光可裂解基团保护的三磷酸脱氧尿苷衍生物及其合成方法和应用

摘要

本发明公开了光可裂解基团保护的三磷酸脱氧尿苷衍生物及其合成方法和应用。本发明式Ⅰ或式Ⅱ所示的光可裂解基团保护的三磷酸脱氧尿苷衍生物能够被多种DNA聚合酶识别，能够定点掺入到寡聚核苷酸短链或随机掺入到DNA长链中，经光照后脱除光保护基团释放出具有较高化学反应活性的羧基或氨基，可以与相应的功能基团相连接，达到功能化核酸的目的。

说明书

技术领域

本发明涉及一种光活性三磷酸尿苷类似物,尤其涉及光可裂解基团保 护的三磷酸脱氧尿苷衍生物及其合成方法,本发明进一步涉及光可裂解基 团保护的三磷酸脱氧尿苷衍生物在核苷酸功能化中的应用，属于三磷酸脱 氧尿苷衍生物领域。

背景技术

功能化的核酸分子在化学生物学、结构生物学、分析化学、纳米生物 学中都有重要的应用。随着研究的深入，需要在DNA链上连接更多的功 能化基团以提高其细胞特异性、细胞内稳定性和生物学效应，因而核酸修 饰基团的保护成了研究的一个重要内容。

根据核酸和功能基团（如生物素、地高辛、荧光素等）的连接方式的 不同可以分为前修饰和后修饰。前修饰是指在合成核酸链之前对核酸单体 进行修饰，合成核酸链之后再通过如Click反应、D-A加成、酯化或者酰 胺化对核酸进行进一步的功能化。考虑到合成核苷酸链之后经常需要多样 的修饰和功能化，因此需要对引入的功能基团进行保护。常用的保护基有 很多，而以邻硝基苄醇为母核的光可消除结构因其稳定性好、光脱除效率 高、方便清洁被广泛的用于光保护的研究中。

核酸链的合成分为化学合成和生物合成。目前，化学合成特别是固相 合成在寡聚核苷酸修饰及功能化中应用广泛，但是化学合成的寡聚核苷酸 长度一般在100个碱基之内。而生物合成可以弥补这一弊端，利用聚合 酶链式反应(PCR)可以方便的获得几千个碱基的长链，大大的扩展了合成 核酸链的应用范围。

脱氧尿嘧啶和脱氧胞嘧啶中，碱基5位的修饰广泛用于核酸功能化， 也有文献报道，5位修饰的核苷酸能够很好的被DNA聚合酶作为底物接 受。5位修饰能够使引入的功能基团对Waston-Crick碱基配对的影响最低， 并且5位修饰基团位于DNA双链的大沟区，有利于进一步功能化。

发明内容

本发明的目的之一是提供光可裂解基团保护的三磷酸脱氧尿苷衍生 物；

本发明的目的之二是提供一种合成所述光可裂解基团保护的三磷酸 脱氧尿苷衍生物的方法；

本发明的目的之三是将所述光可裂解基团保护的三磷酸脱氧尿苷衍 生物应用于核苷酸功能化。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

光可裂解基团保护的三磷酸脱氧尿苷衍生物，其结构式为式Ⅰ或式Ⅱ 所示：

式Ⅰ式Ⅱ

R为或

其中，n为1-6的任意整数；X为CH₂、NH或SH；Y为氢或P₃O₉^4-； Z为氢或OH；R₁为氢或CH₃；R₂为氢或OCH₃；R₃为氢或OCH₃；R₄为氢、OCH₃、N(CH₃)₂或N(CH₂CH₃)₂；

优选的，n为2或4；X为NH；Y为P₃O₉^4-;Z为氢；R₁为氢；R₂为 氢；R₃为氢。

本发明的另外一个目的是提供一种合成式Ⅰ或式Ⅱ所示化合物的方 法；

一种合成式Ⅰ所示化合物的方法，包括以下步骤：

（1）在脱水剂和催化剂的作用下，将邻硝基苯乙醇和4-戊炔酸进行 酯化反应，得到4-戊炔酸-1-（2-硝基苯）乙酯；（2）4-戊炔酸-1-（2-硝 基苯）乙酯和5-碘脱氧尿苷进行催化反应得到脱氧尿苷衍生物；（3）在 脱氧尿苷衍生物的5'羟基上进行三磷酸化，即得。

