包含含有至少一个CXXC基序的多肽和异源抗原的药物组合物及其用途

摘要

本发明涉及使用包含至少一个CXXC基序的多肽(如贾第虫寄生虫的可变表面蛋白质(VSP)或其片段)以通过口服或粘膜接种而引起对抗所选择的异源抗原如肿瘤抗原、微生物抗原或其它抗原的免疫应答的药物组合物。

说明书

发明领域

本发明涉及药物组合物，及使用该药物组合物在受试者中产生、 改变或调节免疫应答的方法。

本发明更具体地涉及使用包含至少一个CXXC基序-如贾第虫 (Giardia)寄生虫的可变表面蛋白(variable surface protein)(VSP)或 其片段(例如，贾第虫VSP或其片段的胞外域)-的多肽通过口服或 粘膜接种产生对抗选择的异源抗原-如肿瘤抗原、微生物抗原或其它 抗原-的免疫应答的药物组合物。

发明背景

本领域中已经提出了在受试者中引起免疫应答的各种策略，如抗 原的直接施用、体外刺激和免疫细胞(例如，T淋巴细胞或树突状细 胞)的扩增、注射遗传修饰或化学修饰的肿瘤细胞、施用灭活的病毒 和使用编码特定抗原或细胞因子的核酸的基因治疗。

虽然这些不同的方法允许产生对某些类型的抗原或病原体物质 的免疫应答，但仍然需要引发、调节或刺激免疫应答的更好方法。特 别地，需要产生针对多种抗原(如肿瘤抗原、病毒抗原或源自病原体 物质的其它抗原)的有效的免疫应答(如有效的细胞和/或体液免疫应 答)的简单方法，最特别地，通过口服施用进行的方法。

事实上，如今可得到的大多数商业的疫苗是通过注射递送的，具 有安全性、病人的接受程度和致病率的问题，且这使得大规模免疫接 种更昂贵和不够安全，特别是在资源贫乏的发展中国家。因此，口服 递送比其它施用途径具有许多显着的优势，特别是相比肠胃外疫苗 (简单的施用和更高的安全性)。此外，不像全身免疫，口服递送可 以诱导粘膜免疫应答。

因此，口服递送的疫苗是通过消化道的免疫系统(通常称为肠道相 关淋巴组织(GALT))加工和呈递的。GALT是由通过自导系统(homing  system)连接的诱导位点(在遇到抗原和启动应答的情况中)和效应位 点(在发生局部免疫应答的情况中)组成的复杂系统，从而通过在 GALT中的抗原激活的细胞迁移至循环系统，并随后迁移至粘膜 (Lavclle等；2006)。结果，口服疫苗可以在肠道中和在远方粘膜位 点局部诱导免疫应答，以及全身的体液和细胞免疫应答。口服疫苗通 常产生大量的在粘膜防御中发挥了主要作用的分泌型IgA(sIgA)。

然而，即使疫苗递送的口服途径代表了递送预防性和治疗性疫苗 的理想手段，提供了优于全身递送的显著优势，口服途径也是最困难 的，因为胃肠道造成了众多障碍。为了促进肽和蛋白质疫苗的有效免 疫，必须保护抗原、增强吸收和激活先天免疫应答。因此，众多的递 送系统和佐剂已为用于口服疫苗递送而进行评估，包括活载体、惰性 颗粒和细菌毒素。然而，到现在为止口服疫苗的发展仍是令人失望的， 因为还没有通过单独使用蛋白质或病毒样颗粒(VLP)获得有效的口 服免疫。

因此，仍需要通过口服或粘膜施用引发、调节或刺激免疫应答的 更好方法，如针对各种抗原如肿瘤抗原、病毒抗原或来自病原体物质 的其它抗原的高效率的细胞和/或体液免疫应答。

发明概要

现在本发明提供了这样一种新型的、替代的和改进的通过口服或 粘膜施用在受试者中引发、调节或刺激免疫应答的方法。

本发明更特别地基于通过口服或粘膜施用使用含有至少一个 CXXC基序(其中C代表半胱氨酸残基和X代表任何氨基酸残基)的多 肽，如贾第虫寄生虫的可变表面蛋白(VSP)或其片段(例如，贾第 虫VSP或其片段的胞外域)，以引起针对选择的抗原的免疫应答， 特别是细胞和/或体液免疫应答的新概念，从而治疗或预防受试者中由 这种选择的抗原引起的疾病。

本发明还公开了包含载体颗粒和/或融合蛋白的相关药物组合物， 其制备方法和用途，其允许通过口服或粘膜施用产生针对抗原的改善 的免疫应答。

在第一个方面，本发明因此涉及药物组合物，该组合物至少包含：

-包含至少一个CXXC基序的多肽，其中C代表一个半胱氨酸 残基和X代表任何氨基酸残基，和

-异源抗原。

在第二个方面，本发明涉及一种融合蛋白，其包含含有至少一个 如上所定义的CXXC基序且保持附着于肠道上皮细胞的能力的多肽 和异源抗原。

在第三个方面，本发明涉及与载体颗粒结合的包含至少一个如上 所定义的CXXC基序且保持附着于肠道上皮细胞的能力的多肽。

在第四个方面，本发明涉及用于治疗或预防受试者的疾病、紊乱 或生理状况的药物组合物。

在第五个方面，本发明涉及使用包含至少一个如上所定义的 CXXC基序的多肽如贾第虫VSP或其片段作为异源抗原的载体用于 呈递和接种、尤其是口服或粘膜接种的用途。

发明详述

本发明第一次证明了包含至少一个CXXC基序(其中C代表半胱 氨酸残基和X代表任何氨基酸残基)的蛋白质或多肽，如贾第虫可变 表面蛋白(VSP)(例如，贾第虫VSP或其片段的胞外域)，可以通 过口服途径被用作候选疫苗抗原的载体以诱导保护性免疫。此外，本 发明证明，这种多肽如VSP的胞外域(其耐受蛋白酶、不同的pH值 和能够附着于肠道上皮细胞)可用于形成适合口服施用的病毒样颗粒 (VLP)。

定义

在整个说明书中使用和在下面的段落中定义了几个术语。

如本文所使用的术语“免疫原性的”是指引发、导致、刺激或调 节免疫应答或反应的产物、组合物或方法。因此，免疫原性的组合物 是在受试者中或在体外改变免疫系统活性的任何组合物。这包括保护 性免疫应答、细胞免疫应答、抗体应答、中和免疫应答、抗体水平的 改变、免疫细胞水平的改变，等等。

