改良脂质体复合物的稳定性和保存期的方法

摘要

一种制备稳定的细胞靶向复合物的方法，所述复合物包含一种配体及一种包囊封装有一种治疗剂或诊断剂的阳离子脂质体，所述方法包括：(a)将所述复合物与一种包含稳定量的蔗糖的溶液组合及(b)冻干所得溶液以获得冻干的制品；其中在复原时所述制品保留其至少约80％的冻干前活性。

说明书

本申请要求申请日为2003年6月4日的美国临时申请60/475,500 的优先权，该申请全文引入本文作参考。

发明领域

本发明涉及一种制备稳定复合物的方法，所述复合物包含一种配 体和一种包囊封装(encapsulating)有一种治疗剂或诊断剂的阳离子 脂质体。

发明背景

本文所引用的所有参考文献均以其全文并入参考。

阳离子脂质体由正电荷的脂质双层组成，并且可以通过简单地混 和脂质与DNA而与负电荷的裸DNA进行复合，由此所得复合物具 有净正电荷。所述复合物可以结合培养细胞并被其以中等良好程度的 转染效率摄取。阳离子脂质体已经被证实对于体内基因输送是安全而 有效的。

脂质体可通过对其加以修饰由此其将有效载荷(payload)选择 性输送至肿瘤细胞而用于靶向肿瘤细胞。表面分子可用于将脂质体靶 向于肿瘤细胞，因为肿瘤细胞外面的分子的类型和/或数目与正常细 胞上的那些不同。例如，如果脂质体在其表面上具有叶酸或运铁蛋白 (Tf)分子，则其将导向叶酸或运铁蛋白受体的水平高于正常细胞水平 的癌细胞。

除了使用由肿瘤细胞上受体识别的配体之外，也可以将特异性抗 体附于脂质体表面，使其靶向于特异性肿瘤表面抗原(包括但不限于 受体)。这些“免疫脂质体”可将治疗药物输送至特异的细胞群。例 如已经发现与脂质体缀合的抗-HER-2单克隆抗体(Mab)Fab片段可 以特异性结合过表达HER-2的乳腺癌细胞系S-BR-3(Park，J.W.，et al. PNAS92：1327-1331(1995))。发现免疫脂质体是被有效内在化的， 并且抗-HER-2Fab片段的锚定增强其抑制作用。组合阳离子脂质体 基因转移和免疫脂质体技术似乎是一种有前途的靶向基因治疗系统。

本领域描述了针对DNA基因治疗的配体靶向脂质体输送系统， 其具有选择性肿瘤靶向和高转染效率。见Xu，L.，et al.Human Gene  Therapy8：467-475(1997)；Xu，L.，et al.，Human Gene Therapy10： 2941-2952(1999)及Xu，L.，et al.，Tumor Targeting4：92-104(1999)所 述。这个系统通过使用抗运铁蛋白受体单链(TfRscFv)抗体片段作为 复合物中的靶向配体而得以改良(Xu，L.，et al.Molecule Medicine7： 723-734(2001)；Xu，L.，et al.Molecular Cancer Therapeutics1：337-346 (2002))。TfRscFv是由分别来自轻链和重链的VH和VL可变结构域 与适当设计的接头肽连接而形成。所述接头连接第一个可变区的C 末端和第二个可变区的N末端，顺序为VH-接头-VL或者VL-接头 -VH。scFv的结合位点可以复制其亲代抗体结合位点的亲和性和特异 性。

癌症的常规治疗包括化疗和/或放疗。在这些常规癌症疗法中加 入一种新的使肿瘤对化疗或放疗敏化的成分将具有很大的临床实用 性，降低这两种类型抗癌疗法的有效剂量并相应地减轻通常与这些治 疗相关的副作用。

如上述对脂质体复合物的最初研究示出所述复合物在将诊断或 治疗剂输送至感兴趣的靶细胞中是有效的。在该复合物形成时立即将 其给予患者是不切实际的。希望提供靶向脂质体复合物，其是冻干的 并在2-8℃、-20℃或-80℃贮存仍保持稳定至少6个月并可以复 原(reconstituted)而不显著丧失活性。

先前的报道表明两种成分的复合物(脂质和DNA但无靶向配体 或蛋白质)可以在存在单糖或双糖的情况下冻干并仍保留其生物学活 性及适于基因治疗的颗粒大小(Li，B.，et al.，Journal of Pharmaceutical  Sciences89：355-364(2000)和Molina，M.D.C.et al.Journal of  Pharmaceutical Sciences90：1445-1455(2001)；Allison，S.D.，et al. Biochemical et Biophysical Acta1468：127-138(2000))。另外，通过PEG 与PEI-DNA聚合复合物(polyplex)连接的Tf在冷冻和解冻后仍保 留一些生物学活性(Kursa，M.et al.，Bioconjugate Chemistry14： 222-231(2003))。重要的是注意这种复合物不是冻干的，未给定可能 的贮存长度和条件，如果包括糖(蔗糖)则在解冻后加入。这种聚合 物复合物需要Tf通过PEG分子与所述聚合物连接。

发明概述

本发明提供了一种制备稳定复合物的方法，所述复合物包含一种 配体和一种包囊封装有一种治疗剂或诊断剂或报道基因的阳离子脂 质体，所述方法包括：

组合一种复合物和一种溶液，所述复合物包含一种配体和包囊封 装有一种诊断剂或治疗剂或报道基因的阳离子脂质体，所述溶液包含 稳定量的蔗糖；及

冻干所得的复合物和蔗糖的溶液以获得冻干的制品；

其中在复原(reconstitution)时所述制品保留其至少约80％的冻 干前活性。

在一个优选的实施方案中，所述制品保留其冻干前至少约85％ 的活性，更优选至少约90％的冻干前活性。

附图简述

图1示出新鲜制备的和冻干的含有5％葡萄糖或5％蔗糖的复合 物(Tf-LipA-Luc和TfRscFv-LipA-Luc)的大小(nm)。

图2A和2B示出新鲜制备的和冻干的含有5％葡萄糖或5％蔗糖 的复合物(Tf-LipA-Luc和TfRscFv-LipA-Luc)在DU145人前列腺细胞 中的体外转染效率，以相对发光单位(relative light units，RLU)/μg蛋 白质表示。

图3示出新鲜制备的和冻干的含有5％或10％蔗糖的 TfRscFv-LipA-Luc复合物在DU145人前列腺癌细胞中的体外转染效 率(RLU/μg蛋白质)。

图4A和4B分别示出冻干的配体-脂质体质粒DNA复合物对 DU145前列腺和PANCI胰异种移植肿瘤的靶向。

图5示出在人前列腺癌(DU145)异种移植小鼠模型中，实验室制 备的具有10％蔗糖的TfRscFv-LipA-p53复合物在冻干并在2-8℃贮 存直至6个月后仍保持肿瘤靶向能力。

