假单胞菌菌株HF-1的尼古丁代谢途径及其分子生物学研究

摘要

本文以从堆放烟草废弃物30多年的尼古丁污染土壤中筛选获得的尼古丁高效降解菌株Pseudomonas sp.HF-1为研究材料，综合运用传统及现代分子生物学手段，全面探讨了尼古丁对典型土壤微生物的氧化应激效应，筛选获得缺失尼古丁降解功能的突变菌株，并较为系统地研究了菌株HF-1降解尼古丁的代谢途径及降解功能酶，为建立有效的尼古丁污染预警指标体系及该降解菌在尼古丁污染生物修复中的应用提供了理论依据和参考基础。本研究所获得的主要结果如下： 1．以大肠杆菌(Escherichia coli)K12、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B19等土壤典型微生物及尼古丁降解菌假单胞菌(Pseudomonas sp.)HF-1为实验材料，通过对土壤典型微生物和尼古丁降解菌的生长、活性、应激反应以及生化指标方面的影响，研究了尼古丁对微生物纯培养的生理毒性，获得如下初步结论：在实验浓度范围内，不同浓度尼古丁对对数期和稳定期假单胞菌HF-1的SOD、CATT和ATP酶活性的影响具有显著差异。不同浓度尼古丁对稳定生长期HF-1菌体的SOD和CAT活性影响较小，且一般表现为抑制作用。1.3g·L<'-1>尼古丁刺激对数生长期HF-1菌株ATPase比活力增加，而其他3个实验设置浓度(0.5 g·L<'-1>，1.0 g·L<'-1>，2.0 g·L<'-1>)都使菌株的ATPaSe比活力下降。尼古丁对稳定期的HF-1菌株ATPase比活力呈现出强烈的抑制作用，且浓度越大，抑制作用越强，呈现出显著的浓度-效应关系。尼古丁对三种实验菌株的SOD、CAT酶活性均有不同程度的诱导作用，但对尼古丁降解菌株HF一1的诱导作用弱于其他2种非尼古丁降解菌株。将微生物体内SOD、CAT和ATPase酶活性作为环境受到尼古丁污染胁迫的分子指标具有一定可行性。 2．从经丝裂霉素C反复处理的HF-1菌株中筛选获得1株缺失尼古丁降解功能的突变菌株6-13。突变菌株6-13与出发菌株HF-1在菌落形态及菌体形状上都极为相似，2个菌株的SDS-PAGE全细胞蛋白质电泳图谱也基本相同。经Blast比对，突变菌株6-13与Pudomonasputida 16S rDNA的序列同源性达到100％，基本上可以确定菌株6-13为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)。抗生素敏感性试验表明尼古丁降解菌株HF-1及突变菌株6-13对于胺卡那霉素、头孢菌素、硫酸庆大霉素等抗生素敏感，而对氯霉素、氨苄青霉素、青霉素钠、克林霉素、红霉素及先锋霉素等抗生素具有抗性。用碱裂解法成功地从降解菌株HF-1及缺失尼古丁降解功能的突变菌株6-13中提取到大小为19kb左右的质粒，初步表明这个质粒可能与尼古丁降解无关。 3．尼古丁的微生物降解研究结果表明，假单胞菌HF-1可在21h内降解培养基中99.6％终浓度为1.0 g·L<'-1>的尼古丁，对数生长期菌体的生长与尼古丁降解之间存在显著的相关性。同时，培养基pH在菌株生长和尼古丁降解过程中基本保持恒定。菌株HF-1在应用微生物技术处理烟草废弃物方面具有较强的潜力。 利用GC-MS和LC-MS检测HF-1菌株的尼古丁代谢中间产物发现，假单胞菌HF-1代谢尼古丁的途径与已知的假单胞菌尼古丁代谢途径存在明显差异，而与尼古丁在哺乳动物中的代谢过程比较相似。除检测到其他假单胞菌中未曾报到的尼古提林、脱甲基尼古丁、可铁宁、麦斯明等物质外，且没有发现其他假单胞菌株的尼古丁代谢产物N-甲基麦斯明，同时形成一种从未报道过的、淡绿色的代谢产物。这一切均表明假单胞菌HF-1可能以一条新的代谢途径进行尼古丁降解。利用制备型液相色谱分离得到4种尼古丁代谢产物，分离峰保留时间分别为3.6-5.0，5.6-6.7，7.5-8.4和10.2-10.9 min。后3个样品在负离子模式下进行ESI-MS分析，测得3种物质的分子量分别为179Da、195Da和487Da，其中分子量为179Da和195Da的代谢产物初步鉴定为3-琥珀酰吡啶和6-羟基-3-琥珀酰吡啶。这2种尼古丁代谢中间产物的存在表明自3-琥珀酰吡啶开始菌株HF-1降解尼古丁的途径与已知假单胞菌的尼古丁代谢途径相似。6-羟基-3-琥珀酰吡啶在Pseudomonas sp．HF-1中的去向尚有待于进一步研究。 4．利用双向电泳及生物质谱技术研究了尼古丁诱导条件下菌株HF-1的蛋白质表达图谱，并对尼古丁诱导的特异性蛋白进行了鉴定。研究表明，菌株HF-1在尼古丁胁迫条件下新诱导合成65个特异性蛋白。实验切取22个特异性蛋白质点，利用：MALDI-TOF/TOF-MS和ESI-MS进行了蛋白质的鉴定。根据蛋白质某一方面的主要功能，可以将尼古丁诱导表达的22个蛋白分为氨基酸合成、能量代谢、蛋白折叠、脱毒和热激蛋白、尼古丁代谢相关及其他功能蛋白等5大类。 菌株HF-1诱导表达了一系列氨基酸合成相关蛋白(Omithine carbamoyltransferase．Thiolase等)、ATP合成相关蛋白(Succinate dehydrogenase，Maleate cis-trans isomerase等)、解毒蛋白及运输蛋白(Hsp20 family，Catalase，Superoxide dismutase等)等蛋白来应激尼古丁的胁迫，减少尼古丁对菌体细胞的伤害。 尼古丁胁迫条件下菌株HF-1诱导表达了一种内酰胺酶(metallo-beta-lactamase)和一种水解酶(hydrolase，an amidase related to nicotinamidase)，这两种酶的诱导表达表明菌株HF-1可能沿着与哺乳动物代谢尼古丁相同的途径将尼古丁转化成为3-琥珀酰吡啶(4-OXO-4-(3-pyridyl)-butanaoic acid)。尼古丁代谢形成3-琥珀酰毗啶后菌株HF-1沿着已知假单胞菌尼古丁降解途径进一步代谢，经过琥珀酸、2，5-二羟基吡啶、马来酸等物质生成富马酸后进入三羧酸循环。此外，硝基还原酶的鉴定暗示菌株HF-1可能以多条途径进行尼古丁的降解。