如本文所使用的术语“抗原”是指当被MHC分子加工和呈递时， 能够被抗体或被T细胞受体(TCR)特异性结合的分子。本文所使用 的术语“抗原”还包括T-细胞表位。另外，抗原能够被免疫系统识别 和/或能够诱导导致B-和/或T-淋巴细胞活化的体液免疫应答和/或细 胞免疫应答。然而，至少在某些情况下，这可能需要该抗原包含或连 接到Th细胞表位和在佐剂中给出，或需要该抗原按照本发明进行呈 递。抗原可以具有一个或多个表位或抗原性位点(B-和T-表位)。如 本文所使用的术语“特异性结合”意在指出该抗原将通常以高度选择 性的方式优先与其对应的抗体或TCR反应，而不与可能被其它抗原 诱发的大量的其它抗体或TCR反应。

如本文所使用的术语“表位”是指在动物，优选地是哺乳动物， 和最优选地人体内具有抗原性或免疫原性活性的多肽或非肽分子的 连续的或不连续的部分。表位在MHC分子的环境中通过其T细胞受 体由抗体或T细胞识别。如本文所使用的“免疫原性表位”被定义为 如通过本领域中已知的任何方法所确定的在动物中引发抗体应答或 诱导T细胞应答的多肽或非肽分子的部分。如本文所使用的术语“抗 原性表位”被定义为如通过本领域中已知的任何方法所确定的，抗体 可以免疫特异性地结合于其抗原的蛋白质或非肽分子的部分。免疫特 异性结合不包括非特异性结合，但不一定排除与其它抗原的交叉反 应。抗原性表位不一定是免疫原性的，抗原性的表位也可以是T细胞 表位，在这种情况下，它们可以在MHC分子的环境中通过T细胞受 体免疫特异性地结合。

如本文所使用的术语“异源抗原”是指相对于寄生虫贾第虫(特 别是蓝氏贾第虫(Giardia lamblia))或如本发明的上下文中所定义的其 它微生物为异源的抗原，且因此这样的异源抗原不是来源于该寄生虫 贾第虫或所述的其它微生物。因此在本发明的上下文中，术语“异源 抗原”包括植物抗原、动物抗原、寄生虫抗原(例如，源自贾第虫的 抗原以外的寄生虫抗原)、细菌抗原、病毒抗原、肿瘤抗原、自体抗 原或化学分子。然而，应该指出，如果本发明的多肽来源于另一微生 物，例如，四膜虫属(Tetrahymena)、草履虫属(Paramecium)、 内阿米巴属(Entamoeba)，则所述的异源抗原可以源自贾第虫。

如本文所使用的术语“贾第虫”或“贾第虫寄生虫”是指在一些 脊椎动物的小肠中定殖和繁殖从而引起贾第虫病的后滴门 (Metamonada)的厌氧带鞭毛的原生动物寄生虫的属。在世界范围内， 贾第虫病在粪便-口腔卫生差的人群中是常见的，且主要的传染途径 包括污染的水源或性行为。带鞭毛的贾第虫滋养体附着到小肠上皮细 胞(即肠黏膜的表面)，在那里它们可以引起疾病而不会触发明显的 炎症反应(Rivero等，2010)。没有已知的毒性因子或毒素且表面蛋 白质的可变表达使得其能够逃避宿主免疫应答和适应于不同的宿主 环境(Rivero等，2010)。它们的生命周期在主动游泳的滋养体和感 染性的、抗性包囊之间交替。贾第虫寄生虫感染人类，但也是一种最 常见的感染猫、狗和鸟的寄生虫。哺乳动物宿主也包括牛、海狸、鹿 和绵羊。因此，术语“贾第虫”包括不同的物种，包括蓝氏贾第虫和 鼠贾第虫(Giardia muris)。

如本文所使用的术语“蓝氏贾第虫”(也称为肠贾第虫(Giardia  intestinalis)或十二指肠贾第鞭毛虫(Giardia duodenalis))是指最常见 的人类肠道寄生虫之一。蓝氏贾第虫是在美国最常见的寄生原生生 物，在美国其发病率可高达0.7％(Hlavsa等，2005)。

如本文所使用的术语“可变表面蛋白”或“VSP”指覆盖贾第虫 寄生虫的整个表面的多肽，且是被宿主免疫系统识别的主要抗原。 VSP是具有频繁的CXXC基序(其中X是任何氨基酸)的富含半胱 氨酸的蛋白质，其具有几种特定的特性，包括在某些VSP中存在CXC 基序、贾第虫特异性的锌指基序和GGCY基序，(Nash，2002；Adam 等，2010)。更准确地说，VSP是大小从20到200kDa不等的1型 整合膜蛋白，具有可变的氨基末端富含半胱氨酸的区域(代表宿主/ 寄生虫界面并赋予蛋白质抗蛋白水解消化和低pH值的抗性的胞外 域)和保守的羧基末端区域(其包括疏水的跨膜区域和免疫系统“看 不到的”只含有5个氨基酸的短胞质尾部(CRGKA))。如Nash(1997) 中所描述的，各个寄生虫的表面上在任何给定的时间只有一个VSP 表达。在本发明的上下文中，术语“可变表面蛋白”意在包括完整集 合的贾第虫VSP(特别是蓝氏贾第虫)的任何可变表面蛋白。实际上， 如在Morrison等(2007)和Adam等(2010)中所描述的，贾第虫寄 生虫对于A型来说编码大约200个编码VSP的基因的集合，且Svard 的小组的两个报告描述了源自B和E型的群的VSP全部集合 (Jerlstrom-Hultqvist等，(2010)和Franzen等，(2009))。VSP 的胞外域允许寄生虫生存在上部小肠的恶劣环境中。VSP对变化的 pH值(与针对特定VSP的单克隆抗体(mAb)的构象表位的反应性 在pH值2和12之间保持不变)及胰蛋白酶和其它几种蛋白酶的消化 具有非常高的抗性。此外，VSP在滋养体附着到肠黏膜上后保持与肠 黏膜的粘附(Rivcro等，2010)。

必须进一步指出，包含至少一个CXXC基序(其中C代表半胱氨 酸残基和X代表任何氨基酸残基)的多肽，如贾第虫VSP或其它微生 物的VSP-样蛋白质也可以在体外通过遗传操作产生和在异源系统中 产生。因此，也包括化学产生或细胞产生的多肽，包括那些具有在野 生型的寄生虫中不存在的氨基酸变异的多肽(例如贾第虫VSP的变 体)。因此，VSP可以由任何本领域公知的方法制备，如固相合成、 液相合成或基因工程。

本发明的VSP可任选地包含化学修饰。化学修饰的目的是获得具 有对抗体内酶降解的更高保护和/或增加的跨膜屏障能力的蛋白质，从 而增加其半衰期和维持或改善其生物活性。根据本发明可以采用本领 域中已知的任何化学修饰。这样的化学修饰包括，但不限于：

