新颖的洛德乳酸杆菌菌株及其应用于改善自体免疫疾病的用途

摘要

本发明是有关于一种经分离的新颖菌株BR101，该菌株是分离自新生儿粪便检体，利用菌种特性与16S rDNA基因片段序列进行比对鉴定为洛德乳酸杆菌菌种，并与其他洛德乳酸杆菌标准菌株作菌落外观型态差异、16SrDNA基因片段差异、随机引子对扩增多态性DNA分析、API50CHL微生物醣类生化反应、刺激分泌IL-10的益生菌株筛选及其功能分析，显示该菌株BR101与其他标准菌株有显著差异，且该分离株可刺激细胞产生较高的抗发炎激素，降低自体免疫的发炎反应，可运用于改善自体免疫疾病。

说明书

技术领域

本发明涉及一种新颖的菌株分离株BR101，特别是涉及一种源自于新生儿粪便检体，经16S rDNA基因片段序列进行比对鉴定为洛德乳酸杆菌菌种，并与其他洛德乳酸杆菌标准菌株作比对，显示该菌株BR101与其他标准菌株有显著差异，并具有刺激细胞产生较高的抗发炎激素，降低自体免疫的发炎反应，达到改善自体免疫疾病的新颖的洛德乳酸杆菌菌株。其于2012年9月24日寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，寄存编号CGMCC No.6637，也寄存于中国台湾食品工业发展研究所，寄存编号BCRC910512。 

背景技术

免疫系统对于生物体的生存扮演着关键性的角色，它帮助我们对抗各种感染性的微生物，包括细菌、病毒、真菌、寄生虫等。当病源性微生物入侵人体，免疫系统就会产生一连串的免疫反应，包括细胞免疫与体液免疫。细胞免疫利用吞噬细胞或是毒杀型T细胞杀灭入侵的微生物；体液免疫就是产生抗体等物质对付病原菌。在这样严密的保护下，人体可说是固若金汤，难以攻克的城池。自体免疫疾病就是自己的免疫系统失控，如脱缰野马攻击自己的组织或器官。如果攻击自己的关节软骨就称为类风湿性关节炎，攻击自身的脊椎就是僵直性脊椎炎，攻击胰脏会造成第一型糖尿病，攻击眼球就是虹彩炎，攻击全身的血管就是红斑性狼疮。这些疾病虽然目前病因不明，症状也各不相同，但是致病的机转都是免疫系统的失调，因此治疗方法都是以调节免疫系统为目标。 

自体免疫疾病(Autoimmune disease)是一种免疫系统攻击自己身体正常细胞的疾病，人体的免疫系统中具有抗体可抵抗外来的抗原，如细菌或病毒，或体内不正常的细胞，如肿瘤细胞等进行攻击与清除，这样的行为是一种保护身体的生理机制。但自体免疫疾病是免疫系统自行产生出会对抗自己身体体内正常细胞的抗体，造成不正常的发炎反应或组织伤害，进而影响身体健康的疾病。这些抗体称为自体免疫抗体(Autoantibody)，有时还会通过细胞激素(Cytokine)造成免疫系统的失调。 

自体免疫疾病最常见的原因是感染，特别是细菌或病毒的传染。某些病原体的结构与宿主的抗原相似，免疫系统为了清除这些外来的病原体，因此攻击自己的正常细胞。如引起红斑性狼疮的EB病毒的分子结构和身体内的 DNA结构相似，EB病毒感染人体后，免疫系统为了防御EB病毒的入侵，同时也攻击正常的体内细胞，就产生红斑性狼疮的症状。另外引起僵直性脊椎炎KB病毒的某个片段，和脊椎关节细胞分子相似，在正常免疫系统的误认下，产生了僵直性脊椎炎的症状。这些病原体暴露出的抗原分子会被免疫系统认为是自身的抗原，以避免攻击。当免疫系统对病原体做出反应时，也会对那些被病原体真正自身抗原所在的细胞与器官进行攻击。目前广为人知的疾病包括第二型腺病毒造成的脑炎所引发的多发性硬化或链球菌感染引发的风湿热(rheumatic fever)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)及有些种类病毒引发的糖尿病等。 