其中，步骤（1）中所述的脱水剂优选为N,N'-二环己基碳二亚胺；所 述的催化剂优选为4-二甲氨基吡啶；

步骤（2）中所述催化反应的催化剂优选为四（三苯基膦）钯和碘化 亚铜。

步骤（3）中所述的三磷酸化包括：以三甲基磷酸酯作为溶剂，1,8- 双二甲氨基萘作为缚酸剂，先用三氯氧磷和脱氧尿苷衍生物反应，得到单 磷酸酯中间体；再加入三丁基焦磷酸铵，与中间体化合物形成三磷酸酯环 状中间体，最后再加入三乙基碳酸氢铵缓冲液进行开环，得到三磷酸化合 物。

一种合成式Ⅱ所示化合物的方法，包括以下步骤：

（1）邻硝基苯乙醇和N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯反应得到活泼中间 体，活泼中间体再和5-己炔胺反应得到N-1-(2-硝基苯)乙氧基羰基-5-乙炔 胺；（2）N-1-(2-硝基苯)乙氧基羰基-5-乙炔胺与5-碘脱氧尿苷进行催化 反应得到脱氧尿苷衍生物;（3）在脱氧尿苷衍生物的5'羟基上进行三磷酸 化，即得。

其中，步骤（2）中所述催化反应的催化剂优选为四（三苯基膦）钯 和碘化亚铜。

步骤（3）中所述的三磷酸化包括：以三甲基磷酸酯作为溶剂，1,8- 双二甲氨基萘作为缚酸剂，先用三氯氧磷和脱氧尿苷衍生物反应，得到单 磷酸酯中间体；再加入三丁基焦磷酸铵，与中间体化合物形成三磷酸酯环 状中间体，最后再加入三乙基碳酸氢铵缓冲液进行开环，得到三磷酸化合 物。

本发明式Ⅰ或式Ⅱ所示的光可裂解基团保护的三磷酸脱氧尿苷衍生 物均能够被用于酶促合成底物被三种常用的DNA聚合酶（即：Taq,Vent  exo-和T₄）所识别，能够定点掺入到寡聚核苷酸短链或随机掺入到DNA 长链之中，三种DNA聚合酶对光照前后的光活性三磷酸尿苷类似物都显 示出较好的识别能力。经紫外辐照后，可以脱除光保护基团，释放出具有 较高化学反应活性的羧基或氨基，成功的实现了荧光基团标记，显示出其 在短链核酸定点单标记、双标记及长链核酸随机标记上的应用前景。

附图说明

图1本发明光可裂解基团保护的三磷酸脱氧尿苷衍生物的结构式。

图2光可裂解基团保护的三磷酸脱氧尿苷衍生物dUoTP和dUnTP 的合成路线图。

图3dUnTP的光解；A）光解不同光照时间取样的HPLC曲线，B） dUnTP（9.5分钟）减少及光解产物dUnTP*（3.2分钟）增加的百分比曲线。

图4dUoTP的光解。A）光解不同光照时间取样的HPLC曲线，B） dUoTP（8.7分钟）减少及光解产物dUoTP*（4.7分钟）增加的百分比曲线。

图5引物延伸实验的变性聚丙烯酰胺凝胶分析；(A)dUnTP, dUnTP*(B)dUoTP,dUoTP*使用Taq,Vent exo-或者T₄DNA聚合 酶；‘marker’条带对应荧光基团修饰的引物；‘control’条带对应无dTTP 的PCR反应。

图6定点单荧光标记的寡聚核苷酸的变性聚丙烯酰胺凝胶分析结 果，SYBR^TM Gold DNA染料染色前（A）后（B）的区别。条带1：只有 引物；条带2：未修饰单体PCR结果；条带3：荧光标记寡聚核苷酸。

图7荧光标记的紫外吸收光谱和荧光发射光谱；其中（A）为定点 单荧光标记的紫外吸收光谱，（B）为定点单荧光标记的荧光发射光谱； （C）为定点双荧光标记的紫外吸收光谱，（D）为定点双荧光标记的荧光 发射光谱，（E）为长链随机标记的紫外吸收光谱，（F）为长链随机标记 的荧光发射光谱。