图6示出在DU145异种移植小鼠模型中冻干的、具有10％蔗糖 的TfRscFv-LipA-p53复合物的肿瘤靶向和转染效率在批次与批次之 间的一致性。

图7示出在DU145异种移植小鼠模型中5个不同批次的商业制 备并冻干的具有10％蔗糖的TfRscFv-LipA-p53的肿瘤靶向和转染效 率。

图8示出通过非变性凝胶电泳评估的在多个新鲜的和冻干的 TfRscFv-LipA-p53复合物中未复合的TfRscFv的百分比。

图9示出在MDA-MB-435乳腺癌细胞中冻干的与新鲜制备的 TfRscFv-LipA-AS-HER-2复合物之间细胞生长抑制作用的体外对比。

图10示出新鲜制备的或冻干的TfRscFv-LipA-AS HER-2复合物 的PANC-1化学敏感性的体外对比。

图11示出在MDA-MB-435人乳腺癌细胞中具有10％蔗糖的 TtRscFv-LipA-AS HER-2在冻干并在2-8℃贮存直至6个月后体外下 调HER-2的表达。

发明详述

根据本发明，冻干的配体与包囊封装有诊断剂或治疗剂的脂质体 的复合物的稳定性可以通过在冻干之前将该组合物与稳定量的蔗糖 水溶液组合而增加。所述蔗糖溶液可以是简单的蔗糖与水的溶液，或 者可以是与缓冲液如PBS、HEPES、TRIS或TRIS/EDTA的溶液。典 型地，将所述蔗糖溶液与所述复合物组合至终浓度为约1％-约80％ 蔗糖，典型地为约1％-约50％蔗糖，如1％-约10％、20％、30％或 40％蔗糖，优选约5％-10％蔗糖，最优选约10％蔗糖。该冻干制品 在约2-8℃至约-80℃的范围内可以保持稳定性至少6个月而不明 显丧失活性。优选地，所述制品可以稳定至少约6-12个月。在复原 时，所述复合物保持其至少80％的冻干前活性，优选保持其至少约 85％的冻干前活性，最优选保持其至少约90-95％的冻干前活性。

先前的报道已经表明了脂质与DNA的复合物可以在存在单糖或 二糖的情况下冻干并保持生物学活性(Li，B.，et al.，Journal of  Pharmaceutical Sciences89：355-364(2000)及Molina，M.D.C.et al. Journal of Pharmaceutical Sciences90：1445-1455(2001)；Allison，S.D.， et al.Biochemical et Biophysical Acta1468：127-138(2000))。然而未曾 料到由如下成分组成的一种三成分复合物也可以冻干并在复原后保 持其大小和生物学活性：1)蛋白质(例如运铁蛋白)，甚至包括是抗体 或抗体片段(例如抗运铁蛋白受体单链抗体片段，TfRscFv)的蛋白； 2)脂质体及3)治疗性核酸分子(例如质粒DNA、反义寡核苷酸分子或 者甚至siRNA分子)。

所述脂质体复合物典型地通过静脉内给予。对于静脉内注射，将 50％葡萄糖溶液常规加入所述配体-脂质体复合物中，至终浓度为 5％。现在令人惊奇地发现通过将新鲜制备的(即制备后不超过约1- 约24小时的复合物)配体-脂质体复合物与蔗糖溶液而不是葡萄糖溶 液组合，该三成分复合物(包括具有抗原靶向实体(entity)的那些 复合物)的活性和保存期在冻干及复原后可以显著增加。

所述三成分复合物在冻干之前可以简单地与蔗糖溶液混和。所述 溶液典型地包含约50-约100％重量的蔗糖，优选包含约50％重量的 蔗糖。冻干可以根据任何常规的方法将复合物的水分含量降低至约 1.3％以下而进行。一个优选的方法包含将含有复合物的溶液在-50 ℃至-60℃、在20-50微米汞柱优选25微米汞柱的条件下、冻干 12-60小时，优选20-48小时，然后在约2-8℃与约-80℃之间贮 存该冻干制品。在另一个优选的方法中，将含有复合物溶液的小瓶在 环境温度置于商购的冷冻干燥器中，然后将温度在1个小时内降低至 -45℃±3℃并在此温度保持3小时。然后将冷凝器设定在-80℃或更 低温度，真空设定为50微米Hg。保存温度然后在1小时内升至-35±3 ℃，并在此温度保持约36-72小时，优选约48小时。然后在4小时 内将保存温度升至20±3℃，并在此温度保持约6-约48小时，优选 约12小时。在这个方法结束时，将室压用氮气恢复至大气压水平(通 过适当的无菌微生物滞留滤膜)并将瓶子用塞子塞住。

冻干的复合物可以通过加入与冻干前的溶液等体积的无菌、无内 毒素的水而复原。轻轻摇动以迅速溶解所述干燥的复合物。没有由于 冻干或贮存而发生可测量的复合物的大小或zeta电势改变。

可与蔗糖溶液混和、冻干并复原的合适的复合物是能靶向细胞 的、全身性输送用于治疗或诊断疾病的多种类型治疗或诊断分子的细 胞靶向配体/脂质体/治疗性分子、报道分子或诊断分子复合物。靶细 胞优选是癌细胞，但也可以是非癌细胞。优选的癌靶细胞包括前列腺、 胰腺、乳腺、头颈、卵巢、肝和脑癌及黑素瘤。本领域技术人员熟知 大多数类型的癌细胞，包括但不限于上述那些细胞，均过表达运铁蛋 白和叶酸的受体，这些受体在癌细胞中也迅速再循环(Li，H.，and  Qian，.Z.M.，Medicinal research Reviews2(3)：225-250(2000)；Qian，Z. M.，et al.，Pharmacological Reviews54(4)：561-587(2002)；gosselin，M. A.，and Lee，P.J.，Biotechnology annual Reviews8：103-131(2002))。

希望的是，所述治疗分子是基因、多核苷酸，如质粒DNA、DNA 片段、寡核苷酸、寡脱氧核苷酸、反义寡核苷酸、嵌合的RNA/DNA 寡核苷酸、RNA、siRNA、核酶、病毒颗粒、生长因子、细胞因子、 免疫调节剂或其它蛋白质，包括其表达时呈递刺激或抑制免疫系统的 抗原的蛋白质。优选的治疗剂是核酸分子，优选DNA或siRNA分子。 优选的DNA分子是编码基因如野生型p53分子、Rb94分子、Apoptin 分子、EGFG分子或反义分子的DNA分子。优选的HER-2反义寡核 苷酸是针对HER-2基因并具有序列5′-TCC ATG GTG CTC ACT-3′。 优选的siRNA分子是针对HER-2mRNA起作用的分子。其它优选的 治疗性分子可以由本领域技术人员不用过多的实验而确定。