-蛋白质的N-末端和/或C-末端的末端修饰，例如N-末端酰化(优 选乙酰化)或脱氨，或C-末端羧基基团变为酰胺或醇基团的修饰；

-两个氨基酸之间酰胺键的修饰：连接两个氨基酸的酰胺键的氮 原子或α-碳原子处的酰化(优选乙酰化)或烷基化(优选甲基化)；

-连接两个氨基酸的酰胺键的α碳原子处的修饰，例如连接两个 氨基酸的酰胺键的α碳原子处的酰化(优选乙酰化)或烷基化(优选 甲基化)；

-手性变化，如用相应的D-对映体代替一个或多个的天然存在的 氨基酸(L-对映体)；

-用相应的D-对映体代替一个或多个的天然存在的氨基酸(L-对 映体)的逆向反转，以及氨基酸链的反转(从C-末端到N-末端)； 和/或

-其中一个或多个的α-碳被氮原子所取代的氮杂肽(azapeptide)。

如本文所使用的术语“蛋白质”或其可互换使用的术语“多肽” 指由酰胺键(也被称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)所组成的分 子。也包括多肽的转译后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等。 术语“蛋白质”或“多肽”还包括变体，其中应包含任何包含或者可 选择地或优选地由与该多肽的序列具有超过70％，优选地超过80％， 甚至更优选地超过90％，再更优选地超过95％，和最优选地超过97 ％的氨基酸序列同一性的任何天然的或遗传工程的多肽所组成的多 肽。产生多肽的变体的优选方法是通过基因工程，优选地通过插入、 置换、缺失或其组合。根据本发明，当术语“蛋白质的变体”应用于 抗原时，这种变体应该能够在体内诱导产生抗体或刺激T细胞。根据 本发明，当术语“蛋白质的变体”应用于贾第虫VSP或其它微生物 的VSP样蛋白质时，该变体应该能够保持附着于细胞，尤其是粘膜 细胞，更特别是肠道上皮细胞且最终本身诱导免疫应答的能力。

如本文所使用的，根据本发明，当术语“蛋白质的片段”应用于 VSP时，或其可互换使用的术语“多肽的片段”，这样的片段应包括 包含可选择地或优选地由如本文所定义的蛋白质、多肽或抗原的至少 5、6、7、8、9、10、11、12、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、25、30、40、50、100、150、200、300、400、500个连续的或不 连续的氨基酸所组成的任何多肽，以及与其具有超过65％、优选地超 过80％，更优选地超过90％，和甚至更优选地超过95％的氨基酸序 列同一性的任何多肽。根据本发明，当术语“蛋白质的片段”应用于 抗原时，这样的片段应该能够在体内诱导产生抗体或刺激T细胞。因 此，蛋白质的片段应该包含至少一个免疫原性表位。根据本发明，当 术语“蛋白质的片段”应用于贾第虫VSP或其它微生物的VSP样蛋 白质时，这样的片段应该能够保持附着于细胞，尤其是粘膜细胞，更 特别是肠道上皮细胞和最终本身诱导免疫应答的能力。

如本文所使用的术语“结合的”是指可以共价的(例如，通过化学 偶联)或者非共价的(例如，离子相互作用、疏水相互作用、氢键等)。 共价键可以是，例如，酯键、醚键、磷酸酯键、酰胺键、肽键、酰亚 胺键、碳-硫键、碳-磷键，等等。该术语还包括物质(例如异源抗原) 的封装(enclosement)或部分封装。术语“结合的”比例如术语“偶联 的”、“融合的”、“封闭的”、“包装的”、“假型的”、“在脂 质双层中表达”和“附接的”宽并包含这些术语。

如本文所使用的术语“融合”是指通过不同来源的氨基酸序列的 编码核苷酸序列的框内组合，不同来源的氨基酸序列组合在一个多肽 链中。必须指出，由于遗传密码的简并性，多于一种核苷酸序列可以 编码一种给定的氨基酸序列。术语“融合”明确地包括内部融合(即 除了融合到其一个末端外，不同来源的序列插入到多肽链内)。

如本文所使用的术语“偶联物”是指(a)贾第虫VSP或其片段 与(b)有机分子(例如，由非蛋白质抗原组成的异源抗原)之间偶 联的产物，其中元件(a)和(b)彼此结合。这样的元件(a)和(b) 可以例如通过接头而结合。

如本文所使用的术语“连接序列”或可互换使用的术语“接头” 是指共价连接蛋白质或非蛋白质抗原(如尼古丁分子)与多肽以及连接 载体颗粒与多肽的分子实体。例如该接头可以包含硫醇基、烷基、二 醇基或肽基。接头包括交联分子，且一些实例列举在WO 2004/009116 号国际专利申请公开中，其在本文中通过引用引入。

如本文所使用的术语“载体颗粒”表示倾向于在其表面上呈现贾 第虫VSP或其片段和/或异源抗原的任何颗粒。在本发明的上下文内， 术语“载体颗粒”意在包括病毒载体颗粒、病毒样颗粒(VLP)和纳 米颗粒。

如本文所使用的术语“病毒载体颗粒”是指病毒的形态学形式。 在某些病毒类型中，其包含被蛋白质衣壳包围的基因组；其它类型具 有另外的结构(如包膜、尾等)。

如本文所使用的术语“病毒样颗粒”(VLP)是指类似于病毒颗 粒的结构。根据本发明的病毒样颗粒是非复制性的，因为它缺乏全部 或部分的病毒基因组，通常和优选地缺乏病毒基因组的全部或部分的 复制性和传染性成分。如本文所用的术语“非复制性的”是指不能复 制包含在或不在VLP中的基因组。

本发明的药物组合物

在第一个方面，本发明涉及一种药物组合物，优选为免疫原性的， 其至少包含：

-包含至少一个CXXC基序的多肽，其中C代表半胱氨酸残基和 X代表任何氨基酸残基，以及

-异源抗原。

当本发明的药物组合物被施用给个体时，它可以是包含盐、缓冲 剂、佐剂、载体或理想的用于改善组合物的疗效的其它物质的形式。 适于在制备药物组合物中使用的药用材料的实例提供在许多来源中， 包括REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Osol，A，编辑， Mack Publishing Co.，(1990))。“药用的”或“药学上可接受的”是指 在适当情况下，当施用给哺乳动物特别是人时不产生不利的、变态的 或其它不良反应的分子实体和组合物。药学上可接受的的载体或赋形 剂是指非毒性的固体、半固体或液体的填充剂、稀释剂、包封材料或 任何类型的制剂助剂。

此外，药物组合物可以包含另外的佐剂或者免疫原性或生物活性 剂。然而，在一个优选的实施方式中，该药物组合物没有佐剂，因为 本发明的一个有利特征是组合物的高免疫原性，即使在没有佐剂的情 况下。此外，不存在佐剂最大限度地减少不需要的炎性T-细胞应答， 这是免疫接种中的安全性问题。

本发明的药物组合物优选配制用于口服或粘膜施用。用于口服或 粘膜施用的剂量可以随各种参数而适应性调整，且特别是随有关的病 理模式或者可选择地所需的治疗持续时间而调整。

