盐类中FeSO4、CaCL2、KH2PO4各浓度处理均有利于孢子萌发，在0.1﹪的FeSO4溶液中，36h萌发率高达98.67。在10﹪的CaCL2液和1﹪的KH2PO4液中，36h孢子萌发率分别为48.67﹪和70﹪。供试的脂肪酸中，只有低浓度(0.1﹪)的十六酸对孢子萌发有刺激作用，其各处理均对孢子萌发有明显的抑制作用。 6.测定了5种杀虫剂和5种杀菌剂对Dh菌株孢子萌发和菌丝生长的影响。结果表明，杀虫剂对Dh菌株的兼容性强于杀菌剂。杀虫剂中敌杀死，双甲脒，水胺硫磷对Dh菌孢子萌发和菌丝生长的影响小，混用时孢子萌发率超过80.00﹪，因此，可以与Dh菌株同时施用或混用。三唑酮，速克灵，扑海因等杀菌剂抑制了该菌孢子的萌发和菌丝生长，不能与Dh菌株同时施用或混用。 7.研究了Dh菌株对苜蓿钩麦蛾等7种害虫的室内致病作用和对沙枣尺蠖的田间防效。结果表明，用浓度为5×107孢子/ml处理苜蓿钩麦蛾幼虫，较正死亡率为40﹪，感病虫体表皮发黑，保湿后体壁上长有大量Dh菌株的菌丝、分生孢子梗和分生孢子；当浓度为1.6×108，7d对小菜蛾幼虫较正死亡率为93.8﹪，对梨尺蠖的较正死亡率52.17﹪，5d对棉铃虫较正死亡率为51.22﹪。当浓度为1.6×1010时室内对沙枣尺蠖(春尺蠖)校正死亡率达86.42﹪，田间校正死亡率达82.13﹪。该菌对供试的桃蚜和苹果全爪螨防治效果不明显。 用Dh菌株处理钩麦蛾幼虫后测定其体内的保护酶变化，结果表明：处理后的幼虫体内过氧化物酶(POD)活性和过氧化氢酶(CAT)活性出现先降低后上升趋势，但酶活性明显高于对照虫体；而SOD酶活性呈先上升后下降的波动状态，活性也高于对照虫体。 8.运用随机扩增多态DNA(RAPD)技术对Dh菌株及其相近的13株曲霉菌株进行了基因组DNA多态性分析，扩增结果表明，14条引物对所有供试菌株均能扩增出清晰的带而且重复性好。扩增得到的211个RAPD位点中，有164个多态性，多态性位点占77.73﹪。聚类分析结果表明，种间、变种间的聚类结果与形态鉴定结果趋于一致，以欧氏距离20～23为较适宜的阈值范围。 采用真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物ITS4和ITS5，PCR分别扩增了Dh菌株及其相近的5个裸胞壳菌株(无性阶段属曲霉)，并对PCR产物进行了序列测定。根据Mega3.0软件分析排列后的序列所得出的绝对遗传距离和平均遗传距离，以Neighbour-Joiningmethod法寻找到最简约系统发育树，6个裸胞壳菌可分为3个大组，Dh菌株与来自定西土壤的皱折裸胞(E.corrugata)之间的靴带支持强度为88﹪，它们之间的碱基差异为11bp，两者之间的亲缘关系相对较近；与来自张掖土壤的褶皱裸胞(E.rugulosa)的靴带支持强度为73﹪，它们之间的碱基差异为16～17bp，两者间的亲缘关系相对较远；与其它供试菌株间亲缘关系相对更远。上述结果表明对裸胞壳菌rDNAITS进行测序分析，可清晰的区分裸胞壳的形态学种。

目录

摘要

第一章绪论

第二章Dh菌株的鉴定、生物学特性及几种胞外酶活性测定研究

第三章光周期对Dh菌株离体培养的生物量及产孢量的影响

第四章初始接种量及不同培养液对Dh菌株生长的影响

第五章影响Dh菌株分生孢子萌发的生化因子

第六章化学农药对Dh菌株的影响

第七章Dh菌株对苜蓿钩麦蛾等害虫的室内防治及对钩麦蛾保护酶活性影响的研究

第八章Dh菌株及其它相关曲霉属真菌的RAPD分析及rDNAITS序列分析

第一节Dh菌株及其它裸胞壳和曲霉属真菌的RAPD分析

第二节Dh等6种裸胞壳菌株rDNAITS序列分析

第三节讨论

第九章结论、讨论及创新点

致谢

参考文献

附录 在读博士期间发表的主要论文

导师简介

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