如上所述，靶细胞或者可以是非癌细胞。优选的非癌靶细胞包括 树突细胞、血管内皮细胞、肺细胞、乳腺细胞、骨髓细胞和肝细胞。 可以靶向非希望的但良性的细胞，如良性的前列腺增生细胞、过度活 性的甲状腺细胞、脂瘤细胞，及与自身免疫疾病相关的细胞，如产生 参与关节炎、狼疮、重症肌无力、鳞状上皮化生(squamous metaplasia)、 发育异常等的抗体的B细胞。

或者，所述制剂可以是在给予后能在体内检测的诊断剂。诊断剂 例如包括电子致密材料(electron dense material)、磁共振显象剂和放 射性制剂。用于显象的放射性核素包括铜、镓、铟、铼、和锝的放射 性同位素，包括⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、¹¹¹In、^99mTc、⁶⁷Ga或⁶⁸Ga。由在此并入 参考的Low等的美国专利5,688,488所揭示的成象剂用于本发明所述 的脂质体复合物中。

配体可以是其受体在靶细胞上差异表达的任何配体。例如包括运 铁蛋白、叶酸、其它维生素、EGF、胰岛素、Heregulin、RGD肽或 与整联蛋白受体反应的其它多肽、抗体或其片段。优选的抗体片段是 抗体的单链Fv片段。

所述抗体或抗体片段是结合靶细胞表面上受体的抗体或抗体片 段，优选结合在靶细胞上差异表达的受体。一种优选的抗体是抗TfR 单克隆抗体，优选的抗体片段是基于抗TfR单克隆抗体的scFv。另 一优选的抗体抗HER-2单克隆抗体，另一优选的抗体片段是基于抗 HER-2单克隆抗体的scFv。

配体与脂质体在室温混和，配体与脂质体的比率在约1∶0.001至 1∶500(μg∶nmole)的范围，优选约1∶10至约1∶50(μg∶nmole)。将治疗 剂与阳离子脂质体在室温混和，制剂∶脂质比率在约1∶0.1至1∶50(μg∶ nmole)的范围，优选约1∶10至约1∶24(μg∶nmole)。例如在其中配体 是运铁蛋白和治疗剂是质粒DNA的复合物中，治疗剂与脂质体与配 体的有用比率典型地在约1μg∶0.1-50nmole∶0.1-100μg的范围内，优选 1μg∶5-24nmole∶6-36μg，最优选约1μg∶10nmole∶12.5μg。如果配体是 TfRscFv，则配体与脂质体的有用比率典型地在约1∶5-1∶40(μg∶μg) 的范围内，优选1∶30(μg∶μg)的范围内，质粒DNA与脂质体的比率 典型地在约1∶6-1∶20(μg∶μg)的范围内，优选1∶14(μg∶μg)的范围 内。如果治疗剂是寡核苷酸(ODN)而不是质粒DNA，配体、脂质体 和ODN的典型比率为0.1nmole-36nmole(ODN∶脂质体)及0.1μg- 100μg(配体∶脂质体)，优选0.5nmole-20nmole(ODN∶脂质体)及0.5μg -50μg(配体∶脂质体)，最优选1nmole-15nmole(ODN∶脂质体)及 1μg-30μg(配体∶脂质体)。如果治疗剂是siRNA，则成分的有用比 率可以是0.1μg∶30nmole(siRNA∶脂质体)及0.1μg∶100μg(TfRscFv∶脂质 体)，优选1μg∶7nmole(siRNA∶脂质体)及1μg∶30μg(TfRscFv∶脂质体)。

有许多阳离子脂质体用于制备所述复合物。在此并入参考的公布 的PCT申请W099/25320描述了一些阳离子脂质体的制备。希望的 脂质体例如包括包含二油酰基三甲基磷酸铵(DOTAP)和二油酰基磷 脂酰乙醇胺(DOPE)和/或胆固醇(chol)的混合物或者包含二甲基双十 八烷基溴化铵(DDAB)和DOPE和/或胆固醇的混合物的那些脂质体。 脂质的比率可以加以变化以优化特异性靶细胞类型对治疗性分子的 摄取。所述脂质体可以包含一或多种阳离子脂质及一或多种中性或辅 助脂质的混合物。阳离子脂质与中性或辅助脂质的希望比率是约 1∶(0.5-3)，优选1∶(1-2)(摩尔比率)。

在一个实施方案中，用于形成复合物的脂质体是一种空间稳定的 脂质体。空间稳定的脂质体是其中已经整合进亲水性聚合物如PEG、 聚(2-乙基丙烯酸)或者聚(n-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)的脂质体。这 种修饰的脂质体当与治疗剂或诊断剂复合时可以是特别有用的，因为 它们典型地不被网状内皮系统以如同清除未如此修饰的相应脂质体 那样快地从血流中清除。在第二个实施方案中，用于形成所述复合物 的脂质体也与由组氨酸和赖氨酸(分支的或线性的)组成的肽结合， 其中所述肽的长度为至少约10个氨基酸，典型地为约10-1000个氨 基酸之间，并且是由5-100％的组氨酸和0-95％的非组氨酸氨基酸 组成，优选至少10％的非组氨酸氨基酸是赖氨酸。最优选地，所述肽 的长度为约31个氨基酸，约20％的氨基酸是组氨酸，约80％的氨基 酸是非组氨酸，至少75％是赖氨酸及至少一个是末端半胱氨酸。优选 的肽具有结构5′-K[K(H)-K-K-K]₅-K(H)-K-K-C-3′，并且可以通过末端 半胱氨酸和脂质体中的一个马来酰亚胺基团而与所述脂质体共价缀 合。在这种复合物中，成分的比率典型地可以如下：配体与HK-脂质 体(μg∶μg)比率为1∶5-1∶40，优选1∶30，及DNA与HK-脂质体(μg∶ nmole)比率为1∶1-1∶20，优选1∶14。

所述复合物可以通过将配体-脂质体与治疗剂或诊断剂混和在一 起、将所得溶液缓慢上下颠倒一定时间或者以在溶液中恰好形成涡流 的速度搅动该溶液约10秒至约10分钟，优选15秒至约2分钟而制 备。

所述复合物可以与另外的治疗剂组合给予，如与放射物或化疗剂 组合。所述治疗剂或治疗剂的组合可以在给予所述复合物之前或随后 给予，例如在约12小时至约7天内给予。化疗剂包括但不限于例如 阿霉素、5-氟尿嘧啶(5FU)、顺铂(cisplatin，CDDP)、紫杉特尔 (docetaxel)、吉西他滨(gemcitabine)、紫杉醇(paclitaxel)、长春花 碱、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷(VP-16)、喜树碱(camptothecia)、放线菌 素-D、米托蒽醌(mitoxantrone)和丝裂霉素C。放射疗法包括γ射 线、X-线、UV放射、微波、电子发射等。