第二种原因是体内正常且隐藏性的抗原被释放出来，被免疫系统视为外来的病原体进而攻击。人体免疫系统对自身具有辨识保护机制，称为免疫耐受性(Tolerance)，例如母体内的胎儿不会被正常的母体免疫系统所排斥，或在眼睛、心脏和男性生殖系统等处发生的自体免疫疾病。第三种原因则是具有调节免疫系统正常运作的调节性T细胞(Regulator T cell，Treg)出现功能异常，无法正常调节免疫系统所致。其他的原因有MHC基因的影响，亦即遗传，例如僵直性脊椎炎和HLA-B27有关。红斑性狼疮的遗传性约占了10％左右；或某些淋巴瘤细胞因不明原因发生改变后，制造及释出抗自身组织的抗体。当免疫耐受性被破坏，原本该隐藏的抗原暴露，免疫系统以为是外来抗原而攻击。最常见的例子是红斑性狼疮的脸部红斑，当照射紫外线时，过量的紫外线破坏表皮细胞，使表皮细胞隐藏的抗原暴露释出，产生脸部红斑(Malarash)。 

常见的自体免疫疾病有：系统性红斑性狼疮(SLE)，类风湿性关节炎(RA)、僵直性脊椎炎(AS)、干癣、干燥症、硬皮病、皮肌炎、血管炎等。类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)，为造成关节破坏最严重的关节炎，其好发于手部MCP、PIP或Wrist等关节。主要症状为全身关节痛，通常早期病人同时伴有早上起床手指僵硬(Morning stiffness)超过一个小时。晚期可见手变形严重(Swan-neck deformity；Z-shape deformity)，各式各样的变形均有可能，更严重将导致行动不便，终生坐轮椅。RA也可能引发关节外的症状(因免疫为全身性)，最常见的症状为干眼症(干燥症候群Sjogren’syndrome)，眼睛干涩，常常需点眼药水；嘴巴干，需常常喝水；第二常见症状为类风湿肺(Rheumatoid lung)，指的是下肺叶的纤维化，肺功能变差。有些病人会并发血管炎，主要发生于皮肤表浅处，特别是脚部。更有些病人会并发眼睛发炎或血管循环不好，常常感到手脚冰冷；系统性红斑性狼疮(Systemic Lupus Erythematosus)，其主要症状为关节痛、严重掉发、皮肤光敏感(Photosensitivity)甚至严重者脸部出现蝴蝶斑(Malarrash)，早期只有淡淡的脸部红斑，好发于年轻女性，女男比十比一。系统 性红斑狼疮是一种多器官的自身免疫性疾病，是因B细胞活动过度，导致产生过多的自身抗体。系统性红斑狼疮患者器官组织的损伤是由炎症反应的免疫复合物沉积所致，患者容易有嘴干、眼干、反复性嘴巴破皮(Oralulcers)；皮肌炎/多发性肌炎(Derma tomyositis/Polymyositis)，皮肌炎症状为肌肉无力、肌肉痛，且是近端肌肉无力(Proximal muscle weakness)，有些患者蹲下去无法站起来或无法坐起来。好发于年轻女性，常见症状为整个脸上有红斑，甚至连眼皮都有红斑，红斑也会出现在手上，因为皮的发炎，手的皱折最多为指节，所以指节常见红斑(Gottron′s sign)。若仅是肌肉无力，但皮肤没有症状则称为多发性肌炎。重症肌无力症是一种会导致肌肉无力、易疲劳的疾病，主要是因为神经无法有效的把其信号传至肌肉，它会影响到许多不同的肌肉，例如控制眼球的肌肉，控制脸上表情、咀嚼、说话、吞咽的肌肉以及四肢。由于每个人受影响的肌肉不同，临床症状也就不尽相同。肌肉要运动，就要靠运动神经释放一种化学物质称为乙酰胆素，乙酰胆素与其接受体结合后，才能产生足够的电位变化来引起肌肉运动。乙酰胆素分解脢则将它分解，使电位恢复。肌无力症的病人，因为体内产生了一种乙酰胆素接受体的抗体，进而导致接受体的破坏与数目的减少，使神经与肌肉间的传导功能受损；硬皮症(scleroderma syndrome)，在患病的早期表现为脸部或前胸后背皮肤都很紧而且僵硬，晚期甚至是手指头都紧且僵硬，称为硬指症(Sclerodactyly)，从近端到远端开始僵硬，有些病人更会并发肺的纤维化(Pulmonaryfibrosis)。硬皮症最特殊的症状为雷诺氏现象(Raynaud phenomenon)，因血液循环不良，手指头会变色，因缺氧先成白色，又因硬化(sclerosis)再变成蓝色，因为充血(Reactive hyperemia)最后再变红。 