图8定点单荧光及双荧光标记的寡聚核苷酸的变性聚丙烯酰胺凝 胶分析结果；SYBR^TM Gold DNA染料染色前（A）后（B）的区别；条带 1：只有引物；条带2：未修饰单体PCR结果；条带3：单荧光标记；条带 4：双荧光标记。

图9随机修饰的长链DNA的琼脂糖凝胶分析结果；EB染色前（A） 后（B）的区别；条带1：DNA标准分子量；条带2：未修饰单体PCR结 果；条带3：dUnTP随机掺入后荧光标记结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会 随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围 构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和 范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改 和替换均落入本发明的保护范围内。

有机合成部分

通用材料和方法

实验所用常规溶剂均为分析级，石油醚经过旋转蒸发仪重蒸。反应所 用乙腈，二氯甲烷，三乙胺，三甲基磷酸酯均经过氢化钙干燥并重蒸，所 用DMF为Acros公司的Extra dry级别。所有反应试剂均由等公司购得，如无说明，使用前均未经过特殊处理。分析 用薄层层析板从公司购得，铺有0.24mm GF254硅胶。柱层析所 用硅胶（200-300目）从青岛海洋公司购得。所有对氧和水敏感的反应均 在氮气保护中进行，所有光敏感化合物的反应均在暗室进行。¹H，¹³C， ³¹P NMR核磁数据AVANCE III400超导核磁共振仪测定（TMS 及氘代溶剂做内标）。高分辨质谱由7.0T Brucker傅立叶变换高分辨质 谱仪测得。高效液相色谱为Alliance e2695。

中间体化合物的合成

5-己炔-1-胺的合成

N-（5-己炔基）邻苯二甲酰亚胺（1140mg,5.0mmol）和水合肼（1.2mL, 20mmol）加入到乙醇中(20mL)，加热回流一个小时，然后恢复室温。反应 体系旋除乙醇，加入到水中（100mL）,体系pH调整到10以上,然后用乙 酸乙酯萃取（6×50mL）。有机相合并、干燥并旋干得到5-己炔-1-胺的盐酸 盐（550mg,4.1mmol,产率82%）。

¹H NMR(400MHz,D₂O)δ2.94(t,J=7.5Hz,2H),2.28(t,J=2.6Hz,1H), 2.18(m,2H),1.69(m,2H),1.51(m,2H).¹³C NMR(100MHz,D₂O)δ85.13,69.68, 39.04,25.81,24.49,17.10.

1-(2-硝基苯)乙基琥珀酰亚胺碳酸酯的合成

邻硝基苯乙醇（1.70g,10mmol）,二琥珀酰亚胺碳酸酯（3.60g,14 mmol）和三乙胺（3.5mL）溶于干燥乙腈（15mL），氮气保护下室温反应2 小时。旋除溶剂，硅胶柱分离，流动相PE:EA（3:1到1:1），得到1-(2- 硝基苯)乙基琥珀酰亚胺碳酸酯，白色固体（2.60g,8.5mmol,产率85%）。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.04-7.48(m,4H),6.40(m,1H),2.79(s,4H), 1.79(d,2H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ168.4,150.6,147.2,135.7,134.2, 129.2,126.9,124.7,75.9,25.3,22.0

实施例1  4-戊炔酸-1-（2-硝基苯）乙酯（化合物（2））的合成

邻硝基苯乙醇(化合物（1）)(940mg,5.6mmol)，4-戊炔酸(502μL, 5.6mmol)，N,N'-二环己基碳二亚胺（2063mg,10.0mmol）和4-二甲氨基 吡啶（244mg,2.0mmol）溶于二氯甲烷（12mL），室温下搅拌反应1小 时。加入50mL乙酸乙酯稀释，用8%柠檬酸溶液（2×50mL）和饱和氯 化钠溶液（2×50mL）洗，硫酸钠干燥。过滤，蒸干，硅胶柱分离，流动 相为石油醚：乙酸乙酯=10:1，得到化合物（2）(970mg,3.93mmol)，黄 色油状液体，产率70%。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.94(dd,J=8.2,0.9Hz,1H),7.71– 7.57(m,2H),7.43(m,1H),6.36(q,J=6.5Hz,1H),2.60–2.54(m,2H),2.52 –2.46(m,2H),1.95(s,1H),1.65(d,J=6.5Hz,3H);¹³C NMR(100MHz, CDCl₃)δ170.6147.7,137.8,133.5,128.4,127.2,124.5,82.3,69.2,68.5,33.4, 22.0,14.3.⁺TOF-MS:[M+Na]⁺270.04