本发明通过如下实施例得以进一步例证，所述实施例只是例证 本发明而无限制之意。

实施例

实施例1：新鲜的和冻干的具有碳水化合物的复合物的制备及活性和 大小的体外评估

进行最初的实验以测试用碳水化合物制备的配体-脂质体核酸复 合物在冻干前后的大小及体外转染效率。测试两个单独的配体，Tf和 TfRscFv。所述复合物使用美国专利申请09/601,444和公布的美国专 利申请09/914,046和10/113,927所述的方法制备[也见于Xu，L.，et al. Human Gene Therapy10：2941-2952(1999)；Xu，L.，et al.，Human Gene  Therapy13：469-481(2002)；和Xu，L.，et al.，Molecular Cancer  Therapeutics1：337-346(2002)所述]。在每个复合物中，脂质体是1∶1 比率的DOTAP∶DOPE，在此称为脂质体A(LipA)。使用的DNA是携 带编码的萤火虫萤光素酶基因的质粒。在所有情况中，碳水化合物溶 液均在复合物制备的最后步骤中加入。

制备一系列8个复合物。4个含有Tf作为配体(DNA∶LipA∶Tf 比率为1μg∶10nmole∶12.5μg)；4个含有TfRscFv作为配体(DNA∶ LipA∶TfrscFv比率为1μg∶14nmole∶0.34μg)。将含有配体-脂质体的 溶液与DNA混和在一起，缓慢倒转10次，将所得溶液在室温保持 15分钟，之后加入葡萄糖或蔗糖于水中的水溶液至终浓度为5％。将 每个所得混合物倒转10次，然后在室温保持15分钟，之后冻干或转 染。

准备冻干的溶液使用Virtis Benchtop3L冷冻干燥器在25微米汞 柱在-55℃冻干24小时，然后在-80℃贮存过夜之后复原。在用与 冻干前溶液体积相等的水复原之后，将装有每种溶液的容器缓慢倒转 10次并在室温保持60分钟。之后复原的复合物可以在2-8℃保持直 至24小时。冻干前后复合物的大小使用Malvern Zetasizer3000H通 过动态激光光散射(dynamic laser light scattering)而测定。

测定大小的结果(平均数)示于图1。当Tf是配体时，在存在5 ％葡萄糖的情况中冻干后大小增加近10倍。而具有5％蔗糖的新鲜 复合物的大小略大于具有5％葡萄糖的复合物，在存在蔗糖的情况中 冻干前后基本无变化。当TfRscFv用作配体时观测到相似的模式。在 这里使用5％蔗糖提供更好的冻干后结果。

对新鲜的和冻干的复合物还评估了其在人前列腺肿瘤细胞系 DU145中的转染效率。对比在复原时的冻干复合物(具有Tf和 TtRscFv)与相应的新鲜制备的相同复合物的溶液的转染效率。冻干 前后的转染效率结果示于图2A和2B。当配体是Tf时，含有5％葡 萄糖的制品在冻干后效率下降至新鲜制备的复合物的约60％，而含 有5％蔗糖的冻干制品保持其初始活性的约80％。模式与TfRscFv作 为配体时相似。含有5％葡萄糖的冻干复合物的活性下降至新鲜制品 活性的约50％，而当使用5％蔗糖时保留约90％活性(图2B)。因此， 蔗糖是比葡萄糖更有效的稳定剂。

糖/复合物比率被进一步优化以改良稳定性并保持颗粒大小。对 比具有5％和10％蔗糖的复合物。并将质粒DNA的量也增加至20μg， 在体内研究中通常用于单次注射的量在下文论述。在如上述冻干后， 含有10％蔗糖的复合物的转染效率是用5％葡萄糖溶液常规制备的 新鲜复合物的～95％。图3示出了用5％和10％蔗糖制备的复合物之 间的转染效率的对比。使用含有10％蔗糖的冻干复合物的体外转染 效率最佳。发现这不依赖于是否是蛋白质还是抗体片段用作靶向配 体。对含有10％蔗糖的复合物在使用上述条件冻干前后的大小也进 行了评估。与用5％葡萄糖制备的常规新鲜复合物相对比，用10％蔗 糖制备的复合物的大小在冻干前后无显著差异。本发明还发现这种情 况也不依赖于靶向配体。

因此，与含有5％葡萄糖或5％蔗糖的相应复原制品相比，复原 的脂质体复合物制品中存在10％的蔗糖更好的维持了生物学活性和 大小。

实施例2：冻干的复合物在2-8℃贮存一周后在体内对人前列腺肿瘤 的靶向

在复合物中使用增强的绿色荧光蛋白(EGFP)作为报道基因，测试 具有10％蔗糖的脂质体复合物(新鲜制备的或冻干的并在2-8℃贮 存1周)的体内肿瘤靶向。所述复合物是TfRscFv-脂质体A-pEGFP， 其中脂质体A是DOTAP∶DOPE(1∶1)。三种成分的比率是0.3μg∶ 14nmole∶1μg(TfRscFv∶脂质体∶DNA)。所述复合物如实施例1所述制 备并冻干。在冻干后，将复合物在2-8℃冷却贮存1周。样品通过 加入无内毒素水而复原为冻干前的体积，如实施例1所述进行。

给携带至少50mm³的DU145异种移植肿瘤的小鼠在24小时内 静脉内注射3次不同复合物(具有5％葡萄糖的新鲜制品、具有10 ％蔗糖的新鲜制品及复原的具有10％蔗糖的冻干制品，其在复原前 在2-8℃已经冷却贮存1周，所有制品均用TfRscFv作为靶向配体)。 48小时后，将动物处死，切下肿瘤和肝脏，分离蛋白质并使用抗EGFP Ab(COVANCE)进行Western分析。如图4A所示，具有10％蔗糖的 冻干和复原的复合物与任一新鲜制备的复合物相对比均具有相似的 基因表达水平。更显著地，在肿瘤中显然存在高水平的外源基因表达， 在小鼠的肝脏中几乎没有EGFP表达，这表明了复合物的肿瘤特异性 性质，并且这种肿瘤靶向特异性在冻干后、在2-8℃贮存至少1周 及复原后仍保留。

实施例3：冻干的复合物在-80℃贮存1个月之后的体内人胰腺肿瘤 靶向

对在-80℃贮存1个月后的冻干复合物的稳定性通过其靶向胰 腺癌异种移植肿瘤也加以测试。所述复合物如实施例1所述用10％ 蔗糖制备并冻干(与实施例2所述相同的复合物及比率)。冻干后，将 样品在-80℃贮存1个月，然后如实施例1所述用无内毒素水复原。

如图4B所示，来自在24小时内经静脉内注射3次小鼠(如实 施例2所述)的肿瘤示出甚至比用新鲜制备的复合物注射后发现的 EGFP基因表达水平更高的水平。同样，在肝中仅观测到非常弱的表 达或无表达。

