一种载TGF-β3的缓释组织工程滑膜鞘

摘要

本发明公开了一种载TGF-β3的缓释组织工程滑膜鞘，其特征在于：由致密层(1)和多孔层(2)两层组成，所述多孔层(2)呈网孔状，该多孔层(2)内载有含TGF-β3的壳聚糖微球以及滑膜细胞。本发明实现了壳聚糖支架的人工滑膜化。该种载TGF-β3的缓释组织工程滑膜鞘既能实现TGF-β3的缓慢释放，发挥TGF-β3的抗瘢痕形成的功效，使其缓慢持续释放具有生物学活性的TGF-β3，又能利用存活滑膜细胞分泌透明质酸等活性物质，以期能达到肌腱损伤修复后防粘连的作用。该种材料可以作为一种理想的肌腱损伤修复后防粘连的理想材料，用于骨科中肌腱粘连的防治效果非常好。

说明书

技术领域

本发明属于医疗领域，具体的说，涉及一种医疗用的缓释抗粘连的组织工程滑膜鞘。

背景技术

手指屈指肌腱损伤后发生粘连愈合，导致手指的功能恢复效果不理想，是手外科领域亟待解决的一大难题。在肌腱愈合过程释放的细胞因子中，TGF-β(Transforming Growth Factor beta)认为是组织纤维化，瘢痕形成、肌腱粘连的关键因子。TGF-β3做为体内TGF-β1的同分异构体，可以下调TGF-β1和TGF-β2的水平，起到TGF-β1抗体的效果，达到抑制瘢痕的形成的作用。但是TGF-β3在体内肌腱局部含量少，肌腱愈合环境内TGF-β3的浓度无法保持，无法起到明显抗粘连作用。

滑膜是关节囊的内层，淡红色，平滑闪光，薄而柔润，由疏松结缔组织组成。滑膜分泌滑液在关节腔内，含有高度聚合的、高黏度的透明质酸，充当着关节内的主要润滑剂，它将关节软骨的摩擦系数减至0.001。手指屈指肌腱断裂，滑膜损伤后，不能正常分泌滑液，从而导致手指活动范围小，容易产生粘连。

发明内容

为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种具有缓释作用的抑制组织愈合处粘连形成的载TGF-β3的缓释组织工程滑膜鞘。

本发明目的是这样实现的：一种载TGF-β3的缓释组织工程滑膜鞘，支架由致密层(1)和多孔层(2)两层组成，所述多孔层(2)呈网孔状，该多孔层(2)内载有含TGF-β3的壳聚糖微球以及滑膜细胞。

按照如下步骤制备：

a、所述致密层(1)的形成

将壳聚糖溶于2％的醋酸水溶液中，配制成1.5％的壳聚糖溶液，然后在4℃下离心5min，去除杂质，静置除气泡后待用；将3.0ml上述溶液浇入直径9cm的培养皿中，室温放置24h自然晾干形成致密层(1)；

b、多孔层(2)的形成

再将6ml1.5％的壳聚糖溶液倾入放置致密层(1)的培养皿中，-20℃预冻2h后冷冻干燥形成多孔层(2)得到壳聚糖不对称膜；

c、含TGF-β3的壳聚糖微球的制备

将壳聚糖120mg溶于2％的醋酸水溶液中，磁力搅拌，配成2％的壳聚糖溶液；在该壳聚糖溶液中加入0.1mg/ml的TGF-β3溶液5ug，搅拌混匀，静置除气泡后待用；在烧杯中加入80ml液体石蜡，调整搅拌速度至1000rpm，滴加乳化剂Span-80 4ml；用无菌注射器将含TGF-β3的壳聚糖溶液缓慢逐滴加至液体石蜡中，搅拌乳化至颜色呈均一稳定乳白色；加入0.4ml的50％戊二醛溶液与壳聚糖搅拌固化30分钟，静置固化30分钟，淡黄色微球沉淀于杯底；倾去上层油相，用石油醚反复清洗微球，倒去上层石油醚，下层微球室温放置挥发30分钟，得含TGF-β3的壳聚糖微球；