实施例2  N-1-(2-硝基苯)乙氧基羰基-5-乙炔胺(化合物（3）)的合成

1-(2-硝基苯)乙基琥珀酰亚胺碳酸酯（1.02g,3.0mmol）和5-己炔胺 盐酸盐（400mg,3.0mmol）溶于二氯甲烷（15mL）中，加入三乙胺（1.70 mL,12.0mmol）,室温下搅拌2小时。然后，体系倒入100mL二氯甲烷中， 用Brine洗（3×50mL）,硫酸钠干燥，旋干溶剂，用硅胶柱分离，流动相 为PE:EA=1:1。即得化合物（3）（670mg,2.3mmol），淡黄色油状液体， 产率77%。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.91-7.40(m,4H),6.22(q,J=6.4Hz, 1H),3.14(m,2H),2.20(m,2H),1.94(d,J=2.4Hz,1H),1.67–1.46(m,7H). ¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ155.40,147.69,138.86,133.56,128.23, 127.13,124.47,84.05,68.79,68.60,40.52,29.03,25.55,22.32,18.13.

实施例3  化合物（4）的合成

化合物（4）

4-戊炔酸-1-（2-硝基苯）乙酯（化合物（2））(750mg,3.0mmol)， 5-碘-2'-脱氧尿嘧啶（710mg,2.0mmol），四（三苯基膦）钯（115mg,0.1 mmol），碘化亚铜（40mg,0.2mmol）和三乙胺（1.1mL,8.0mmol）溶 于乙腈（6mL）中，氮气保护，加热至60℃反应两小时。然后蒸干溶剂， 硅胶柱分离，流动相为甲醇：二氯甲烷=0-0.1，梯度洗脱，得到化合物（4） （550mg,1.16mmol），淡黄色泡沫状固体，产率58%。

¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.17(d,J=4Hz,1H),7.97–7.85(m, 1H),7.78–7.69(m,1H),7.70–7.62(m,1H),7.53–7.42(m,1H),6.29– 6.18(m,2H),4.45–4.33(m,1H),3.93(q,J=3Hz,1H),3.84–3.68(m,2H), 2.70–2.58(m,4H),2.38–2.12(m,2H),1.63(d,J=6Hz,3H).¹³C NMR (100MHz,MeOD)δ172.69,164.45,151.11,149.10,144.63,138.58,134.88, 129.69,129.69,128.51,125.17,100.64,93.09,88.99,86.91,73.29,72.00, 69.63,69.61,62.58,41.54,34.23,22.10,16.00.ESI⁺MS:[M+Na]⁺496.28, Calculated:[M+Na]⁺496.13.ε₂₈₉=11600L·mol^-1·cm^-1

实施例5  化合物（5）的合成

化合物（5）

N-1-(2-硝基苯)乙氧基羰基-5-乙炔胺（化合物(3)）(667mg,2.3 mmol)，5-碘-2'-脱氧尿嘧啶（710mg,2.0mmol），四（三苯基膦）钯（115 mg,0.1mmol），碘化亚铜（40mg,0.2mmol）和三乙胺（1.1mL,8.0mmol） 溶于乙腈（6mL）中，氮气保护，加热至60℃反应1.4小时。然后蒸干溶 剂，硅胶柱分离，流动相为甲醇：二氯甲烷=0-0.1，梯度洗脱，得到化合 物（5）（780mg,1.44mmol），淡黄色泡沫状固体，产率72%。

¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.20(d,J=3.0Hz,1H),7.94(d,J=8 Hz,1H),7.74–7.66(m,2H),7.51–7.44(m,1H),6.24(m,1H),6.12(q,J=6 Hz,1H),4.43–4.37(m,1H),3.94-3.91(m,1H),3.83–3.63(m,2H),3.06(t, J=6Hz,2H),2.39-2.23(m,4H),1.61(d,J=6Hz,3H),1.58–1.50(m,4H). ¹³C NMR(100MHz,MeOD)δ164.68,157.93,151.21,149.04,144.31, 139.98,134.85,129.52,128.16,125.26,101.12,94.72,89.04,86.85,72.94, 72.02,69.42,62.58,41.62,41.14,29.85,26.63,22.47,19.79.ESI⁺ MS: [M+Na]⁺539.62,Calculated:[M+Na]⁺539.18.ε₂₈₉=12000L·mol^-1·cm^-1