实施例4：通过大小和体外转染效率评估在2-8℃贮存的冻干复合物 的长期稳定性

为增加TfRscFv-脂质体-DNA复合物作为可行的临床治疗剂的潜 力，揭示了一种增加其稳定性的手段，由此保持其肿瘤靶向能力和贮 存期。我们的一些研究表明具有10％蔗糖作为赋形剂的冻干的复合 物可以在-20℃、-80℃或2-8℃成功贮存。为便于临床应用，优 选的贮存方法是在2-8℃。为确定冻干的复合物可以在2-8℃贮存 而不丧失生物学活性的时间长度，对冻干的并在2-8℃贮存1、4和 6个月的复合物的体外转染效率进行评估。所述复合物为TfRscFv- 脂质体A-p53，其中脂质体A是DOTAP∶DOPE(1∶1)。三种成分的比 率是0.3μg∶14nmole∶1μg(TfRscFv∶脂质体A∶DNA)，这等于 0.34μg∶10μg∶1μg。10％蔗糖用作赋形剂。复合物中的DNA是含有编 码人野生型p53的～1.7Kb cDNA序列的质粒载体。如实施例1所述 制备、冻干，并在2-8℃贮存后适当的时间复原所述复合物。大小(数 字参数)和Zeta电势使用Malvern 3000H Zetasizer确定。功能活性使 用萤光素酶共转染分析评定。将人前列腺癌DU145细胞用BP100质 粒DNA和所述复合物共转染。BP100质粒携带在wtp53诱导型启动 子控制下的萤光素酶基因。由此，功能性p53在转染细胞中的水平通 过萤光素酶活性水平反映。在转染24小时后，将细胞裂解并使用 Promega萤光素酶试剂根据厂商指导分析萤光素酶活性。如表1所示， 萤光素酶活性、所述复合物的大小和zeta电势在新鲜制备的复合物及 冻干的并在2-8℃贮存直至6个月的复合物之间是一致的。

表1：冻干复合物和新鲜制备复合物的比较

实施例5：全身性给予在2-8℃贮存后的冻干复合物的体内肿瘤特异 性靶向

对新鲜制备的及如对于实施例4所述制备、在2-8℃贮存1、4 或6个月然后复原用于研究的冻干复合物也测试在全身性(静脉内) 给予后其在体内到达并转染人前列腺异种移植肿瘤的能力。为皮下携 带至少100mm³的人前列腺肿瘤细胞系DU145异种移植肿瘤的无胸 腺裸鼠在24小时内静脉内注射3次复合物(新鲜的或冻干并复原的)， 注射量等于每次注射40μg的DNA，终体积为0.8mL。在最后注射48 小时后，将动物安乐死，切除器官，分离蛋白质并通过如Xu，L.et al.， Tumor Targeting4：92-104(1999)所述Western分析确定表达。或者可 以使用本领域通常已知的其它方法。将80μg的总蛋白质裂解物加样 于12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。在运行凝胶后，将蛋白质移至硝 酸纤维素膜上并用抗p53小鼠单克隆抗体(Oncogene Research  Products)探查。

小鼠体内肿瘤靶向研究结果示于图5。p53表达水平在来自接受 新鲜制备的复合物的动物及来自接受每种甚至冻干后6个月的冻干 复合物的动物的肿瘤之间是相似的。p53在所有肿瘤中的表达水平均 显著高于在肝脏中的水平，表明在2-8℃贮存6个月后经静脉内给 予后的肿瘤特异性得以保持。

实施例6：冻干后的批次与批次之间的(batch to batch)一致性及稳 定性

重要的是确定多批次的在同一天的不同时间制备并冻干的复合 物及在不同天制备并冻干的复合物具有相似的大小和转染效率水平。 如实施例1所述制备、冻干、贮存并复原复合物TfRscFv-脂质体 A-p53，其中脂质体A是DOTAP∶DOPE(1∶1)。所述成分与p53DNA 的比率如实施例4所述。

在前列腺癌DU145细胞中评估新鲜制备的或冻干的多个 TfRscFv-LipA-p53复合物的功能性表达。使用BP100质粒及实施例4 所述萤光素酶分析评定体外活性。在不同的5天制备至少两种独立的 样品并冻干。在2-8℃贮存2周后，将样品如实施例1所述复原并 在体外和体内测试。在体外，使用Promega萤光素酶试剂根据厂商指 导分析萤光素酶活性(RLU/μg，即细胞中相对发光单位/μg蛋白质)， 对每个批次的zeta电势和颗粒大小(数字参数)也在Malvern3000H Zetasizer上测定。如表2所示，以数字参数表示(by number parameter)， 大多数制品的大小下降为400-700nm范围，zeta电势均在阳性范围 内。因此，在不同天制备的不同复合物具有一致的性质。

表2

对样品还如实施例5所述在携带DU145异种移植物的无胸腺裸 鼠体内进行评估。为论证应用TfRscFv作为靶向实体(entity)的配 体-脂质体-DNA复合物保持肿瘤特异性，应用Western分析(图6)。 对这些独立批次的TfRscFv-LipA-p53复合物在DU145人前列腺皮下 异种移植小鼠模型中进行测试。为携带～50-100mm³DU145肿瘤的 裸鼠在24小时内静脉内注射3次所述复合物(每次注射40μg DNA)。 在最后一次注射24小时后，处死动物并切下肿瘤和肝脏。分离蛋白 质。将80μg总蛋白质裂解物加样于12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中。 在运行凝胶之后，将蛋白质移至硝酸纤维素膜上并用抗p53小鼠单克 隆抗体(Oncogene Research Products)探查。随后探查该膜的GAPDH 水平以表明等量加样。在来自接受含有每种不同批次的复合物的小鼠 的肿瘤中显然可见高水平的p53表达(图6)。在接受新鲜制备或冻干 的TfRscFv复合物的肿瘤中均观测到相似的p53表达水平。相反，在 未用所述复合物处理的小鼠中p53表达水平非常低。肿瘤特异性通过 在肝脏中非常低的表达水平而论证。在所有情况中，肿瘤和肝脏之间 表达水平均有5-10倍的差异。与未处理的肿瘤中p53的水平相比， 所有制品在处理的小鼠的肿瘤中均提供强p53信号，而在同一小鼠的 肝脏中则没有。因此，这些研究表明完全复合物的冻干是可行的，并 且可以克服稳定性和保存期的问题。

实施例7：商业化生产冻干：体外和体内测试

对于用于治疗病人的冻干复合物，必需示出在存在10％蔗糖的 情况中复合物制备过程可以转移至商业生产实体并可以成功地大规 模进行。所述复合物由Cardinal Health，Albuquerque，NM在约定和机 密协议下通过搅动而制备。将DNA溶液加入TfRscFv∶脂质体溶液中， 同时以在溶液中正好形成涡流的速度搅动30秒至1分钟。将该溶液 在室温保持10-20分钟，之后加入50％蔗糖水溶液，如上述搅动30 秒至1分钟至终浓度为10％，在室温保持10-20分钟。商业制备的 批次大小在50-1000ml的范围。在此商业企业使用Hull冷冻干燥器 的冻干方案如下：

