5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮在制备镇痛抗炎药物中的应用

摘要

本发明涉及有机化合物的药物应用，具体地，涉及5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮在制备镇痛抗炎药物中的应用。药理实验结果表明，该化合物对疼痛和炎症具有更好的抑制作用，可作为有效成分用于风湿性关节炎、类风湿性关节炎等疾病的预防与治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及有机化合物的药物应用，具体地，涉及5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮在制备镇痛抗炎药物中的应用。 

背景技术

目前镇痛抗炎药主要分为两大类：甾体类和非甾体类。甾体类抗炎药主要是皮质激素类药物，此类药物虽然有较好的疗效，但是长期使用可引起水盐代谢、糖、脂肪、蛋白质代谢的严重紊乱。非甾体抗炎药是在风湿关节炎的治疗中占主要地位，但长期使用此类药物也会造成严重的毒副作用。如吲哚美辛，在治疗过程中常常会出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻及溃疡，有时还会出现胃出血和穿孔、头痛、眩晕等临床症状。因此为广大风湿及类风湿性关节炎患者寻找高效低毒的新药是非常有意义的。 

龙须藤为豆科苏木亚科羊蹄甲属植物龙须藤Bauhinia championii(Benth.)Benth.的干燥藤茎，别名又称为圆过岗龙、羊蹄藤、九龙藤、梅花入骨丹等。主要分布于福建、广西、广东、浙江、江西、湖北、贵州、台湾等地。性味甘、微苦、温，具有祛风除湿、行气活血的功效。该药在我国多个少数民族广泛用于治疗风湿性关节炎、跌打损伤，疗效显著。 

目前，市场上的龙须藤产品如康美肤烧伤膏、痛经一贴灵散等用于风湿性关节炎、类风湿性关节炎、痛经等疾病的治疗，有显著的祛风除湿、活络止痛疗效，且临床上未发现任何毒副作用。但上述制剂，产品技术含量较低。近年来，国内外陆续有对龙须藤化学成分的研究报道，但均未涉及龙须藤镇痛抗炎药效物质基础的研究。 

已有文献表明，龙须藤中含有黄酮类化合物，具有明显的镇痛抗炎活性，可以抑制某些炎症介质和细胞因子的生成，是康美肤烧伤膏中的主要成分。但是龙须藤中黄酮类化合物成分复杂，目前发现约十几种，而且不同化合物结构上的细微差别，也会使其功效相差甚远。到底其中哪一种黄酮类化合物的抗炎镇痛效果更佳，目前尚未有公开报道。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有镇痛抗炎药物成分复杂、功效分散的缺陷，提供一种效果更佳的多甲氧基黄酮在制备镇痛抗炎药物中的应用。 

5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮是一种黄酮类化合物，存在于龙须藤、过岗龙等植物之中，其化学结构式为 

虽然有研究从植物中分离得到5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮，但是到目前为止，尚未有关于该化合物药理作用的报道，也没有该化合物的镇痛抗炎作用的相关报道。 

发明人发现，5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮的镇痛抗炎功效显著高于其他黄酮类化合物。当5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮的剂量不大于0.08g/kg时，即能起到有效的镇痛抗炎作用。而针对风湿性关节炎、类风湿性关节炎，当5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮的剂量不大于0.04g/kg时，即能起到有效的镇痛抗炎作用。 

本发明利用现代技术手段，对传统中药进行二次开发，首次对龙须藤药材中5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮采用疼痛模型（热板法、醋酸扭体法）和炎症模型（二甲苯致小鼠耳廓肿胀法、醋酸致小鼠毛细血管通透性变化）进行镇痛抗炎药效研究，并将其与龙须藤中的另一化合物5,6,7,5’-四甲氧基-3’,4’-亚甲二氧基黄酮、龙须藤75%乙醇提取物在相同剂量下产生的镇痛抗炎作用进行了对比，研究结果显示5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮对疼痛和炎症具有更好的抑制作用，可作为有效成分用于风湿性关节炎、类风湿性关节炎等疾病的预防与治疗。 

具体实施方式

实施例1 

（1）5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮的制备 

5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮属于已知化合物，可以通过现有技术中有多种方法制得，例如参考赵钟祥等在《过岗龙多甲氧基黄酮类成分的研究》（《中药新药与临床药理》2010年05期）中描述的方法从过岗龙中提取与分离。在本实施例中，参照文献[Chien CC,Yuh PC,Hong YH,et al.New flavones from Bauhinia  championii Tenth[J].Chem Pharm Bull,1984,32(1):166-169]，取龙须藤藤茎部位的乙醇浸膏加水分散后，分别用不同极性的溶剂萃取，得到石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取物；将乙酸乙酯萃取物采用硅胶柱粗分（二氯甲烷—甲醇梯度洗脱，相关流份合并后用石油醚-丙酮梯度洗脱），葡聚糖凝胶LH-20分离纯化，重结晶等制备出5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮。 