该药物组合物可以施用于任何合适的粘膜，且该施用包括口服 (通过消化系统的粘膜)、经鼻、阴道、舌下、眼、直肠、尿道、乳 房内、肺、经耳(即通过耳)和口腔施用，优选地口腔或舌下施用(口 粘膜(oromucosal)施用)。

在制剂时，药物组合物将以与剂型相容的方式和以治疗有效的量 施用。该制剂很容易以各种剂型施用，例如片剂或用于口服或粘膜施 用的其它固体的类型；缓释胶囊；和目前使用的任何其它形式。因此， 该药物组合物可以是喷剂、气雾剂、混合物、悬浮液、分散液、乳剂、 凝胶剂、糊剂、糖浆剂、霜剂、软膏、植入物(耳、眼、皮肤、鼻、 直肠和阴道)、乳房内制剂、阴道塞剂、栓剂或子宫剂(uteritories)的 形式。在某些实施方式中，设想使用脂质体。脂质体的制剂和使用是 本领域的技术人员已知的。

如前面所提到的，在优选的实施方式中，药物组合物适合于口服 施用。

更特别地，药物组合物配制为使得异源抗原和多肽在必要时对上 胃肠道的酶降解和化学降解具有抗性。此外，应该注意，该多肽应该 能够附着于细胞，更特别是肠道上皮细胞。因此，在一个实施方式中， 该多肽能够附着于肠道上皮细胞，且该组合物被配制为使得异源抗原 和多肽在必要时对上胃肠道的酶降解和化学降解具有抗性。

在一个实施方式中，该多肽由包含至少两个间隔至少2个氨基酸 的CXXC基序的多肽组成。

因此，该两个CXXC基序由含有3至20个氨基酸，优选为5至 8个氨基酸的氨基酸序列分隔。

应该注意，分隔该至少两个CXXC基序的氨基酸可以是任何氨基 酸残基。

在另一个实施方式中，该多肽包含1到10个CXXC基序、1到 20个CXXC基序、1到30个CXXC基序、1到40个CXXC基序、1 到50个CXXC基序、1到60个CXXC基序、1到70个CXXC基序、 1到80个CXXC基序、1到90个CXXC基序或1到100个CXXC基 序。

因此，该多肽可以包含例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 或70个CXXC基序。

在一个特定的实施方式中，如上文所定义的多肽是微生物的可变 表面蛋白(VSP)、VSP样蛋白质或其片段。

因此，该微生物优选地选自于贾第虫、四膜虫、草履虫和内阿米 巴虫属的种。

在一个优选的实施方式中，该多肽是贾第虫VSP或其片段的胞外 域(因为所述的胞外域是包含贾第虫VSP蛋白的多个CXXC基序的 氨基末端富含半胱氨酸的区域)。

事实上，贾第虫VSP的胞外域是抗pH值、温度和蛋白水解消化 的结构域。

因此，在另一个优选的实施方式中，根据本发明的多肽仅包含贾 第虫VSP或其片段的胞外域。从而去除了贾第虫VSP的跨膜区和胞 质尾部。

应该注意，肽信号也可以被移除。

可变表面蛋白(VSP)

因此，可变表面蛋白(VSP)或其片段可以选自在寄生虫的基因 组中在DNA水平上编码的VSP的全部集合。该集合由约200个在不 同的贾第虫隔离群中变化的同源VSP-编码基因(vsps)构成。应该进 一步注意，VSP的变体也可以在根据本发明的组合物中使用。

如上面所提到的，贾第虫VSP和更特别地贾第虫VSP的胞外域 包含多个CXXC基序，优选由几个氨基酸、3至20个氨基酸和更特 别地5至8个氨基酸分隔的多个CXXC基序(如由多序列比对观察到 的)。

在特定的实施方式中，贾第虫寄生虫是蓝氏贾第虫。

在优选的实施方式中，贾第虫VSP选自于蓝氏贾第虫的 VSP9B10、VSP1267、VSPA6、VSPS1、VSPS2、VSPS3、VSPS4、 VSPS5、VSPS6、VSPS7、VSPS8、VSPAS1、VSPAS2、VSPAS3、 VSPAS4、VSPAS5、VSPAS6、VSPAS7、VSPAS8、VSPAS9、VSPAS10、 VSPAS11、VSPAS12和VSPH7。

VSP样结构域

因此，VSP样结构域或其片段可以选自源自贾第虫以外的微生物 而与贾第虫具有共同的序列同源性和生化特性的多肽，且特别是包含 多个CXXC基序，优选由5至8个氨基酸分隔的多个CXXC基序的 多肽。事实上，VSP1267序列(查询)与其它VSP样分子序列(从分析 中除去贾第虫的BLASTP后由结构域结架中得出的)的胞外域比对已 经导致观察到在属于草履虫、四膜和内阿米巴虫属的种的蛋白质中多 个CXXC基序的存在，特别是由5至8个氨基酸分隔的。因此，内阿 米巴种的表面激酶以及草履虫种和四膜虫种的表面蛋白的初级序列 的代表性片段预测，在VSP样结构中包含CXXC基序的保守结构域 (与贾第虫VSP 1267、9B10和H7相比)负责对于pH值、温度和蛋 白水解消化的抗性。

在一个实施方式中，四膜虫微生物是嗜热四膜虫(Tetrahymena  thermophila)。

在另一个实施方式中，内阿米巴微生物是痢疾阿米巴(Entamoeba  histolytica)。

在另一个实施方式中，草履虫微生物是第四双小核草履虫 (Paramecium tetraurelia)。

异源抗原

异源抗原可以由一种天然存在的抗原或其部分组成，其中该天然 存在的抗原的部分包含或者可选地由至少一个免疫原性表位组成。天 然存在的抗原是指存在于自然界中的抗原，优选存在于有机体，如植 物、动物、寄生虫、细菌或病毒中的抗原。

因此，在优选的实施方式中，异源抗原选自于植物抗原、动物抗 原、寄生虫抗原、细菌抗原、病毒抗原、自身抗原、肿瘤抗原或化学 分子。

因此，在本发明的一个优选的实施方式中，异源抗原是一个非自 (或外来的)蛋白质抗原、其片段或变体。

包括的示例性的非自身蛋白质抗原包括细菌蛋白质抗原、病毒蛋 白质抗原、寄生虫蛋白质抗原、肿瘤蛋白质抗原、支原体蛋白质抗原 和变应原蛋白质抗原。

必须进一步指出，异源抗原可以由载体颗粒本身构成，当所述的 颗粒(例如，如下所述的病毒样颗粒(VLP))源自病毒或包含免疫 意图对抗的病毒的部分时。比如，在颗粒源自于人类免疫缺陷病毒 (HTV)的情况中，所述颗粒可以构成异源抗原。