实施例6  化合物dUoTP的合成

dUoTP

化合物（4）（120mg,0.25mmol）和1,8-双二甲氨基萘（107mg,0.50 mmol）溶于三甲基磷酸酯（2mL），氮气保护并冰浴，缓慢滴加三氯氧 磷（38μL,0.40mmol），冰浴中反应40分钟。然后加入三丁基焦磷酸铵 （250mg,0.50mmol）的二甲基甲酰胺（DMF）（2.0ml）溶液和三乙胺 (140μL,1.0mmol)，反应30分钟之后加入三乙基碳酸氢铵缓冲液（0.1M， 10mL），渐升至室温然后继续搅拌2小时。用高效液相色谱Alliance e2695分离，检测器e2998，自动接样器WFCIII，反相柱： X Bridge BEH300，流动相：A0.1M三乙胺乙酸缓冲液（水）B乙 腈，梯度洗脱：0min100%A,40min60%A,45min40%A,50min100%A。 WFCIII自动回收得到化合物的三乙胺盐，阳离子树脂脱盐得到产物 dUoTP,产率46%（根据HPLC曲线计算得到）。

¹H NMR(400MHz,D₂O)δ7.93–7.76(m,2H),7.69(m,1H),7.56(d, J=7Hz,1H),7.44–7.31(m,1H),6.26–6.09(m,2H),4.51–4.48(m,1H), 4.22–4.01(m,3H),2.69–2.53(m,4H),2.40–2.21(m,2H),1.56(t,J=9 Hz,3H).³¹P NMR(162MHz,D₂O)δ-10.304(br),-11.012(br),-22.719(br). FT-MS^-:[M-H]^-712.0345,[M-2H+Na]^-734.0167,[M-H₂PO₃]^-632.0668; Calculated:[M-H]^-712.0346,[M-2H+Na]^-734.0165,[M-H₂PO₃]^-632.0683

实施例7  化合物dUnTP的合成

dUnTP

化合物（5）（80mg,0.16mmol）和1,8-双二甲氨基萘（60mg,0.25 mmol）溶于三甲基磷酸酯（2mL），氮气保护并冰浴，缓慢滴加三氯氧 磷（18μL,0.20mmol），冰浴中反应40分钟。然后加入三丁基焦磷酸铵 （160mg,0.29mmol）的二甲基甲酰胺（DMF）（2.0mL）溶液和三乙胺 (70μL,0.50mmol)，反应5分钟之后加入三乙基碳酸氢铵缓冲液（0.1M， 10mL），渐升至室温然后继续搅拌2小时。用高效液相色谱Alliance e2695分离，检测器e2998，自动接样器WFCIII，反相柱： X Bridge BEH300，流动相：A：0.1M三乙胺乙酸缓冲液（水）； B：乙腈，梯度洗脱：0min100%A,20min60%A,25min40%A,30min 40%A35min100%A。WFCIII自动回收得到化合物的三乙胺盐，阳离子 树脂脱盐得到产物dUnTP。

¹H NMR(400MHz,D₂O)δ7.99–7.82(m,2H),7.68(s,2H),7.44(s, 1H),6.22(s,1H),6.02(s,1H),4.13(m,3H),4.56(s,1H),2.99(s,2H),2.80 (s,1H),2.53(s,1H),2.33(s,2H),1.56(d,J=6Hz,3H),1.37(m,4H).³¹P NMR(D₂O,162MHz):δ-8.926(br),-12.115(br),-22.764(br).FT-MS^-:[M-H]^-755.0763,[M-H₂PO₃]^-675.1149;Calculated:[M-H]^-755.0768,[M-H₂PO₃]^-675.1105.

PCR合成部分

材料和方法

DNA模板：5′-TCC TTG TGA TAA GCA AAG ATT AGT TAG TCC  CAT-3′（SEQ ID No.1）

DNA引物：5′-ATG GGA CTA ACT CTT TGC TTA-3′（SEQ ID No.2）

引物5′末端有荧光素（FAM）标记，便于后续的分析和定量。

Vent(exo-)聚合酶购自New England Biolabs(NEB)，T₄DNA聚合酶购 自Fermantas，Taq DNA聚合酶购自TAKARA。三磷酸单体（dNTP）购 自Promega。引物和模板由生工生物合成。G-25凝胶柱（Nap-10）购自 GE healthcare。聚丙烯酰胺、尿素等常用试剂来自鼎国、生兴等公司。

PCR仪为ABI Vrtiti96-well Thermal Cycler.