（2）5,6,7,5’-四甲氧基-3’,4’-亚甲二氧基黄酮的制备 

本发明实施例的一个对照组是从龙须藤中分离出的另一化合物5,6,7,5’-四甲氧基-3’,4’-亚甲二氧基黄酮，其制备方法同5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮的制备方法。 

（3）龙须藤75%乙醇提取物的制备 

本发明实施例的另一个对照组是龙须藤75%乙醇提取物，其制备方法为：龙须藤药材用6倍量的75%乙醇回流提取3次，每次2h，过滤合并后回收乙醇即得。 

实施例2 

5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮的药理活性筛选结果： 

下述实验对龙须藤中分离出的两种黄酮——5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮、5,6,7,5’-四甲氧基-3’,4’-亚甲二氧基黄酮以及龙须藤75%乙醇提取物、相关药效的阳性对照药进行了镇痛抗炎药效的对比。 

（1）对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响 

取小鼠110只，雌雄各半，随机分为11组，每组10只：空白对照组（5%～20%丙二醇生理盐水）、5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮低、中、高（0.04,0.08,0.16g·kg^-1，丙二醇溶解的混悬液，剂量以5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮计算）3个剂量组，5,6,7,5’-四甲氧基-3’,4’-亚甲二氧基黄酮低、中、高（0.04,0.08,0.16g·kg^-1，丙二醇溶解的混悬液，剂量以5,6,7,5’-四甲氧基-3’,4’-亚甲二氧基黄酮计算，该黄酮也是从龙须藤中提取分离出的单体化合物）3个剂量组，龙须藤75%乙醇提取物低、中、高（0.04,0.08,0.16g·kg^-1，丙二醇溶解的混悬液，剂量以生药材量计算）3个剂量组，阳性对照为吲哚美辛，剂量0.0075g/kg。各组小鼠均灌胃给药3d，每天1次，给药容量20ml/kg。末次给药1h后，尾静脉注射0.5﹪伊文斯蓝生理盐水溶液10ml/kg，5min后腹腔注射0.6﹪冰醋酸10ml/kg，20min后脱颈椎处死小鼠，剖腹，用6ml生理盐水分数次冲洗腹腔，收集冲洗液于10ml离心管中，离心，取上清液于分光光度计波长590nm处测定吸光度（A）。 

表1各组对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加的抑制作用 

注：上表中A为5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮，B为5,6,7,5’-四甲氧基-3’,4’-亚甲二氧基黄酮，C为龙须藤75%乙醇提取物；与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。 

本实验结果表明：本发明5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加有较好的抑制作用，这种抑制作用优于同剂量的5,6,7,5’-四甲氧基-3’,4’-亚甲二氧基黄酮，远胜于同剂量的龙须藤75%提取物的作用，接近吲哚美辛的抑制活性。 

（2）对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响 

取小鼠110只，雌雄各半，随机分为11组，每组10只：空白对照组（5%～20%丙二醇生理盐水）、5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮低、中、高（0.04,0.08,0.16g·kg^-1，丙二醇溶解的混悬液，剂量以5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮计算，以下同）3个剂量组，5,6,7,5’-四甲氧基-3’,4’-亚甲二氧基黄酮低、中、高（0.04,0.08,0.16g·kg^-1，丙二醇溶解的混悬液，剂量以5,6,7,5’-四甲氧基-3’,4’-亚甲二氧基黄酮计算）3个剂量组，龙须藤75%乙醇提取物低、中、高（0.04,0.08,0.16g·kg^-1，丙二醇溶解的 混悬液，剂量以生药材量计算）3个剂量组，阳性对照组为吲哚美辛，剂量0.0075g/kg。各组小鼠均灌胃给药3d，每天1次，给药容量20ml/kg。各组末次给药60min后将二甲苯均匀涂在每只小鼠右耳正反两面致炎，每只0.02ml，左耳不涂作对照，致炎后30min脱颈椎处死小鼠，沿耳廓基线剪下双耳，用直径9mm的打孔器在相同位置取左右两耳片于分析天平上称重，按下式计算左耳片和右耳片重量的差值(肿胀度)及抑制率。 