在本发明的另一个优选的实施方式中，异源抗原是自身蛋白质抗 原、其片段或变体。

事实上，疾病，特别是自身免疫性疾病和慢性炎症性疾病可以由 自身蛋白质抗原的生产过剩或功能障碍引起。

可考虑的示例性自身蛋白抗原包括细胞因子、白细胞介素、激素、 生长因子和受体。

而在另一个优选的实施方式中，异源抗原是非蛋白质抗原。

可考虑的示例性非蛋白质抗原包括多糖抗原、脂质抗原、核酸抗 原、脂多糖抗原和化学分子例如药物。

典型的药物，包括滥用药物和治疗药物这两者、生物碱如尼古丁、 类固醇、毒素碳水化合物、芳族化合物(包含许多污染物)和其它可以 引起针对其的免疫应答的化合物。

示例性的异源抗原(蛋白质或非蛋白质抗原)包括，但不限于， 国际专利申请WO 2006/02674中描述的那些。

在一个实施方式中，该多肽与异源抗原结合。

在另一个实施方式中，该多肽与异源抗原融合。

而在另一个实施方式中，该多肽与包含异源抗原的载体颗粒结 合。因此，该载体颗粒可以是病毒颗粒、病毒样颗粒(VLP)或纳米 颗粒。

在一个特定的实施方式中，该载体颗粒是在其表面上呈现本发明 的多肽的VLP。

在另一个具体的实施方式中，该异源抗原被包含在VLP内部或其 表面上。

与异源抗原结合的根据本发明的多肽

本发明的另一个方面涉及包含至少一个根据本发明的CXXC基 序的多肽，如结合于异源抗原的贾第虫VSP或其片段。

本发明多肽-异源抗原融合蛋白

当异源抗原是自身或非自身蛋白质抗原时，如上所定义的本发明 的多肽如贾第虫VSP或其片段可以与异源抗原融合。

因此，本发明的一个方面因此涉及包含含有至少一个CXXC基序 (其中C代表半胱氨酸残基和X代表任何氨基酸残基)且保持附着于肠 上皮细胞的能力的多肽和异源抗原的融合蛋白。

在一个实施方式中，该多肽是贾第虫VSP或其片段。

在特定的实施方式中，该多肽是贾第虫VSP或其片段的胞外域。

可以根据本领域中的已知技术(例如，通过使用重组核酸技术) 制备本发明的融合蛋白。

必须指出，本发明还涉及与如上所定义的异源蛋白质抗原融合的 根据本发明的多肽(如贾第虫VSP或其片段的胞外域)以及涉及包含编 码它们的序列的核酸。

本发明多肽-异源抗原偶联物

当异源抗原是非蛋白质抗原时，如上所定义的本发明的多肽如贾 第虫VSP或其片段可以通过一个连接序列共价结合到非蛋白质抗原 上。

因此，本发明的另一个方面因而涉及包含含有至少一个CXXC基 序(其中C代表半胱氨酸残基和X代表任何氨基酸残基)且保持附着于 肠上皮细胞的能力的多肽和异源抗原的偶联物。

在一个实施方式中，该多肽是贾第虫VSP或其片段。

在特定的实施方式中，该多肽是贾第虫VSP或其片段的胞外域。

可以根据本领域已知的(例如，通过偶联有机分子与氨基酸的技 术)和例如在WO 2004/009116的国际专利申请公开中所描述的技术 制备本发明的偶联物，其在此通过引用引入。

必须指出，本发明还涉及与如上定义的异源的非蛋白质抗原偶联 的本发明的多肽(如贾第虫VSP或其片段的胞外域)。

与载体颗粒结合的本发明多肽

而在另一个方面，如上所定义的本发明的多肽(如贾第虫VSP或 其片段)与载体颗粒结合。

在一个实施方式中，该多肽是贾第虫VSP或其片段。

在特定的实施方式中，该多肽是贾第虫VSP或其片段的胞外域。

在另一个实施方式中，该异源抗原与载体颗粒结合。

而在另一个实施方式中，如上所定义的根据本发明的多肽(如贾第 虫VSP或其片段)和异源抗原都结合到载体颗粒上。

因此，如上所述的融合蛋白或偶联物可以结合于载体颗粒上。

在本发明的情况中，载体颗粒可以是病毒载体颗粒、病毒样颗粒 (VLP)或纳米颗粒。

在特定的实施方式中，载体颗粒是病毒样颗粒(VLP)。

在使用病毒样颗粒的情况中，它们可以根据本领域已知的和例如 如在WO 02/34893国际专利申请公开中所描述的技术制备，其在此通 过引用引入。

在优选的实施方式中，VLP在其表面上呈现根据本发明的多肽， 如贾第虫寄生虫的VSP或其片段。

因此，根据本发明的多肽(如贾第虫VSP或其片段)可暴露在VLP 的表面。在这方面，本发明的多肽(如贾第虫寄生虫或其片段)可以通 过结合于各种不同的结构(如包膜蛋白或其片段、合成接头)或通过化 学或酶促反应而暴露。

在一个特定的实施方式中，VLP包含修饰的包膜，其可以是合成 的(嵌合的)包膜，包含与根据本发明的多肽(如贾第虫VSP或其片 段)融合的逆转录病毒包膜的跨膜结构域的至少一部分。

因此，在优选的实施方式中，VLP呈现与暴露在VLP的表面中 的本发明的多肽(如的贾第虫VSP或其片段)融合的病毒包膜蛋白，如 来自水泡性口膜炎病毒(VSV)的包膜蛋白或其片段(例如VSV G 糖蛋白的跨膜(TM)区域)，例如，通过与VSV的包膜蛋白或其片 段的遗传融合或化学融合。

在另一个优选的实施方式中，VLP呈现(i)与根据本发明的多肽 (如贾第虫VSP或其片段)融合的病毒包膜蛋白，如来自水泡性口膜炎 病毒(VSV)的包膜蛋白或其片段(例如VSV G糖蛋白的跨膜(TM) 区域)以及(ii)异源抗原。

在另一个具体的实施方式中，该合成包膜功能化从而允许任何选 定的目的分子通过共价或非共价的相互作用结合于合成包膜。功能化 的包膜可以包含接头，其中该接头允许任何选定的目的分子(特异性 地)结合。作为一个例子，该包膜可以包含抗生物素蛋白或生物素部 分，从而允许分子与其特异性结合。结合的分子可以是根据本发明的 多肽如贾第虫VSP或其片段以及异源抗原(即，非蛋白质和蛋白质 抗原)。

在一个特定的实施方式中，该异源抗原包含在VLP内部。

在优选的实施方式中，病毒样颗粒(VLP)包含逆转录病毒或慢 病毒Gag蛋白质(如鼠白血病病毒(MLV)或HIV Gag蛋白质或其 片段)，甚至更优选修饰的逆转录病毒Gag蛋白质。在具体的例子中， Gag蛋白质是包含导致异源抗原被包含在VLP内部的事实的异源抗 原(即流感病毒血球凝集素(HA)或其片段(例如，肽HA 111-119 组成的SFE肽))的融合蛋白。