·在室温加样10ml小瓶，均含有5ml复合物与10％蔗糖。

·保存温度在1个小时内下降至-45℃。一旦保存温度达到-45 ℃±3℃，则将产物保持3小时。

·此时，将冷凝器冷却至-55℃或更低温度，真空设定为50微 米Hg。

·然后保存温度在1小时内升高至-35℃。

·一旦保存温度达到-35℃，则将产物保持48小时。

·在4小时内将保存温度升高至20℃，并将产物保持12小时。

·在每次循环结束时，使用经合适的无菌微生物滞留滤膜NF过 滤的氮气将室压恢复至大气压。

·将产物用塞子塞住、标记并在2-8℃贮存。

由商业实体制备5个不同批次的TfRscFv-LipA-p53复合物。代 表性商业制备批次的体外萤光素酶活性、大小和zeta电势的例子如 表3所示。商业制备并冻干的复合物的大小、zeta电势和萤光素酶活 性水平与实验室新鲜制备的复合物的相似。

表3

为进行5个批次的对比，将携带DU145异种移植物的小鼠如实 施例5所述处理(每次注射0.8mL的40μg DNA/)。每只小鼠在24小 时内接受3次静脉内注射。在最后一次注射后48小时处死动物并切 下器官。所有5个批次通过Western分析均示出与用新鲜制备的复合 物处理相似的高水平的p53表达，并显著高于在未处理的肿瘤或肝脏 中观测到的结果(图7)。因此，这个技术可成功地转移至商业生产。

实施例8：冻干复合物中未复合的TfRscFv水平百分比的一致性

为进一步确定冻干复合物的稳定性，确定在2-8℃贮存直至6 个月之后的未复合的配体的量。为估定TfRscFv-LipA-p53复合物中 存在的未复合的TfRscFv量，使用本领域技术人员已知的方法进行 4％-20％梯度非变性和非还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳及随后的 Western分析(图8)。抗TfRscFv蛋白质的多克隆兔抗体用作第一抗体 (由Animal Pharm，Healdsburg，，CA生产)，HRP-标记的小鼠抗兔单克 隆抗体(Sigma)用作第二抗体。含有134ng的TfRscFv的新鲜制备的 或冻干的复合物如实施例1所述制备和冻干。冻干的样品在2-8℃ 贮存1、4或6个月，之后如实施例1所述复原。一旦与脂质体复合， 则TfRscFv蛋白将不能进入PAGE凝胶。因此，只有未复合的游离 TfRscFv可被检测到。在非变性和非还原条件下，难以精确确定游离 TfRscFv单体的量。因此，含有13.4ng(于每个复合物中10％)、 26.8ng(20％)或40.2ng(30％)单一试剂TfRscF的未复合样品也在同样 的凝胶中运行以作为浓度标准来粗略估计每个测试复合物中未复合 的TfRscFv的量。

结果表明最初置入复合物中的TfRscFv有约10％或更少在各种 新鲜的TfRscFv-LipA-p53复合物制品中或者在于2-8℃贮存6个月 的冻干TfRscFv-LipA-p53复合物制品中以游离TfRscFv存在。这些 数据提示游离的、未复合的TfRscFv量在所有制品中非常一致，并且 这个水平在冻干及在2-8℃贮存至少6个月后不改变。

实施例9：含有反义HER-2寡核苷酸的配体-脂质体-核酸复合物的冻干

上述研究在复合物中使用质粒DNA。由于质粒DNA和寡核苷酸 不总是可互换的，并且可具有不同的化学性质，因此进行实验以论证 冻干程序可以用于含有寡核苷酸(ODN)的配体-脂质体复合物。使用 的ODN是与HER-2基因(AS HER-2)的起始密码子区域互补的15聚 体硫代磷酸(phosphorothioated)序列特异性反义HER-2ODN，具有 序列5′-TCC ATG GTG CTC ACT-3′。使用MDA-MB-453人乳腺癌细 胞系作为分析系统，对具有不同糖的TfRscFv-lipA-AS HER-2复合物 在冻干后在增加的ODN浓度对细胞的杀伤进行评估。复合物如实施 例1所述制备，其由TfRscFv、脂质体A(DOTAP∶DOPE为1∶1)和 ODN(ODN∶脂质体比率为1nmole∶15nmole)及1μg∶30μg(TfRscFv∶脂 质体)组成。

冻干复合物制备为含有5％葡萄糖或10％蔗糖并与新鲜制备的包 含10％蔗糖的相应复合物制品对比。复合物如实施例1所述冻干、 在2-8℃贮存过夜并在无内毒素水中复原。以5×10³个 MDA-MB-453细胞/孔接种于96孔平板中。24小时后，将细胞用新 鲜制备的或冻干并复原的复合物转染。转染后48小时进行一式三份 基于XTT-胞毒性细胞存活力分析(XTT＝3′-[1-苯基氨基羰基]-3，4-[四 唑]-双(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸酯)。如图9所示，在AS-HER-2ODN 浓度高于0.25μM时，含有10％蔗糖的冻干并复原的复合物对细胞杀 伤具有最大作用。在较高的ODN浓度，新鲜的和复原的含有10％蔗 糖的复合物均远远好于具有5％葡萄糖的复合物，冻干对复合中含有 的HER-2反义ODN的细胞杀伤能力没有不利作用。

为证实在存在10％蔗糖的情况中冻干和复原对复合物的效力无 有害作用，进行XTT分析以确定人胰腺癌(PANC)1细胞中对Gemzar 的化学敏感水平，对比新鲜制备的复合物与相应的如实施例1所述冻 干并复原的复合物。复合物中成分的比率为1nmole∶15nmole(ODN∶ 脂质体)及1μg∶30μg(TfRscFv∶脂质体)。以4×10³PANC-1细胞/孔种植 于96孔平板中，24小时后用新鲜制备的或已经与蔗糖混和以提供10 ％蔗糖并冻干、在2-8℃冷冻贮存过夜并复原的TfRscFv-LipA-AS  HER-2(0.25μM ODN)复合物转染。24小时后加入化疗药物Gemzar。 在加入药物72小时后，一式三份进行基于XTT的细胞存活力分析。 结果示于图10。如图所示，样品的存活曲线实际上是相同的。另外， 复合物的IC₅₀(杀死50％细胞的药物浓度)值相同于(如果不相同也是 低于)先前使用具有5％葡萄糖的新鲜制备的复合物确定的数值。因 此本发明的制备和贮存方法也可使用任何反义寡核苷酸，因为靶基因 与这个方法不相关。