肿胀度(mg)=右耳片重－左耳片重 

表2各组对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响 

注：上表中A为5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮，B为5,6,7,5’-四甲氧基-3’,4’-亚甲二氧基黄酮，C为龙须藤75%乙醇提取物；与空白对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01。 

本实验结果表明5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮能显著抑制二甲苯所引起的小鼠耳廓肿胀，且抑制作用强于相同剂量下的5,6,7,5’-四甲氧基-3’,4’-亚甲二氧基黄酮和龙须藤75%乙醇提取物，接近阳性对照药的药效。 

（3）对小鼠热板致痛的影响 

将热板温度调节至55±0.5℃，置小鼠于热板上，测定各小鼠的正常痛反应时间，测两次，以平均值不超过30s为合格，共选出110只雌性小鼠，称重，随机分为11组：空白对照组（5%～20%丙二醇生理盐水）、5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮低、中、高（0.04,0.08,0.16g·kg^-1，丙二醇溶解的混悬液，剂量以5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮计算）3个剂量组，5,6,7,5’-四甲氧基-3’,4’-亚甲二氧基黄酮低、中、高（0.04,0.08,0.16g·kg^-1，丙二醇溶解的混悬液，剂量以5,6,7,5’-四甲氧基-3’,4’-亚甲二氧基黄酮计算）3个剂量组，龙须藤75%乙醇提取物低、中、高（0.04,0.08,0.16g·kg^-1，丙二醇溶解的混悬液，剂量以生药材量计算）3个剂量组，阳性对照组为罗通定，剂量0.04g/kg。各组小鼠均灌胃给药3d，每天1次，给药容量20ml/kg，末次给药30min，60min，90min，120min后分别测小鼠痛阈值。 

表3各组对小鼠热板致痛的影响 

注：上表中A为5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮，B为5,6,7,5’-四甲氧基-3’,4’-亚甲二氧基黄酮，C为龙须藤75%乙醇提取物；与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。 

本实验表明5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮中、高剂量组均能显著抑制热板刺激诱导的小鼠疼痛反应，且高剂量组持续时间长，表现为痛阈值升高；5,6,7,5’-四甲氧基-3’,4’-亚甲二氧基黄酮仅高剂量组显示显著性的抑制作用（P<0.05)，而龙须藤75%乙醇提取物在这些剂量下无显著性抑制作用。综上所述，5,7,3’,4’,5’-五甲 氧基黄酮对热板导致小鼠的痛反应的抑制作用强于5,6,7,5’-四甲氧基-3’,4’-亚甲二氧基黄酮和龙须藤75%乙醇提取物。 

（4）对冰醋酸诱发的小鼠扭体反应的影响 

取小鼠110只，雌雄各半，随机分为11组，每组10只：空白对照组（5%～20%丙二醇生理盐水），5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮低、中、高（0.04,0.08,0.16g·kg^-1，丙二醇溶解的混悬液，剂量以5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮计算）3个剂量组，5,6,7,5’-四甲氧基-3’,4’-亚甲二氧基黄酮低、中、高（0.04,0.08,0.16g·kg^-1，丙二醇溶解的混悬液，剂量以5,6,7,5’-四甲氧基-3’,4’-亚甲二氧基黄酮计算）3个剂量组，龙须藤75%乙醇提取物低、中、高（0.04,0.08,0.16g·kg^-1，丙二醇溶解的混悬液，剂量以生药材量计算）3个剂量组，阳性对照为罗通定，剂量0.04g/kg。各组小鼠均灌胃给药3d，每天1次，末次给药30min后，各鼠均腹腔注射0.6﹪冰醋酸10ml/kg。观察20min内各组内每只小鼠出现扭体次数，按下式计算每组的平均值及各药抑制率。 

表4各组对冰醋酸致小鼠扭体反应的影响 

注：上表中A为5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮，B为5,6,7,5’-四甲氧基-3’,4’-亚甲二氧基黄酮，C为龙须藤75%乙醇提取物；与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01. 

本实验结果表明：与5,6,7,5’-四甲氧基-3’,4’-亚甲二氧基黄酮和龙须藤75%乙醇提取物相比，5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮对冰醋酸引起的小鼠扭体反应有着更强的抑制作用，具有统计学意义（P<0.05)，且其抑制作用接近于阳性对照组。 

以上实验结果均表明，5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮对疼痛和炎症具有更好的抑制作用，可作为有效成分用于风湿性关节炎、类风湿性关节炎等疾病的预防与治疗。与其他黄酮类化合物相比，其只需要较低的剂量，就能达到同样的效果。因此将其应用到制备抗炎镇痛药物时，能够显著降低药物的摄入量，减轻病人对药物的依赖性或其他副作用。