综合上述，在正常情况下，自我的免疫耐受性机制可以使个体免于自我反应(self-reaction)。当这种机制无法正常运作，免疫系统会促使T细胞或B细胞活化，产生体液性或细胞性的反应，对抗自身的抗原，这些反应使细胞及器官受到伤害。自体免疫疾病可以被分成两类，一为器官专一性(organ-specific)，免疫反应直接攻击单独的器官或腺体的特定目标抗原(target antigen)，所以只有某一器官的功能可以被自体抗体(autoantibodies)刺激或阻断，而出现病变，如溶血性贫血、重症肌无力、胰岛素型糖尿病；二为全身性自体免疫疾病(sys temic autoimmune)，作用的是大范围的全身性目标抗原，引起全身性的组织伤害，其是藉由免疫复合体(immune complex)的堆积或是藉由自体抗体所引发的细胞性反应或直接造成细胞的伤害，如多发性硬化症。对于过度活化的免疫系统，人体有自我调节的机制，那就是调节型T细胞(Regulatory T cells，Tregs)。调节型T细胞是在胸腺中持续性的产生，存续在血液循环中。当对抗病源微 生物的战争到达尾声，调节型T细胞开始执行它的任务，它扮演煞车的角色，使免疫系统归于平静。它的作用主要通过释放抗发炎的细胞激素(anti-inflammatory cytokine)，包括间白素10(IL-10)及肿瘤坏死因子-贝塔(TGF-β)。细胞激素就是细胞间沟通的语言，当其它的免疫细胞像是树突细胞(dendritic cell)、发炎性T细胞(inflammatory T cell)、巨噬细胞和B细胞，接受到间白素10与肿瘤坏死因子-贝塔的信号，就会停止增生，抑制活化，甚至进行雕亡，于是发炎反应就会缓解，免疫系统归于平静。根据过去对于调节型T细胞的研究，它的功能之一是辨识自身抗原，避免自体免疫性疾病的产生。研究中发现调节型T细胞缺失会造成致命的自体免疫性疾病，淋巴球失控性的增生，产生严重的发炎反应。在人体研究中发现，调节型T细胞在自体免疫病的致病机转中扮演重要的角色。调节型T细胞所分泌的抗发炎激素IL-10或TGF-β可以作为评估调节型T细胞的功能指标。益生菌在肠道中生长，能够通过肠道的淋巴组织，刺激人体调节型T细胞的增生。因为益生菌的细胞壁胜肽聚醣的成分能够和免疫细胞中的接受器结合，使调节型T细胞活化增生，成熟的调节型T细胞会分泌IL-10与TGF-β，通过这些抗发炎的细胞激素，能够抑制发炎型T细胞，使发炎反应缓解。因此口服益生菌对于自体免疫的发炎反应具有调节的作用。 

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于，提供一种产生高抗发炎细胞激素的分离株BR101，本发明的分离株BR101是筛选自新生儿粪便检体的菌种，其是寄存于食品工业发展研究所，寄存编号为BCRC910512。 

本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种经分离的微生物分离株BR101，其是一可产生高抗发炎细胞激素的分离株，其寄存于食品工业发展研究所，寄存编号为BCRC910512。 

本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。 

前述的分离株，是筛选自婴儿粪便检体。 

前述的分离株，是经16S rDNA基因片段序列进行比对鉴定为洛德乳酸杆菌菌种。 

前述的分离株，具有洛德乳酸杆菌菌种所有被鉴知的特性。 

前述的分离株，是经革兰氏染色镜检观察结果为革兰氏阳性杆菌。 

前述的分离株，具有触酶。 

前述的分离株，不具有氧化酶。 

前述的分离株，不具有运动性。 

前述的分离株，于厌氧好氧环境皆会生长。 

前述的分离株，可发酵醣类熊果苷、马栗树苷唐及D-来苏糖。 

前述的分离株，具有刺激人类周边血球细胞产生抗发炎细胞激素的能力。 

前述的分离株，可产生较其他益生菌种高的抗发炎细胞激素。 

前述的分离株，其中该益生菌为比菲德氏龙根菌、副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、肠球菌及鼠李糖乳杆菌所组成的群组。 