聚合酶链式反应(PCR)体系：1×缓冲液，1.2μM模板和1.0μM引物，50μM dATP,dGTP及dCTP，50μM三磷酸脱氧尿苷衍生物（dUnTP或dUoTP）， 0.4U Taq或0.2U Vent exo-或0.2U T₄DNA聚合酶，总体积10μL。

PCR温控程序：Taq和Vent exo-聚合酶：94℃ 5min,（94℃ 30s 55℃  30s 68℃ 2min）×8，T₄聚合酶：退火后，37℃ 20min延伸，72℃ 10min 酶失活。

聚丙烯酰胺凝胶分离和分析：20%变性聚丙烯酰胺凝胶（含有7M尿素）， 上样缓冲液中加入90%甲酰胺用于DNA变性，上样缓冲液1μL和PCR 产物2μL混合，变性两分钟（94℃），取2.5μL上样，电泳缓冲液：0.1M TBE缓冲液，100V电压，2小时，用高灵敏化学发光凝胶成像分析系统 （Bio-red ChemiDoc XRS System）进行成像，图像采集和数据处理使用 Image lab2.0软件。

光可裂解基团保护的三磷酸脱氧尿苷衍生物酶促掺入寡聚核苷酸及其与荧 光基团连接

聚合酶链式反应在PCR管(200μL)中进行，反应体积50μL，每个反 应包括1μM无荧光素连接的引物(5′-ATG GGA CTA ACT AAT CTT TGC TTA-3′（SEQ ID No.3）)和1.2μM模板(5′-TCC TAG TTA TAA GCA AAG AAGA TTA GTT AGT CCC AT-3′（SEQ ID No.4）),50μM dATP和dUnTP*,1 U Vent exo-在1×Vent exo-聚合酶缓冲液中，PCR反应完成后，反应体系 使用3kDa的超滤管（Millipore Amicon^TM Ultra）除去缓冲液和未反应的三 磷酸单体。超滤后重新溶于1×Vent exo-聚合酶缓冲液。然后50μM dATP, dCTP,dGTP,50μM dUnTP（或dUoTP）和1U Vent exo-聚合酶加入到体 系中。PCR反应完成后，反应体系使用3kDa的超滤管（Millipore Amicon^TMUltra）除去缓冲液和未反应的三磷酸单体。超滤后重新溶于50μL NaHCO₃(0.1mM,pH=8.3)。5(6)-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯(10mM in DMF,5μL) 加入到反应液中并于60℃振摇12小时。经过乙醇沉降和凝胶柱分离 (NAP-10),TAMRA（5(6)-羧基四甲基罗丹明）标记的寡聚核苷酸溶解于50μL NaHCO₃(0.1mM,pH=8.3)中并经过紫外光照(365nm,11mW/cm²)十分钟以 脱除光活性基团保护。异硫氰酸荧光素(10mM in DMSO,5μL)加入到体系 中并于60°C振摇12小时。沉降、脱盐、浓缩后，得到双荧光基团标记的 寡聚核苷酸。产物重新溶于50μL H₂O,取5μL加入1μL上样缓冲液用20% (v/v)变性聚丙烯酰胺凝胶（7M urea）(1×TBE buffer,pH=8.2)分析。用高灵 敏化学发光凝胶成像分析系统（Bio-red ChemiDoc XRS System）进行成像， 图像采集和数据处理使用Image lab 2.0软件。

长链DNA的随机修饰及标记

模板的制备

聚合酶链式反应在PCR管(200μL)中进行。

每个反应包括1μM上游引物(5′-GAG GCG GTT TGC GTA TTG G-3′ （SEQ ID No.5）)，1μM下游引物(5′-GTC GTG TCC TAC GGG GTT  GGA-3′（SEQ ID No.6）)，1ng PUC18质粒，250μM dNTP，2U Taq在 1×Taq聚合酶缓冲液中，总体积100μL。