因此，根据本发明的多肽如贾第虫VSP或其片段可以形成允许异 源抗原准确递送到粘膜(如肠黏膜)中而不发生消化道中的降解的保 护表面(如它在寄生虫滋养体中自然发生的)，且同时异源抗原可以 由VSP本身辅助以产生适当的保护性免疫应答。

必须指出，本发明还涉及根据本发明的上述病毒样颗粒(VLP)。

在另一个实施方式中，该载体颗粒是纳米颗粒。

在本发明的情况中，纳米颗粒是小尺寸的，小到足以被细胞摄取 以允许抗原在细胞表面上呈递。在优选的实施方式中，纳米颗粒具有 平均直径在0.5至10nm之间，更优选地在1至2.5nm之间的核心。

纳米颗粒的核心可以是金属核心。优选的地，该金属核心包含Au、 Ag或Cu，例如，选自于Au/Ag、Au/Cu、Au/Ag/Cu、Au/Pt、Au/Pd、 Au/Ag/Cu/Pd、Au/Fe、Au/Cu、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd或 Au/Fe/Cu/Gd的合金。

优选地，本发明的纳米颗粒可溶于大多数有机溶剂和尤其是水。

在使用纳米颗粒时，其可以根据本领域已知的和例如在WO 2007/122388的国际专利申请公开中描述的技术制备，其在此通过引 用引入。

在优选的实施方式中，纳米颗粒在其表面上显现根据本发明的多 肽，如贾第虫VSP或其片段。

在另一个优选的实施方式中，根据本发明的多肽(如贾第虫VSP 或其片段)和异源抗原都结合到纳米颗粒的表面上。

因此，如上所述的融合蛋白或偶联物可以结合于纳米颗粒上。

本发明的药物组合物的治疗性和预防性用途

在另一个方面，本发明涉及本发明用于在受试者中治疗或预防疾 病、紊乱或生理状况的药物组合物。

如本文所使用的术语“受试者”是指哺乳动物，如啮齿动物、猫 科动物、犬科动物和灵长类动物。优选地，根据本发明的受试者是人。

在本发明的情况中，如本文中所用的术语“处理”或“治疗”是 指逆转、减轻、抑制该术语所应用的病症或疾病或者该病症或疾病的 一种或多种症状的进展或预防所述病症或疾病。

在本发明的含义内，涉及事件的术语“防止”或“预防”意指降 低所述事件发生的风险。

因此，在本发明中考虑的疾病、紊乱或生理状况可以选自于癌症、 免疫疾病、自身免疫疾病、同种异体移植物排斥、病毒疾病如流感或 艾滋病、寄生虫疾病例如疟疾或锥虫病、细菌感染如结核病、过敏。

本发明还涉及用作疫苗的本发明药物组合物。

本发明进一步涉及用于引发免疫应答和/或增强免疫应答的本发 明的药物组合物，其中根据本发明的多肽如贾第虫VSP或其片段与 本发明的异源抗原结合(包括融合蛋白和偶联物)，根据本发明的多 肽如贾第虫VSP或其片段与本发明的载体颗粒结合。

本发明还涉及在受试者中治疗或预防疾病、紊乱或生理状况的方 法，其中所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明的药物 组合物。

在一个优选的实施方式中，该药物组合物是通过口服途径施用。

在另一个实施方式中，该药物组合物是通过粘膜途径施用。

“治疗有效量”意指用于赋予受试者治疗益处必需的活性剂最小 量。例如，对于哺乳动物“治疗有效量”是诱导、改善或以其它方式 引起与疾病相关的病理症状、疾病进展或生理状况改善或防止屈服于 疾病的量。

本发明还涉及受试者的免疫方法，其中所述方法包括向所述受试 者施用本发明的药物组合物。

本发明进一步涉及使用根据本发明的多肽如贾第虫VSP或其片 段作为呈递异源抗原和接种疫苗的载体，尤其是口服或粘膜接种。

如前面所提到的，根据本发明的多肽如贾第虫VSP或其片段有利 于将异源抗原准确递送到粘膜中而不经历消化道的大量降解。

在一个实施方式中，该多肽能够附着于肠道上皮细胞和/或耐受上 胃肠道的酶降解和/或化学降解。

在一个特定的实施方式中，该多肽是微生物的可变表面蛋白 (VSP)、VSP-样蛋白质或其片段。

本发明将通过以下的附图和实施例进一步说明。然而，这些实施 例和附图不能被理解为以任何方式限制本发明的范围。

附图

图1：用CD11c纯化的DC(5T∶1DC比率)在单独的培养基、 所指示的浓度的VLP-VSP-HA或重组SFE肽(阳性对照)中培养来 自SFE-TCR小鼠的CFSE标记的脾细胞(10⁶/孔)72小时。频率分布 图显示SFE-特异性T细胞的CFSE稀释导致的T细胞增殖(使用抗 -CD4⁺抗体和特异性识别转基因T细胞的6.5抗克隆型抗体分选)。 数字表示分裂细胞的百分比。

图2：ELISPOT分析(用HA-VSP融合蛋白口服免疫)。通过标 准的ELISPOT分析(Mabtcch，Sophia Antipolis，France)测定HA特 异性IFN-γ产生。在37℃下在5％CO₂中用1μg/mL的HA蛋白质刺 激脾细胞(5×10⁵个细胞/孔)过夜。PBS或伴刀豆球蛋白A(5μL/mL； ConA；Sigma-Aldrich)分别作为阴性对照和阳性对照。显示后，用 AID ELISPOT阅读器(ELR03，AID AutoimmunDiagnostika， Strassbcrg，德国)计数斑点，并减去在阴性对照组中检测到的非特异 斑点。符号代表个体小鼠，和水平线代表各组的几何平均。^*P＜0.05， ^**P＜0.01。

图3：口服接种VSP-HA融合蛋白的小鼠中的体液免疫应答。酶 联免疫吸附试验(ELISA)。用重组HA H5N196涂布96孔微量滴定 板。加入系列稀释的血清并在RT下孵育2小时，用生物素标记的山 羊抗小鼠Ig(H+L)(Biot.Human adsorbed.Southern Biotech Cat# 1010-08)在RT显示1小时，并在RT下与超灵敏的抗生物素蛋白链 菌素-过氧化物酶聚合物(Sigma-Aldrich)孵育1小时。在通过添加 HCL中止反应后，使用TMB底物(Sigma-Aldrich)测定过氧化物酶 活性和在450nm(OD450)处读取光密度。基于标准的单克隆抗体抗 H5N1HA(小鼠抗流感病毒A，Avian H5N1血球凝集素(HA)Cat# 17649-55B.USBiological)计算抗HA的量。