前述的分离株，其中该抗发炎细胞激素为间白素10及肿瘤坏死因子-β所组成的群组。 

前述的分离株，其中该抗发炎细胞激素侦测为利用酵素免疫分析方法进行分析。 

前述的分离株，其中所述的酵素免疫分析方法，包括ELISA assay、ELISPOT assay及其他应用酵素免疫原理所组成的方法。 

本发明的目的及解决其技术问题还采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种可刺激细胞激素产生的组合物，其包括：提供一有效量的如前面所述的微生物分离株BR101；以及将该分离株添加赋型剂后填充胶囊。 

本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。 

前述的组合物，适应症是自体免疫疾病。 

前述的组合物，其中该自体免疫疾病包含类风湿性关节炎、僵直性脊椎炎及红斑性狼疮组成的群组。 

本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果。为达到上述目的，本发明提供了一种产生高抗发炎细胞激素的分离株BR101，本发明的分离株BR101是筛选自新生儿粪便检体的菌种，其是寄存于食品工业发展研究所，寄存编号为BCRC910512。 

本发明将分离出来的菌株利用革兰氏染色镜检观察为革兰氏阳性杆菌，其化学与物理特性为具有触酶、不具有氧化酶及运动性，于好氧、厌氧环境下皆会生长。 

本发明利用16S rDNA部分序列进行比对鉴定确认该分离株BR101为洛德乳酸杆菌菌种，并与其他三株购自生物资源保存及研究中心，BCRC14625、BCRC16091、BCRC17476标准菌株进行菌落外观型态、16S rDNA基因片段、随机引子对扩增多态性DNA分析、API50CHL微生物醣类生化反应等差异分析，显示该菌株BR101与其他标准菌株有显著差异，为一新颖的洛德乳酸杆菌。 

另一方面，本发明与其他常见的益生菌进行抗发炎细胞激素侦测分析。利用人类周边血球细胞与不同益生菌种进行共同培养后，以ELISPOT assay进行间白素10分析。ELI SPOT assay是利用呈色反应，于细胞分泌细胞激素的对应位置上显现可辨的斑点，并可直接在显微镜下人工计数斑点或利用ELISPOT辨识系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，计算出分 泌该细胞激素的细胞数量。 

本发明在综合鉴定结果中显示此分离株BR101为一新颖洛德乳酸杆菌菌株，并可产生较高的抗发炎细胞激素，可运用于降低自体免疫的发炎反应，达到改善自体免疫疾病。 

综上所述，本发明是有关于一种经分离的新颖菌株BR101，该菌株是分离自新生儿粪便检体，利用菌种特性与16S rDNA基因片段序列进行比对鉴定为洛德乳酸杆菌菌种，并与其他洛德乳酸杆菌标准菌株作菌落外观型态差异、16S rDNA基因片段差异、随机引子对扩增多态性DNA分析、API50CHL微生物醣类生化反应、刺激分泌IL-10的益生菌株筛选及其功能分析，显示该菌株BR101与其他标准菌株有显著差异，且该分离株可刺激细胞产生较高的抗发炎激素，降低自体免疫的发炎反应，可运用于改善自体免疫疾病。本发明在技术上有显著的进步，并具有明显的积极效果，诚为一新颖、进步、实用的新设计。 

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，并配合附图，详细说明如下。 

附图说明

图1是BR101的菌落外观示意图。 

图2是BR101的革兰氏染色镜检结果的示意图。 

图3A是BR101的菌落外观型态的示意图。 

图3B是BCRC14625的菌落外观与BR101作比较差异的示意图。 

图3C是BCRC16091的菌落外观与BR101作比较差异的示意图 

图3D是BCRC17476的菌落外观与BR101作比较差异的示意图。 

图4是亲缘演化树结果的示意图。 

图5是RAPD图谱的差异分析结果示意图。 

图6是利用ELISPT assay分析各益生菌分泌IL-10的结果的示意图。 

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提出的新颖的洛德乳酸杆菌菌株及其应用于改善自体免疫疾病的用途其具体实施方式、结构、方法、步骤、特征及其功效，详细说明如后。 

1.新颖性微生物BR101菌种鉴定 

利用筛选培养基分离单一菌落，且观察菌落外观型态及革蓝氏染色结果，并配合16S rDNA基因片段序列比对，结果显示此分离株BR101为洛德 乳酸杆菌菌种(Lactobacillusreuteri)。 