d、载TGF-β3的缓释组织工程膜制备：

将步骤(b)中得到的壳聚糖不对称膜裁成直径为1cm的圆片，准确称量含TGF-β3的壳聚糖微球5mg，移液枪吹打分散悬于100ul的PBS溶液，吸取含悬浮微球的PBS溶液，加入多孔层(2)，使微球均匀吸附到壳聚糖膜的孔隙中得到载TGF-β3的壳聚糖缓释膜；

e、TGF-β3缓释组织工程滑膜鞘的制备

在无菌条件下取新西兰白兔膝关节滑膜组织，用无菌PBS溶液清洗三遍组织块后，在超净台内剪切成碎粒，将碎粒移至10mL离心管内，加入0.1％胰蛋白酶DMEM溶液，震荡消化30分钟，1000rpm离心5min，去上清液，加入0.1％的II型胶原酶DMEM溶液，放置于37℃、体积分数为0.05的CO₂的恒温摇床内消化2h，观察组织碎片大部分被消化，液体混浊，离心，去上清液；PBS冲洗1次，100目筛网过滤，收集滤液，离心、去上清；加入含10％FBS的DMEM培养液5mL，充分吹打均匀后，移至无菌培养皿；放入CO₂恒温培养箱内培养；每三天换液一次，5～7天传代；

将滑膜细胞悬液调整浓度为2x10⁵个/mL，用加样器吸取细胞悬液100ul均匀加入TGF-β3壳聚糖缓释膜的多孔层中，孵育3h，再向培养孔中加入含10％FBS的DMEM培养液，使得滑膜细胞贴附TGF-β3壳聚糖缓释膜多孔层生长，将片状滑膜细胞-TGF-β3壳聚糖缓释膜复合物包绕于事先消毒好的硅胶管上，使其成管形结构，得到载TGF-β3的缓释组织工程滑膜鞘。

作为优选：所述多孔层(2)厚度为200-300um。

有益效果：本发明的壳聚糖不对称膜的致密层能有效阻隔外界因素的影响和干扰。多孔层内载有含TGF-β3的壳聚糖缓释微球，同时可以作为细胞贴附生长的载体。在此基础上，我们种植了滑膜细胞，实现了壳聚糖支架的人工滑膜化。该种载TGF-β3的缓释组织工程滑膜鞘既能实现TGF-β3的缓慢释放，发挥TGF-β3的抗瘢痕形成的功效，使其缓慢持续释放具有生物学活性的TGF-β3，又能利用存活滑膜细胞分泌透明质酸等活性物质，起到润滑作用，让手指活动范围大，以期能达到肌腱损伤修复后防粘连的作用。该种材料可以作为一种理想的肌腱损伤修复后防粘连的理想材料，用于骨科中肌腱粘连的防治效果非常好。

说明书附图

图1为本发明结构示意图；

图2为TGF-β3的累计释放曲线图；

图3为本发明载TGF-β3的缓释组织工程滑膜鞘3d后电镜图；

图4为用MTT法检测壳聚糖支架和TGF-β3微球对滑膜细胞增殖的影响数据图

具体实施方式

实施例

如图1所示，一种载TGF-β3的缓释组织工程滑膜鞘，壳聚糖组织工程支架由致密层1和多孔层2两层组成，致密层1能有效阻隔外界因素的影响和干扰。所述多孔层2厚度为200-300um，多孔层2疏松、呈网孔状，其内载有含TGF-β3的壳聚糖缓释微球和滑膜细胞，作为细胞贴附生长的载体，实现了壳聚糖支架的人工滑膜化。

按如下步骤进行制得：

(1)壳聚糖不对称膜

a、致密层的形成

将壳聚糖溶于2％的醋酸水溶液，配制成1.5％的壳聚糖溶液，然后在4℃下离心5min，去除杂质，静置除气泡后待用；将1.0ml上述溶液浇入直径9cm的培养皿中，室温放置24h自然晾干形成致密层1；

b、多孔层2的形成

将壳聚糖溶于2％的醋酸水溶液，配制成1.5％的壳聚糖溶液，将6ml的该壳聚糖溶液倾入放置致密层的培养皿中，-20℃预冻1h后冷冻干燥形成厚度为200-300um的多孔层2，该多孔层疏松、呈网孔状，得到壳聚糖不对称膜；