图4：ELISPOT分析(用HA和VSP假型的VLP进行口服免疫)。 通过标准ELISPOT分析(Mabtech，Sophia Antipolis，法国)测定HA- 特异性的IFN-γ(A)和IL-4(B)产生。在37℃下在5％CO₂中用20 ng以HA和NA^*假型的基于HIV-Gag的颗粒刺激脾细胞(5×10⁵个 细胞/孔)过夜。使用单独培养基或者伴刀豆球蛋白A(2μL/mL；ConA； Sigma-Aldrich)分别作为阴性对照和阳性对照。显示后，用AID ELISPOT阅读器(ELR03，AID AutoimmunDiagnostika，Strassbcrg， 德国)计数斑点，并减去在阴性对照组中检测到的非特异斑点。符号 代表个体小鼠，和水平线代表各组的几何平均。^*P＜0.05，^**P＜0.01， ^***P＜0.001。

：通过用编码病毒组件的表达载体(pCMV9(Gag)+HA(pXD14) +NA(pXD15)转染293T细胞产生基于HIV-Gag慢病毒颗粒。根据 制造商的说明，使用HIV p24-特异性ELISA分析(试剂盒RETRO-TEK #HIV-1p24抗原ELISA；ZeptoMetrixCorp，New-York，USA)测定 慢病毒载体样品中的p24浓度。

图5：口服接种VLP-VSP-HA/NA的小鼠中的体液免疫应答。血 凝抑制(HI)抗体反应。系列稀释血清样品并在37℃下与在25μL的 PBS中H5N1-假型的基于MLV-Gag的颗粒的4HA单元孵育1小时。 然后，向各个孔中加入50μL的0.5％鸡红血球悬浮液。HI抗体滴度 表示为抑制凝集反应的样品最高稀释度的倒数。符号代表个体小鼠， 和水平线代表各组的几何平均。

实施例

为了获得原理的证明和同时开发潜在的疫苗候选，我们使用流感 病毒血球凝集素(HA)作为模型疫苗抗原。

因此，为了测定VSP携带的HA抗原通过口服递送是否可引起保 护性的和完全的(T和B)免疫应答，我们构建了几种可以允许伴随 表达VSP和HA抗原的载体。使用来自流感A H5N1/Hong Kong病毒 的HA蛋白作为抗原来诱导B细胞和T细胞特异性免疫应答。

实施例1：

材料与方法

被用作口服疫苗的三种不同的VSP/HA结构的产生：

为了测定贾第虫VSP携带的流感病毒血球凝集素(HA)抗原通 过口服递送是否可引起保护性的和完全的(T和B)免疫应答，制备 了几种结构以便允许VSP和HA抗原的伴随表达。分别使用HA蛋白 和其免疫优势的SFE肽作为异源抗原来诱导B细胞和T细胞特异性 的免疫应答。

这些VSP/HA结构包括融合蛋白和病毒样颗粒(VLP)，VSP和 HA抗原结合在其上。

更准确地说，三种不同的VSP/HA结构是如此产生的，即：

1-与SFE肽融合的VSP，以监测T细胞特异性免疫应答。

2-与HA的细胞外部分(ΔHA)融合的VSP，以监测B-细胞和 T-细胞特异性免疫应答。

3-在其表面呈现VSP和HA蛋白(全长的形式)和/或在颗粒内 部呈现SFE肽作为gag融合蛋白的病毒样颗粒(VLP)。通过与SFE 肽融合的MLV Gag蛋白形成VLP。为了在VLP表面呈现VSP蛋白， 将VSP与VSV-G跨膜(TM)区融合。

VSP融合蛋白的制备和生化特征：

对照：单独的ΔHA及本发明的多肽：与HA的细胞外部分(Δ HA)融合的VSP Ex。

更特别地，编码ΔHA的cDNA序列源自流感病毒A H5N1(香港)。 雇用Genscript公司制备该蛋白质。重组蛋白质DNA序列进行密码子 优化并使用该公司的表达载体转化到细菌中。在使用大肠杆菌BL21 (DE3)菌株的细菌表达系统中获得重组HA。为了纯化HA蛋白质， 使用变性条件下的Q-柱，且用50mM的Tris-盐酸，5％的Glicerol， pH 8.0通过透析使所得的蛋白质重折叠。

为了制备与HA蛋白质的细胞外部分融合的VSP，我们使用可溶 形式的HA-删除了TM区域(ΔHA)。使用在线结构预测平台Phobius (http://phobius.sbc.su.se/)分析蛋白质序列。

全长VSP包含富含半胱氨酸的胞外区，其中包含众多的CXXC 基序。去除信号肽、跨膜区和胞质的5个残基(VSP Ex)。在这些实 验中使用VSP 1267。

对融合蛋白的序列进行密码子优化以克隆到杆状病毒系统中。表 达蛋白质和使用蛋白质的羧基末端部分中存在的His标签通过一步亲 和纯化进行纯化。

在表面上用VSP和HA假型的逆转录病毒颗粒(VLP)的制备：

由Gag制备VLP和用HA和NA(神经氨酸苷酶)假型：

对于HA载体，克隆包含其自己的TM区域的HA H5N1(香港) 序列(pXD14载体)。野生型HA天然地和非常高效率地假型化到病 毒或假型病毒颗粒上。使用pXD15载体用于NA表达。

由Gag制备VLP和用VSP和HA和NA假型：

为了将VSP序列假型化到VLP上，将VSP的胞外域与水泡性口 膜炎病毒G蛋白(VSV-G)的跨膜区(TM)融合，其已知有效地在 哺乳动物细胞的质膜处导出，与Gag蛋白共定位，且假型化到新形成 的病毒或假病毒颗粒上(pCP1267载体)。

注意：对于某些实验，使用Gag-Gp33-41融合蛋白而不是GAG， 以测量CD8应答。为了在颗粒内部呈现Gp33-41肽，将Gp33-41与 MLV Gag的羧基末端融合(pEB 1载体)。

DNA制备：一旦所有的构建体通过了验证，就扩增和纯化质粒。 使用无内毒素制备试剂盒(NucleobondPC 2000EF；Macherey-Nagel， Hoerd，France)完成质粒的制备。

VLP制备：为生成重组逆转录病毒颗粒，用所产生的表达载体 (pEB1、pCP1267、pXD15和pXD14)转染293T细胞。用超速离心 法浓缩和纯化含颗粒的上清液，具有或不具有通过额外的FPLC的纯 化步骤。

-将各个批次的VLP进行质量控制分析，以通过不同的技术验证 MLV-GAG、HA或VSP的存在：

-通过其在由pCP1267载体转染的细胞表面处的适当表达证明 VSP-TM构建体的功能性。

通过对超速离心上清液进行Western印迹，评估VLP制备和VSP 整合到VLP中或其上的效率。

结果：

通过血凝实验对HA准确假型化到VLP上进行评估。在系列稀释 的不同VLP的存在下孵育鸡红血细胞(RBC)以在构象良好的HA 蛋白的存在下评估凝血作用。我们使用VLP-HAH5N1/NA作为阳性对 照和VLP-Gag-GFP作为阴性对照。RBC与PBS的孵育用来评估沉降 时间。通过该测试，我们证明，在这项研究中我们开发的 VLP-VSP-HA/NA能促进鸡RBC凝集。