这些研究表明完全的复合物的冻干是可行的，并且当使用ODN 作为治疗分子时先前稳定性和贮存期中的难题都得以克服。

实施例10：携带AS ODN的复合物冻干并贮存6个月后大小、Zeta电 势和效力的保持

对含有AS HER-2ODN并用10％蔗糖制备的配体-脂质体-核酸复 合物在冻干前后的大小、zeta电势和转染活性进行测试。发现复合物 的大小在冻干前后及在-20℃贮存直至6个月后基本相同。例如：预 先冻干，如实施例9所述准备新鲜的及6个月冻干的复合物的密度平 均、体积平均和数字平均的大小数值分别为410(I)、454(V)和368(N) 对339(I)、427(V)和397(N)。另外，将不影响HER-2水平的另一种 寡核苷酸(SC-ODN_(5′-CTA GCC ATG CTT GTC-3′)也如实施例9所 述以相同比率复合、冻干、在-20℃贮存直至6个月并复原。在此冻 干和贮存同样对复合物的大小或zeta电势无显著作用。因此，任何 ODN均可以复合并冻干。

zeta电势为-43.8(新鲜的)及在贮存6个月后为-47.7(冻干的)。 具有10％蔗糖的冻干复合物的转染效率通过确定TfRscFv-lip A-AS HER-2在体外下调HER-2表达的能力而测定。在制备、冻干(如实 施例4所述)及在-20℃贮存直至6个月后，使用两种不同浓度(0.3 或0.6μM)的复合物AS HER-2ODN或0.6μM的SC-ODN转染人乳腺 癌细胞系MDA-MS-435细胞。携带AS HER-2或SC-ODN的新鲜制 备的复合物用作对照。SC-ODN在冻干前后均无作用。然而，新鲜制 备的及甚至在-20℃贮存6个月后的冻干复合物均存在AS HER-2 ODN剂量依赖性下调HER-2表达(图11)。由于SC-ODN无作用，因 此观测到的下调不是由于复合物的冻干所导致的任何一般胞毒性的 结果。

实施例11：携带siRNA的复合物在冻干后的大小和Zeta电势的保持

具有10％蔗糖的TfRscFv、脂质体A和siRNA复合物在冻干后 的稳定性通过测定冻干前后复合物的大小和zeta电势而确定。所述复 合物由TfRscFv、脂质体A(DOTAP∶DOPE为1∶1摩尔比率)和33.3μg 的siRNA组成。复合物的总体积为500μL。成分的比率为1μg∶7nmole (siRNA∶脂质体)及1μg∶30μg(TfRscFv∶脂质体)向所述复合物中加入 蔗糖至终浓度为10％。如实施例1所述制备复合物并冻干。在冻干后， 将复合物如实施例1所述复原并使用Malvern Zetasizer3000H测定大 小和zeta电势。结果示于表4。

表4

大小(nm)

因此，冻干后，大小或zeta电势无显著改变。如果有什么区别的 话，则密度大小和体积在冻干后甚至更小，使得所述复合物在体内应 用更有效。

实施例12：用肽-脂质体制备的复合物在冻干后大小的保持

为进一步论证本发明的一般性质，还制备一种含有修饰的脂质体 的复合物。用于形成复合物的脂质体与肽结合。所述肽包含组氨酸和 赖氨酸并且是长度为31个氨基酸的分支肽，由组氨酸和非组氨酸氨 基酸组合组成，结构为5′-K[K(H)-K-K-K]₅-K(H)-K-K-C-3′)。这个研究 中的脂质体包括DOTAP∶DOPE(1∶1)。将HK肽通过末端半胱氨酸和 脂质体中的马来酰亚胺基团与脂质体共价缀合。所述复合物由 TfRscFv-HK-脂质体-DNA组成，其中成分比率如下：TfRscFv∶HK- 脂质体(μg∶μg)为1μg∶30μg，DNA∶HK-脂质体(μg∶nmole)为1μg∶ 14nmole。使用的DNA为p53(见实施例4)，对于300μl总体积复合 物使用18μg DNA。在终复合物中包含10％蔗糖。所述复合物如实施 例1所述制备和冻干。冻干后将复合物在2-8℃贮存3天，然后如 实施例1所述复原。在Malvern Zetasizer3000H上测定冻干前及冻干 后并在2-8℃贮存3天的复合物的大小。在冻干前，大小(平均数) 为601nm。在贮存和复原后，大小为588。因此，再一次表明使用10 ％蔗糖的复合物的冻干不引起复合物大小的任何显著改变，甚至在包 含HK肽的情况中也是如此。

实施例13：携带一种不同的治疗基因(RB94)的复合物在冻干后并在2 -8℃贮存后的体外和体内评估

除了萤光素酶基因之外，编码增强的绿色荧光蛋白的基因、p53 基因，携带其它质粒DNA的脂质体复合物可以冻干并保持大小和生 物学活性。为进一步论证，还制备了携带另一种治疗基因(肿瘤抑制 基因RB94)的这种复合物。所述复合物是TfRscFv-脂质体A-RB94， 其中脂质体A是DOTAP∶DOPE(1∶1)。三种成分(TfRscFV∶脂质体∶ DNA)的比率为0.34μg∶10μg∶1μg。所述复合物还含有总体积为0.5mL 的30μg的RB94质粒DNA及10％蔗糖。所述复合物如实施例1所 述制备并使用实施例1所述方法冻干以进行大小和zeta电势研究，或 者如实施例7所述由Cardinal Health制备以用于体外和体内靶向研 究。

大小和Zeta电势

如实施例1所述制备并冻干、在2-8℃贮存4天并如实施例1 所述复原的复合物的大小和zeta电势使用Malvern Zetasizer3000H进 行冻干前及冻干和贮存后的对比。在冻干前，大小(nm)为密度和283 (密度)及392(体积)，而之后为303(密度)和347(体积)。因此，当包 含10％蔗糖时，冻干和在2-8℃贮存4天后，大小无显著改变。相 似地，zeta电势无显著差异，均在+20至+30范围内[19(冻干前)及30.7 (冻干后)]。

体外和体内靶向

使用人前列腺细胞系DU145和人膀胱癌细胞系HTB-9，在细胞 培养物中测试所述复合物在冻干及在2-8℃贮存一定时间后特异性 靶向肿瘤细胞及有效转染其的能力。使用如实施例所述新鲜制备的复 合物或者在复原之前已经由商家制备并冻干(如实施例7所述)及在 2-8℃贮存约4个月的复合物在体外转染这两个细胞系。细胞中 RB94蛋白表达水平通过Western分析确定，使用本领域技术人员已 知的标准方案进行。在用新鲜制备的或冻干的复合物转染后，检测的 蛋白质的量在任一人肿瘤细胞系中无显著差异。