(2)含TGF-β3的壳聚糖微球的制备

将壳聚糖120mg溶于2％的醋酸水溶液中，磁力搅拌，配成2％的壳聚糖溶液。在壳聚糖溶液中加入0.1mg/ml的TGF-β3溶液5ug，搅拌混匀，静置除气泡后待用。在150ml烧杯中加入80mI液体石蜡，调整搅拌速度至1000rpm，滴加乳化剂Span-80 4ml；用无菌注射器将含TGF-β3的壳聚糖溶液缓慢逐滴加至液体石蜡中，搅拌乳化至颜色呈均一稳定乳白色；加入0.4ml的50％戊二醛溶液与壳聚糖搅拌固化30分钟，然后静置固化30分钟，有淡黄色微球沉淀于杯底；倾去上层油相，用大量石油醚反复清洗，倒去上层石油醚，下层微球室温放置30分钟，使得石油醚挥发得较干燥壳聚糖微球。

(3)载TGF-β3的壳聚糖缓释膜制备：

将步骤(1)中的壳聚糖不对称膜裁成直径为1cm的圆片，准确称量含TGF-β3的壳聚糖微球5mg，移液枪吹打分散悬于100ul的PBS溶液，吸取含悬浮微球的PBS溶液，加入壳聚糖膜多孔层，使微球均匀吸附到壳聚糖膜的孔隙中得到载TGF-β3的壳聚糖缓释膜。

e、TGF-β3缓释组织工程滑膜鞘(4)的制备

在无菌条件下取新西兰白兔膝关节滑膜组织。用无菌PBS溶液清洗三遍组织块后，在超净工作台内剪切成碎粒。将碎粒移至10mL离心管内，加入0.1％胰蛋白酶DMEM溶液，震荡消化30分钟，1000rpm离心5min，去上清液。加入0.1％的II型胶原酶DMEM溶液，放置于37℃、体积分数为0.05的CO₂的恒温摇床内消化2h。观察组织碎片大部分被消化，液体混浊，离心，去上清液。用PBS溶液冲洗1次，100目筛网过滤，收集滤液，离心、去上清液。加入含10％FBS(胎牛血清)的DMEM(含100u/ml青霉素，100u/ml链霉素)培养液5mL，充分吹打均匀后，移至无菌培养皿。放入CO₂恒温培养箱内培养。每三天换液一次，5～7天传代。免疫组化法行滑膜细胞鉴定。MTT法检测壳聚糖支架和TGF-β3微球对滑膜细胞的增值、分化的影响。试验证明壳聚糖支架和TGF-β3微球对滑膜细胞的增值无统计学差异(p＞0.05)如图4所示。

将细胞悬液调整浓度为2x10⁵个/mL。加样器吸取细胞悬液100ul均匀加入TGF-β3壳聚糖缓释膜的多孔层中，孵育3h，再向培养孔中加入充足的含10％FBS的含100u/ml青霉素，100u/ml链霉素的DMEM培养液。滑膜细胞贴附TGF-β3壳聚糖缓释膜多孔层生长，将片状滑膜细胞-TGF-β3壳聚糖缓释膜复合物包绕于事先消毒好的硅胶管上，使其成管形结构，得到载TGF-β3的缓释组织工程滑膜鞘。3d后电镜扫描如图3所示。

载TGF-β3的壳聚糖微球的体外缓释实验：

精确称量TGF-β3壳聚糖微球20mg，置于Ep管，加入1ml的PBS，EP管置于摇床，1小时后离心，取上清液，-20℃保存离心液，将微球重悬于1ml的PBS中，继续置于摇床。于实验开始后2h，4h，6h，12h，24h，36h，2d，3d，4d，5d，6d，7d重复上述操作。将各次离心后的液体作为待测样品，用ELISA试剂盒检测样品OD值，通过标准曲线计算各样品中TGF-β3的含量，绘制TGF-β3的累计释放曲线(如图2所示)，在最初的3天TGF-β3的释放呈现快速释放的趋势，随后开始趋于平缓，7天的总释放率为46.2％±0.3％。