PCR反应循环温度：94°C4分钟，(94°C，15s；55°C，15s；72 °C，1min)30个循环。反应用TAKARA^TM PCR回收试剂盒回收,回收溶液 冻干，加水定量到0.2μM。

长链核酸的随机修饰及标记聚合酶链式反应在PCR管(200μL)中进行。 每个反应包括1μM上游引物(5′-GAG GCG GTT TGC GTA TTG G-3′)， 0.01μM长链DNA模板，250μM dNTP,50μM dUnTP（或dUoTP）,1U Vent exo-在1×Vent exo-聚合酶缓冲液中。PCR反应循环温度：94°C4分钟， (94°C，15s；55°C，15s；68°C，2min)40个循环。反应混合物经过 紫外光照(365nm，11mW/cm²)十分钟以除去光活性保护基。经过与标记寡 聚核苷酸相同的过程，得到了长链随机标记的DNA。产物溶解于50μL H₂O, 取5μL加入1μL上样缓冲液，1%琼脂糖凝胶电泳分离(1×TAE buffer, pH=8.0)。用高灵敏化学发光凝胶成像分析系统（Bio-red ChemiDoc XRS  System）进行成像，图像采集和数据处理使用Image lab2.0软件。

实验例1三磷酸尿苷单体光照脱保护动力学表征实验

进行酶促反应前，考察了实施例6和7合成的三磷酸化合物单体 dUoTP和dUnTP光照脱保护的动力学特征。dUoTP(1mM,3mL)和 dUnTP(1mM,3mL)分别置于石英池中，给予紫外光(365nm,11mW/cm²) 辐照，每个时间点取200μL用于HPLC分析。HPLC曲线显示出原料的减 少和新生成产物的增多，并可用于定量分析光照脱保护效率。图3显示 dUnTP的峰面积（保留时间9.5分钟）逐渐减少，光照10分钟后几乎完 全消失，同时产物（dUnTP*）的峰面积（保留时间3.2分钟）逐渐增加。 对于dUoTP观察到了和dUnTP一样的现象，只是光照脱保护速率更慢（图 4）。在本发明实验条件下，dUnTP光照脱保护半衰期时间是5.0分钟， dUoTP是7.5分钟。

实验例2光活性三磷酸核苷类似物dUoTP和dUnTP掺入到DNA中的 实验

根据文献报道，光活性三磷酸核苷类似物主要作为链终止物被用于 高通量测序等方面，这说明光活性三磷酸单体被酶掺入DNA链中后会阻 碍下一个三磷酸核苷的掺入。为了研究本发明的光活性三磷酸核苷类似物 dUoTP和dUnTP的光活性基团对酶促反应的影响，将实施例6和7合成 的dUoTP和dUnTP以及它们的脱光活性基团的产物（分别为dUoTP*和 dUnTP*）作为底物用于聚合酶链式反应。

本实验选用了三种常用的DNA聚合酶（Taq,Vent exo-和T₄）。 模板链的长度为33个碱基，序列为：5'-TCC TTG TGA TAA GCA AAG  ATT AGT TAG TCC CAT-3'，引物链的长度为24个碱基，序列为：5'-ATG GGA CTA ACT CTT TGC TTA-3'，模板和引物都来自固相合成并经过高 效液相色谱的纯化，dUoTP或dUnTP将被合成到引物的第25个碱基上。 另外为了便于分析，引物链的5'末端标记了荧光素（FAM），在聚丙烯酰 胺凝胶分析时，模板链并不能被激发显影，不会影响产物的分析，而带荧 光素的引物链能够被激发显影，指示出不同长度的PCR产物。

聚丙烯酰胺凝胶结果见图5。A图是dUnTP和dUnTP*的结果，B 图是dUoTP和dUoTP*的结果；对于Taq,和Vent exo-DNA聚合酶， Control条带显示引物并没有明显的延伸，但是对于T₄聚合酶，Control 条带没有原长引物条带，而有一个更短的条带出现，这是因为T₄聚合酶 有3′→5′内切酶活性。作为对比，‘dTTP’条带显示完全延伸的引物，长度 为33个碱基，这是因为使用所有四种天然核苷作为酶的底物使引物延伸 至与模板相同的长度。使用dUnTP,dUnTP*,dUoTP和dUoTP*代替dTTP 后，引物的延伸并没有明显的区别，这说明三种常用的DNA聚合酶成功 的将dUnTP或dUoTP掺入到引物链中。