实施例2：

材料与方法：

三种结构的体外验证：

2.1在生化水平：

进行VSP-特异性免疫沉淀反应以验证VSP-ΔHA和VLP构建体。 用Western印迹分析免疫沉淀物。检测HA和检测HA/Gag蛋白以分 别验证该构建体。

2.2在免疫水平：

为了确定HA抗原是否可以被HA-特异性T细胞识别，在用三种 结构中的各种致敏的或者用纯化的重组蛋白质加载的DC存在下，用 SFE-特异性的CD4+T细胞(如Kirberg等人在1994所述，从SFE转 基因小鼠获得)进行体外扩增测试。

结果：

通过使用CFSE标记的SFE特异性CD4+T细胞(其对于特异性识 别来自HA的SFE110-119肽的TCR为转基因的)(从SFE转基因小 鼠获得(Kirberg，1994)的体外扩增试验，我们确认VLP中存在的 HA抗原被正确地加工并激活HA-特异性T细胞。如在图1中所观察 的，在用VLP-VSP-HA激发的树突状细胞(DC)存在下，转基因细 胞积极分裂，表明在VLP中存在的HA蛋白已经被正确加工并以MHC cII限制的方式呈递。

实施例3：

在以VSP/HA构建体口服免疫的小鼠中抗HA和抗-VSP免疫应 答的表征：

在口服疫苗后的不同的时间点分析小鼠的局部和全身免疫应答。

模型：

用VSP-ΔHA或HA-VLP(VSP-)口服免疫小鼠(H-2^d)。作为 对照，用ΔHA或HA-VLP(VSP-)口服免疫小鼠和用在Al(OH)₃中的HA-VLP皮下免疫小鼠(阳性对照)。

分析：

-全身的T细胞应答：在脾细胞的HA-特异性再刺激后，通过 IFN-γELISPOT分析HA-特异性T细胞的频率。

-全身的B细胞应答：通过ELTSA或抑制凝集试验在血清中研 究HA-特异性抗体反应。

用VSP-HA融合蛋白口服免疫：

免疫方案：

雌性Balb/c(H-2d)小鼠，7周大，间隔3天接受连续三次口服 施用悬浮于无菌PBS-Tween20，0.01％中的35μg重组ΔHA蛋白或 重组ΔHA-VSP蛋白。作为对照，小鼠仅接受溶媒(阴性对照)，或 用在Alum中的35μg的ΔHA皮下免疫一次(阳性对照)。

在第17天(最后口服剂量之后10天)处死的一组小鼠中分析抗 -HA的T细胞应答。在第21天(最后一次免疫后14天)在另一组小 鼠中研究抗-HA的B细胞应答。

结果：

T细胞应答的分析：

如在图2中所观察的，用VSP-HA融合蛋白免疫2只免疫小鼠中 全部成功地诱导HA特异性IFN-γT细胞应答，这与用单独的HA蛋 白口服免疫的结果(3只免疫小鼠中都没有诱导出明显的反应)相反。

这些结果证实，HA抗原与VSP蛋白的融合使得该融合蛋白具有 在通过口服途径施用时产生HA抗原特异性全身T细胞应答的独特能 力。

B细胞应答的分析：

通过EL1SA分析抗-HA特异性Ab的产生。HA蛋白的口服施用 不能诱导抗-HA Ab，而VSP-HA融合蛋白在一只口服免疫的小鼠中 诱导了高滴度的抗-HA Ab，表明在VSP存在下，可以产生针对HA 的全身B细胞应答(图3)。

在表面以VSP和HA假型化的VLP的口服免疫：

免疫方案：

雌性Balb/c(H-2d)小鼠，7周大，间隔3天接受连续三次口服 施用的悬浮于无菌PBS-Tween20，0.01％中的35μg的VLP-HA/NA、 VLP-VSP-HA/NA。作为对照，小鼠仅接受溶媒(阴性对照)，或用 在Alum中的35μgVLP-VSP-HA/NA皮下免疫一次(阳性对照)。

在第17天(最后口服剂量之后10天)处死小鼠，并分析对HA 的T细胞和B细胞应答。

结果：

T细胞应答的分析：

如在图4中所观察到的，用VLP-VSP-HA/NA融合蛋白的免疫3 只免疫小鼠中全都成功地诱导了HA特异性的IFN-γT细胞应答，这 与VLP-HA/NA口服免疫相反，其中在3只免疫小鼠中都没有诱导明 显的应答。没有检测到明显的HA-特异性IL-4产生，这表明融合蛋 白所产生的免疫应答为Th1型。这些结果证明用VSP蛋白屏蔽 VSP-HA使得该颗粒具有当通过口服途径施用时产生HA抗原特异的 全身T细胞应答的独特能力。

B细胞应答的分析：

如在图5中所示，为了分析全身B细胞应答，我们使用抑制凝血 分析定量HA-特异性抗体应答。可以看出，用HA和VSP假型的VLP 仅可以产生特定的抗HA抗体，表明在VLP上存在VSP是产生全身 抗-HA的B细胞应答所必需的。

结论：

我们已经制备了由VSP-HA嵌合蛋白质或者VSP和HA覆盖的表 达HA的VLP组成的口服疫苗及相应的对照。我们已经通过生化方 式验证，VSP和HA蛋白质在相应的结构中保持其正确的构象。我们 已经扩大了产量以口服免疫动物。在这些实验中，我们已经观察到， 与不诱导特异生T细胞或B细胞应答的HA蛋白质单独口服施用相 反，通过VSP穿梭的HA—作为融合蛋白或在VLP制剂中—的口服 施用产生HA-特异性的体液和细胞应答。

这项工作证明了我们的策略的有效性。

用于疫苗口服施用的这一通用平台的开发可以具有应用到不同 的传染性疾病的广泛用途。口服施用途径，特别是在大规模疫苗的预 防接种中，具有极大的优势。

实验结果是，贾第虫VSP和更一般地根据本发明的包含至少一个 CXXC基序的多肽似乎代表了使候选抗原移送通过消化管到达小肠 的良好载体，在那里它可以停留一段时间以产生免疫应答。特别是， 如其自身诱导免疫应答(抗体反应)的能力所示，VSP也可以起到粘 膜佐剂的作用。

事实上，作为原理证明，肠道寄生虫贾第虫VSP的胞外域作为移 送候选抗原的载体用于口服疫苗已经证明具有通过口服接种诱导对 抗流感病毒HA的有效免疫应答的能力。

参考文献：

在整个本申请中，各种参考文献描述了本发明所属的技术领域的 状态。这些参考文献的公开内容特此通过引用引入到本公开中。

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