1.1菌落外观及革蓝氏染色镜检 

本发明BR101菌株乃是利用新生儿粪便检体，以ROGOSA-琼脂平板(ROGOSA-AGAR plate)(Merck，Cat No.1.05413.0500)作为选择性培养基进行菌种分离，将分离的单一菌落以MRS Broth(Merck，Cat No.1.10661.0500)培养基于摄氏37度环境下培养48小时，将单一菌落进行分析，挑选分离株BR101进行菌种鉴定。由试验结果显示，此分离株BR101菌落外观为圆形，白色菌落，表面光滑凸起状，结果如图1所示。依革兰氏染色结果显示，染色后呈蓝紫色，分离株BR101为革兰氏阳性杆菌，结果如图2所示。不具有运动性，具有触酶，不具有氧化酶，好氧及厌氧环境下皆会生长。 

1.216S rDNA基因片段序列 

根据2002P.S.M.Yeung et.al.等人研究指出，利用特殊引子对：Primer PAF[5′AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG3′]与Primer 536R[5′GTA TTA CCG CGG CTG CTG 3′]，进行乳酸菌16S rDNA gene PCR放大即可进行乳酸菌属的鉴定。BR10116S rDNA基因片段序列(约计555bp)，且将基因片段序列经美国国家生物技术资讯中心(NCBI)提供的核酸基因库序列比对工具(Nuclotide BLAST)比对结果显示如表1-3所示，分离株BR101为洛德乳酸杆菌菌种(Lactobacillus reuteri)，且结果显示BR10116S rDNAgene片段与洛德乳酸杆菌菌种(Lactobacillus reuteri)高达99％的相似度，因此可说明本发明BR101为洛德乳酸杆菌菌种(Lactobacillusreuteri)。 

表1 Lactobacillus 16S rDNA的species primer进行PCR的序列：16S rDNA基因片段序列鉴定 

表2Sequence Blas t搜寻：BR-101与洛德乳酸杆菌有99％相似 

表3BR-101与洛德乳酸杆菌有99％相似 

1.3API50CHL微生物醣类生化反应 

利用API50CH微生物生化反应鉴定套组进行49种醣类发酵，结果显示如表4所示，本发明BR101可发酵下列12种醣类，分别为D-树胶醛醣(D-arab inose)、L-树胶醛醣(L-arab inose)、甲基-βD-比喃木糖苷(Methy1-βD-xylopyranoside)、D-分解乳醣(D-galactose)、熊果苷(Arbutin)、马栗树苷醣(Esculin ferric-citrate)、D-纤维双醣(D-celobiose)、D-麦芽糖(D-maltose)、D-乳糖(D-lactose)、D-松三醣(D-melezitose)及D-来苏醣(D-lyxose)。 

表4BR-101于API50CHL生化反应为阳性反应的醣类 

2.BR101与其他标准菌株的差异分析结果 

2.1菌落外观型态差异 

利用BR101与其他三株洛德乳酸杆菌菌种(Lactobacil lus reuteri)标准菌株(购自生物资源保存及研究中心，BCRC14625、BCRC16091、BCRC17476)进行差异分析。将4株菌接种于MRS培养基上，置于摄氏37度环境下，厌氧培养48小时，菌落型态呈现如图3A-D所示，BR101菌落(colony)呈白色、边缘(Margins)平滑(Entire)、表面凸起(Raised)；BCRC14625菌落呈白色、边缘平滑具有透明环、表面凸起；BCRC16091菌落较小、边缘平滑、菌落平坦(flat)；BCRC17476菌落呈白色、边缘平滑、表面凸起。 

2.216S rDNA基因片段差异分析结果 

利用BR101与其他三株洛德乳酸杆菌菌种(Lactobacillus reuteri)标准菌株(购自生物资源保存及研究中心，BCRC14625、BCRC16091、BCRC17476)以16S rDNA基因片段序列进行序列比对，并将BR101与其他标准菌株16SrDNA基因片段定序后，利用Vec tor NTI7.0软件进行比对，序列比对结果如表5所示，序列比对结果4株菌各代表不同洛德乳酸杆菌菌种(Lactobacillus reuteri)。显示BR101确实与其他标准菌株具有显著差异。 