为携带人膀胱癌HTB-9异种移植肿瘤的小鼠全身性注射(通过 尾静脉i.v.注射)新鲜制备的复合物或者如实施例所述已经用10％蔗 糖经搅动制备、冻干(实施例7)并在2-8℃贮存几乎5个月之后复 原(实施例1)的复合物。小鼠在24小时内共接受3次i.v.注射(每次 注射0.67ml的40μg DNA)。在最后一次注射约48小时后处死动物， 切下肿瘤和肝脏，获得蛋白质并使用抗RB94单克隆抗体(QED  Biosciences，Inc)通过Western印迹进行分析，根据Xu，L.，et al.，Tumor  Targeting4：92-104(1999)所述的一般程序进行。在体外研究中，接受 新鲜或冻干复合物的动物的肿瘤中RB94蛋白的水平无显著差异。如 果有的话，所述表达在用冻干复合物注射的小鼠的肿瘤中甚至更高。 另外，在任一组的肝脏中事实上无表达，表明所述复合物的肿瘤靶向 能力在具有10％蔗糖的情况下冻干并在2-8℃贮存至少5个月后得 以保持。

本申请还涉及如下内容：

1.制备稳定的细胞靶向复合物的方法，所述复合物包含配体和包 囊封装有治疗剂、报道基因或诊断剂的阳离子脂质体，所述方法包括：

提供复合物，其包含配体和包囊封装有诊断剂、报道基因或治疗 剂的阳离子脂质体；

将所述脂质体复合物与基本由稳定量的下列物质组成的蔗糖溶液 组合：

蔗糖和水、

蔗糖和PBS缓冲液、

蔗糖和HEPES缓冲液、

蔗糖和TRIS缓冲液、或

蔗糖和TRIS/EDTA缓冲液；及

冻干所述脂质体复合物和蔗糖的溶液以获得冻干的制品；

其中在复原时所述制品保留其至少80％的冻干前活性。

2.项目1的方法，其中所述制品在复原时保留其至少85％的冻干 前活性。

3.项目2的方法，其中所述制品在复原时保留其至少90％的冻干 前活性。

4.项目3的方法，其中所述制品在复原时保留其至少95％的冻干 前活性。

5.项目1的方法，其中所述复合物与蔗糖溶液组合至终浓度为 1％-80％蔗糖。

6.项目1的方法，其中所述复合物与蔗糖溶液组合至终浓度为 1％-50％蔗糖。

7.项目1的方法，其中所述复合物与蔗糖溶液组合至终浓度为 1％-20％蔗糖。

8.项目1的方法，其中所述复合物与蔗糖溶液组合至终浓度为 5％-10％蔗糖。

9.项目8的方法，其中所述复合物与蔗糖溶液组合至终浓度为 10％蔗糖。

10.项目1的方法，其中所述配体的受体在靶细胞上差异表达。

11.项目10的方法，其中所述配体包含运铁蛋白、叶酸、抗体或 抗体片段。

12.项目11的方法，其中所述配体包含运铁蛋白。

13.项目11的方法，其中所述配体包含抗运铁蛋白受体单克隆抗 体。

14.项目11的方法，其中所述配体包含抗体的单链Fv片段。

15.项目14的方法，其中所述抗体片段包含基于抗运铁蛋白受体 单克隆抗体的scFv。

16.项目1方法，其中所述脂质体包含至少一种阳离子脂质及至 少一种中性或辅助脂质。

17.项目16的方法，其中所述阳离子脂质包含二油酰基三甲基磷 酸铵即DOTAP或二甲基双十八烷基溴化铵即DDAB，且所述中性或辅助 脂质包含二油酰基磷脂酰乙醇胺即DOPE或胆固醇即cho1。

18.项目16的方法，其中所述脂质体包含二油酰基三甲基磷酸铵 和二油酰基磷脂酰乙醇胺的混合物。

19.项目1的方法，其中脂质体与至少10个氨基酸的肽结合，其 中所述肽由5-100％的组氨酸和0-95％的非组氨酸残基组成。

20.项目19的方法，其中所述肽的至少10％的所述非组氨酸残基 是赖氨酸残基。

21.项目20的方法，其中所述肽具有结构 5′-K[K(H)-K-K-K]₅-K(H)-K-K-C-3′。

22.项目1的方法，其中所述治疗剂包含基因、质粒DNA、寡核 苷酸、寡脱氧核苷酸、反义寡核苷酸或siRNA。

23.冻干制品，其基本由复合物以及增加所述复合物稳定性的量 的蔗糖组成，所述复合物包含配体与包囊封装有治疗剂或报道基因或 诊断剂的阳离子脂质体，其中所述制品在-80℃至8℃的温度范围内保 持稳定至少6个月，同时保留至少80％活性，且

其中所述制剂是从基本上由所述复合物与稳定量的蔗糖和水、稳 定量的蔗糖和PBS缓冲液、稳定量的蔗糖和HEPES缓冲液、稳定量的 蔗糖和TRIS缓冲液、或稳定量的蔗糖和TRIS/EDTA缓冲液组成的溶液 冻干的。

24.项目23的冻干制品，其中所述蔗糖以1％-80％的量存在。

25.项目23的冻干制品，其中所述蔗糖以1％-50％的量存在。

26.项目23的冻干制品，其中所述蔗糖以1％-20％的量存在。

27.项目23的冻干制品，其中所述蔗糖以5％-10％的量存在。

28.项目27的冻干制品，其中所述蔗糖以10％的量存在。

29.项目23的冻干制品，其在复原时保留其至少80％的冻干前活 性。

30.项目23的冻干制品，其在复原时保留其至少85％的冻干前活 性。

31.项目23的冻干制品，其在复原时保留其至少90％的冻干前活 性。

32.项目23的冻干制品，其在复原时保留其至少95％的冻干前活 性。

33.项目23的冻干制品，其中所述配体的受体在靶细胞上差异表 达。

34.项目33的冻干制品，其中所述配体包含运铁蛋白、叶酸、抗 体或抗体片段。

35.项目34的冻干制品，其中所述抗体片段包含抗体的单链Fv 片段。

36.项目23的冻干制品，其中所述治疗剂包含基因、质粒DNA、 寡核苷酸、寡脱氧核苷酸、反义寡核苷酸或siRNA。

37.项目23的冻干制品，其中所述脂质体包含至少一种阳离子脂 质和至少一种中性或辅助脂质的混合物。

38.项目37的冻干制品，其中所述阳离子脂质包含二油酰基三甲 基磷酸铵或二甲基双十八烷基溴化铵，且所述中性或辅助脂质包含二 油酰基磷脂酰乙醇胺或胆固醇。

39.项目38的冻干制品，其中所述脂质体包含二油酰基三甲基磷 酸铵和二油酰基磷脂酰乙醇胺的混合物。

40.项目23的冻干制品，其中所述脂质体与至少10个氨基酸的 肽结合，其中所述肽由5-100％的组氨酸和0-95％的非组氨酸残基组成。

41.项目40的冻干制品，其中所述肽的至少10％的所述非组氨酸 残基是赖氨酸残基。

42.项目41的冻干制品，其中所述肽具有结构 5′-K[K(H)-K-K-K]₅-K(H)-K-K-C-3′。

43.项目1的方法，其中所述诊断剂包含电子致密材料，磁共振 显象剂或放射性制剂。

44.项目23的冻干制品，其中所述诊断剂包含电子致密材料，磁 共振显象剂或放射性制剂。