目录

文摘

英文文摘

第一章文献综述

1.1尼古丁及其理化性质

1.2尼古丁的污染现状

1.2.1烟草生产及其废弃物污染

1.2.2其他形式的尼古丁污染

1.3尼古丁对人体的影响

1.4尼古丁的微生物降解

1.4.1降解尼古丁的微生物种类

1.4.2微生物代谢尼古丁的途径

1.4.3尼古丁微生物降解中的酶系

1.4.4尼古丁微生物降解的分子生物学研究

1.4.5尼古丁降解微生物的应用

1.5微生物蛋白质组学

1.5.1蛋白质组学的核心技术

1.5.2微生物蛋白质组学研究进展

1.6本研究的目的、意义及主要内容

1.6.1研究的目的和意义

1.6.2研究的主要内容

第二章尼古丁对典型细菌的氧化应激反应研究

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1仪器及试剂

2.2.2供试菌株

2.2.3培养基

2.2.4实验设计及研究方法

2.2.5数据处理

2.3结果与讨论

2.3.1不同浓度尼古丁对菌株HF-1 SOD酶活性的影响

2.3.2不同浓度尼古丁对菌株HF-1 CAT酶活性的影响

2.3.3不同浓度尼古丁对菌株HF-1 ATP酶活性的影响

2.3.4尼古丁对HF-1菌株、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌SOD活性的影响

2.3.5尼古丁对HF-1菌株、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌CAT活性的影响

2.3.6尼古丁对HF-1菌株、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌ATPase活性的影响

2.3.7 PAGE活性染色法观察尼古丁对细菌SOD酶组成的影响

2.4小结

第三章尼古丁降解功能缺失菌株的筛选及其生理特性研究

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1仪器及试剂

3.2.2供试菌株

3.2.3培养基

3.2.4实验设计及研究方法

3.3结果与分析

3.3.1 Pseudomonas sp.HF-1质粒DNA的提取及检测

3.3.2尼古丁降解功能缺失菌株6-13的获得

3.3.3菌株HF-1与6-13的形态学比较

3.3.4菌株HF-1与6-13抗生素敏感性试验

3.3.5突变菌株6-13质粒的提取及验证

3.3.6菌株HF-1及突变株6-13基因组DNA提取

3.3.7突变菌株6-13 16S rDNA序列测定及系统发育分析

3.3.8菌株HF-1及突变株6-13全细胞蛋白质电泳图谱比较

3.4小结

第四章Pseudomonas sp.HF-1的尼古丁降解特性及代谢途径研究

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1仪器及试剂

4.2.2供试菌株

4.2.3培养基

4.2.4实验设计及研究方法

4.3结果与分析

4.3.1菌株HF-1降解尼古丁的动力学特征

4.3.2菌株HF-1降解尼古丁的代谢中间产物的测定

4.3.3菌株HF-1尼古丁代谢的可能途径

4.4小结

第五章Pseudomonas sp.HF-1降解尼古丁的蛋白表达图谱研究

5.1引言

5.2材料与方法

5.2.1仪器及试剂

5.2.2供试菌株

5.2.3培养基

5.2.4实验设计及研究方法

5.3结果与分析

5.3.1尼古丁诱导的全细胞蛋白SDS-PAGE电泳

5.3.2双向电泳研究尼古丁诱导表达蛋白

5.3.3蛋白质的鉴定

5.3.4菌株HF-1降解尼古丁的代谢途径

5.4小结

第六章研究结论与展望

6.1全文主要研究结论

6.2论文的创新之处

6.3论文不足与展望

参考文献

致谢