表5BR-101与其他三株标准菌株的16S rDNA基因片段分析结果 

黄色标底代表4株菌序列相同处，蓝色标底代表至少3株菌序列相同处，无标底代表序列差异处 

另外利用UPGMA(Unweighted Pair-Group Method Using Arithmeticaverages)运算法，建立演化亲缘树。结果如图4所示：BR101为不同于BCRC14625、BCRC16091、BCRC17476的洛德乳酸杆菌菌种(Lactobacillusreuteri)。 

2.3利用随机引子对扩增多态性DNA分析进行差异比对 

运用随机引子对扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。这种方法即为RAPD(Random amplified polymorphic DNA，随机扩增的多态性DNA)。该RAPD技术建立于PCR技术基础上，它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引子，对所研究基因组DNA(本实验是指乳酸菌基因组DNA)进行PCR扩增，检测扩增产物DNA片段的多态性，这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位元点分布发生相应的变化，而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。利用引子Primer P3[5′GGT GAC GCA G3′]进行BR101与BCRC14625、BCRC16091、BCRC17476标准菌株基因组DNA之RAPD比对，DNA电泳图结果显示如图5所示，BR101RPAD Pattern为1050bp、700bp、400bp、280bp、190bp；BCRC14625RPAD Pattern为1400bp、1050bp、700bp、400bp、280bp、190bp；BCRC16091RPAD Pattern为1050bp、700bp、400bp、280bp；BCRC17476RPAD Pattern为2Kb、1800bp、1400bp、800bp、700bp、400bp、190bp、2Kb-700bp。此一结果证实BR101与BCRC14625、BCRC16091、BCRC17476是不同的洛德乳酸杆菌菌种(Lactobacillus reuteri)。 

2.4利用API50CHL进行菌株醣类生化反应的差异分析 

利用API50CHL检测4株菌株于49种醣类发酵的情形，观察4株菌株的醣类发酵差异情形。其中仅BR101对于Arbtine(熊果苷，也称对苯二酚葡萄糖苷)、Esculin ferric citrate(马栗树苷醣)与D-lyxose(D-来苏糖)三种醣类反应为阳性反应，显示BR101不同于其他洛德乳酸杆菌菌种(Lactobacillus reuteri)标准菌株，结果如表6所示。 

表6 BR-101与其他标准菌株的醣类生化反应差异性分析 

3.刺激分泌IL-10的益生菌株筛选及其功能分析 

病人血液样本约10毫升(ml)，将病人血液沿管壁缓慢加入含有Ficoll-Hypaque(GH Healthcare，Cat.No.17-1400-02)的离心管中，以冷冻离心机进行离心(每分钟1500转，15分钟)进行全血的血球分离，分界面处为周边血球细胞(PBMC)。将取出的PBMC置于新的15毫升(ml)离心管，并加入10ml 1×PBS至离心管中，以离心机进行离心每分钟1500转，15分钟(1500rpm，5min)，除去上清液，留下血球细胞pellet。取10毫升(ml)RPMI-1640培养基(含1％Penicillin-Streptomycin及10％Calfserum)至离心管中，来回吸冲避免气泡产生，使血球细胞均匀分布。取血球细胞悬浮液与台盼蓝(trypan blue)染剂等体积混合，以血球计数盘进行细胞计数。并以RPMI-1640培养基调整血球细胞悬浮液浓度为4.0×10⁶cells/ml备用。 

取200微升(μl)的血球细胞悬浮液加入无菌96孔盘，并加入20微升(μl)的益生菌菌液，置于摄氏37度5％CO₂环境中培养48小时后，取出上清液进行IL-10ELISPOT assay。其结果如图6所示。藉由上述筛选结果，具有刺激细胞分泌IL-10的益生菌株为BR101。 

4.利用人类周边血球细胞筛选刺激分泌IL-10的益生菌株 

自体免疫疾病中，以类风湿性关节炎较为常见，故收集类风湿性关节炎患者的血液，并分离出其人类周边血球细胞与不同益生菌种进行共同培养后，以ELISPOT as say分析判断适合类风湿性关节患者的益生菌种。进行比较分析的菌种包括副干酪乳杆菌(L.paracasei)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、比菲德氏龙根菌(B.longum)、肠球菌(E.faecium)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、本发明BR101(L.reuteri)等六种较常见的益生菌种。 