实验例3寡聚核苷酸定点标记单荧光及双荧光实验

对寡聚核苷酸进行单点修饰:本实验使用和实验例2中一样的引物和 模板序列，不同的是引物上没有荧光素修饰。将dUnTP作为PCR底物完 成引物延伸之后，反应液进行光照脱除光活性保护基团，然后成功的将异 硫氰酸酯荧光素（FITC）连接到核酸链上。图6为变性聚丙烯酰胺凝胶 显示FITC标记的寡聚核苷酸在SYBR^TM Gold DNA染料染色前（A）后 （B）的区别。FITC标记的寡聚核酸能在染色前能直接被观察到，染色后 与正常延伸引物对照表明该FITC标记的核酸为全长延伸引物。

此外，图7中(A)(B)为FITC标记的寡聚核苷酸的紫外吸收及荧光发 射光谱。另一个在延伸区域有两个腺苷的序列作为双功能化的模板。在第 一次PCR反应时，dUnTP*被酶促掺入到引物链中，由于反应液不含三磷 酸胞苷，链延伸被终止。在除去所有三磷酸底物后，新的聚合酶，dUnTP 及其它三种天然三磷酸核苷被加入到反应体系中，经过PCR反应后， dUnTP也被酶促掺入到同一条链中并获得全长寡聚核苷酸。经过缓冲液交 换，5(6)-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯(5/6-TAMRA,SE）加入到反应 体系中用于dUnTP*上氨基的标记。TAMRA标记的寡聚核苷酸经过光照 脱保护，再次裸露出反应活性的氨基，加入FITC之后，获得了双荧光基 团标记的寡聚核苷酸。图8为变性聚丙烯酰胺凝胶显示双荧光标记的寡聚 核苷酸在SYBR^TM Gold DNA染料染色前（A）后（B）的区别。荧光基 团标记的寡聚核苷酸能在染色前直接被观察到，染色后与正常延伸引物对 照表明该双荧光标记的核酸为全长延伸引物。此外，图7中(C)(D)为双荧 光基团标记的寡聚核苷酸的紫外吸收及荧光发射光谱。

按照同样的实验方法，将掺入dUoTP的引物链光照脱除光活性保护基 团后进行定点单荧光及双荧光标记；实验结果发现，随机掺入dUoTP的引物 链光照脱除光活性保护基团后成功的实现了定点单荧光及双荧光标记。

实验例4长链DNA的随机连接荧光基团

在成功实现对寡聚核苷酸的定点修饰之后，选择了从PUC18质粒上 复制下来的562个碱基长度的长链DNA，对其进行随机修饰，并用于标 记荧光基团。PCR反应条件如下：50μM dUnTP和250μM四种天然三磷 酸核苷单体被加入到反应体系中。经过四十个PCR循环后，反应体系经 过光照脱保护缓冲液交换，随后，FITC加入到体系中，作用于脱保护的 带有反应活性氨基的DNA链。

图9显示琼脂糖凝胶电泳在EB染色前（A）后（B）的不同条带。 染色前，只有荧光素标记的DNA条带能直接被观察到，EB染色后，100bp DNA ladder marker及标准562bp长度DNA条带表明标记的DNA为562bp 长度。图7中（E）、（F）显示FITC随机标记的长链DNA的紫外吸收 和荧光发射光谱。通过计算核酸的260nm紫外吸收及FITC的488nm紫 外吸收，平均标记效率（被标记的尿苷/(未标记的尿苷+胸苷)）为12%， 大约是修饰三磷酸尿苷与三磷酸胸苷投料比（1:5）的60%。

按照同样的实验方法，将dUoTP随机掺入到长链DNA中，光照脱 保护后，将FITC加入到体系中进行随机标记；实验结果发现，随机掺入 dUoTP的长链DNA也成功的标记上荧光基团。

                       

<110>  北京大学

 

<120>  光可裂解基团保护的三磷酸脱氧尿苷衍生物及其合成方法和应用

 

<130>  DQXL--0068

 

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<170>  PatentIn version 3.5

 

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<212>  DNA

<213>  artifical sequence

 

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tccttgtgat aagcaaagat tagttagtcc cat                                    33

 

 

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atgggactaa ctctttgctt a                                                 21

 

 

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<212>  DNA

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