4.1BR101及其他益生菌菌株的制备 

将欲进行筛选的益生菌以MRS Broth进行培养后，以每分钟4000转，离心5分钟，去除上清液加入1×PBS buffer洗涤三次，将试管底部的沉淀物以1×PBS buffer回溶成悬浮液，并以1×PBS稀释调整菌数为5.0×108CFU/ml(以OD600进行测定，OD600为1.0时，预估菌数为5.0×108cell/ml)，置于摄氏95度水浴槽中加热处理5分钟后，置于摄氏4度备用。 

洛德乳酸杆菌L.reuter i BR101是由光晟生物科技公司筛选自婴儿粪便检体的菌种，该菌种经分子生物学鉴定为L.reuteri。将该菌株接种于MRS液体培养基中，置于厌氧环境下以摄氏37度培养6-8小时活化放大后，利用冷冻干燥方式进行冻干。冻干菌粉粉末检测菌数须大于1.0×1011CFU/g。取1g菌粉溶于10毫升(ml)无菌水中，充分均匀混合后，以每分钟4000转，离心5分钟，去除上清液加入1×PBS buffer洗涤三次，将试管底部的沉淀物以1×PBS buffer回溶成悬浮液，并以1×PBS稀释调整菌数为5.0×108CFU/ml(以OD600进行测定，OD600为1.0时，预估菌数为5.0×108cell/ml，将菌粉混合液稀释至2.0×108CFU/ml，置于摄氏95度水浴槽中加热处理5分钟后，置于摄氏4度备用。 

4.2人类周边血球细胞收集及制备 

收集病人血液样本约10毫升(ml)，将病人血液沿管壁缓慢加入含有Ficoll-Hypaque(GH Healthcare，Cat.No.17-1400-02)的离心管中，以冷冻离心机进行梯度离心(1500rpm，15min)来进行全血的血球分离，分界面处为周边血球细胞(PBMC)，沉淀物为红血球。将取出的PBMC置于新的 15毫升(ml)离心管，并加入10毫升(ml)1×PBS至离心管中，以离心机进行离心(每分钟1500转，5分钟)，除去上清液，留下血球细胞pellet。取10毫升(ml)RPMI-1640培养基(含1％Penicillin-Streptomycin及10％Calf 

serum)至离心管中，来回吸冲20次并避免气泡产生，使血球细胞均匀分布。取血球细胞悬浮液与trypan blue染剂等体积混合，以血球计数盘进行细胞计数。并以RPMI-1640培养基调整血球细胞悬浮液浓度为4.0×10⁶cell s/ml备用。 

4.3实验控制组的制备 

本试验的控制组为正常控制组(Normal control)及正控制组(Positive control)，正常控制组即为PRMI-1640(含10％FBS)；正控制组为1微克/毫升(μg/ml)LPS(Lipopolysaccharide，Escherichia coilserotype055：B5，Sigma)。本试验使用脂多糖(Lipopolysaccharide)为正控制组是因其为一大型分子由脂和多糖由共价键相连组成的。脂多糖是革兰氏阴性细菌外膜的主要组成部分，提供细菌以结构的完整性，并保护细菌膜受某些化学物质的攻击。脂多糖是内毒素，可引起强烈免疫反应。 

4.4利用ELISPOT as say进行乳酸菌刺激PBMC产生IL-10的分析 

ELISPOT as say利用呈色反应，于细胞分泌细胞激素的对应位置上显现可辨的斑点，并可直接在显微镜下人工计数斑点或利用ELISPOT辨识系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，计算出分泌该细胞激素的细胞数量。其检测原理是利用96孔盘底部PVDF材质薄膜，用来吸附特殊挑选、且无毒性(不含sodium azide、内毒素endotoxin)的单株抗体。当血液检体经过分离后的取得的PBMC(人类周边血球细胞)细胞被加至96孔盘上，利用抗原刺激后将微孔盘放置于适当温度下培养16～24小时后，记忆型T细胞在受抗原刺激数小时后会开始分泌细胞激素，此时局部(在紧靠分泌细胞的周围)分泌出的细胞激素会被PVDF薄膜上特异抗体捕获。微孔盘中的细胞被移除并清洗后，被捕获的细胞激素可进一步使用生物素(Bi o t in)标记的二次抗体来标志，其后再以结合酵素的StreptAvidin与之作用，并加入酵素受质使其呈色，有反应作用的细胞会留下染色斑点。 

其反应步骤如下： 

1)于无菌操作台中，将已预涂的(precoated)mAb9D7盘(plate)自摄氏4度回温至室温后，以无菌1×PBS洗涤4次(200μl/well)； 

2)加入200μl/well的培养基RPMI-1640(含10％FBS)于室温下进行blacking30分钟； 

3)去除培养基，以100μl 1×PBS洗涤一次，于吸水纸上轻拍； 

4)加入PBMC(细胞浓度调整为1.0×10⁶-1.0×10⁸ce1ls/ml)及BR101菌液(1.0×10⁶-1.0×10⁸CFU/ml)，最后体积约计150μl/well，此时正 对照组为mAb CD3-2同时加入，试验浓度为100ng/毫升(ml)； 

5)将盘(plate)置于摄氏37度5％CO₂培养箱中反应12～48小时； 

6)去除细胞悬浮液，加入200μl/well 1×PBS洗涤五次； 

7)稀释侦测抗体12-G8-biotin至浓度1μg/毫升(ml)于1×PBS-0.5％FBS(1×PBS含0.5％胎牛血清)，加入100μl/well稀释的抗体，于室温下反应2小时； 

8)去除上清液，加入200μl/well 1×PBS洗涤五次； 

9)稀释Streptavidin-ALP(1∶1000)于1×PBS-0.5％FBS(1×PBS含0.5％胎牛血清)，加入100μl/well于室温下反应1小时； 

10)去除上清液，加入200μl/well1×PBS洗涤五次； 

11)将呈色剂BCIT/NBT以0.45μm滤膜进行过滤并加入100μl/well，至于室温下直到斑点呈现为止； 

12)完全显色后，将上清液加入相应的盘中，以蒸馏水充分洗涤膜的两边。吸水纸上轻拍，使膜干燥。保存时，将板倒置以免残留的液体流回膜上一旦膜干燥后，利用显微镜或判读系统即可读取斑点数，将盘(plate)置于室温下避光保存。 

利用ELISPOT assay分析六株益生菌与人类周边血球细胞共同培养后，进行刺激分泌IL-10的分析，依据班点数计算出分泌该细胞激素的细胞数量，结果如表7所示。其斑点数结果依序为BR101为324；B.longum为306；E.faecium为304；L.rhamnosus为298；L.acidophilus为294；L.paracasei为240。故筛选出刺激分泌量最高的益生菌为BR101洛德乳酸杆菌菌种(Lactobacillus reuteri)。 

5.利用BR101进行非正式人体试验 

受试者以能定期在门诊追踪治疗者为优先，且需符合以下条件：1)年龄19至75岁；2)最近一年内曾经抽血检验发现类风湿因子为阳性者；3)罹病期为6周～1年；4)固定服用药物者请定期追踪；5)类固醇药物剂量每天＞7.5毫克；6)或于近4周内接受关节内注射者。 

其他排除参与试验者标准包括：诊断为类风湿性关节炎病期大于1年以上者、肝肾功能受损者、慢性或经常感染(如慢性支气管炎，复发性鼻窦炎)或其他感染疾病等，其他行政因素，如搬家、经济因素或不肯配合试验等则排除试验。完成试验者共计14位，试验时间为1个月。 

取洛德乳酸杆菌菌种(Lactobacillus reuteri)BR101进行活化放大后，以冷冻干燥方法进行粉末加工，将菌粉添加赋型剂后充填胶囊，使每颗胶囊菌数大于5×10⁹CFU。本试验筛选期为4周，于门诊确认并取得患者同意后进行试验，并填写第一次症状评分表，之后每日食用6颗胶囊，于1个月后请受试者再填写第二次症状评分表，并依据受试者所填写的症状评分表进行分析。此症状评分表是修改DAS(Di sease Act ivity Score)及HAQ(Health Assessment Questionnaire)，内容包含五个主要关节(手肘关节、腕部关节、手指关节、膝关节及足关节的症状)于疼痛、僵硬、肿胀及发热等症状的发生频率及严重程度，另外包含日常生活的评估，如表7 所示。 

表7「类风湿性关节炎」症状调查表 

资料收集后，以统计软件SPSS17.0版进行资料分析，以nonpa rametrictest统计，以Wilcoxon Signed Rank Test统计，分析后P值＜0.05具有统计上显著差异意义，主要评估依据是类风湿性关节炎症状调查表上的分数，所有数据以平均数(Mean)±S.D.表示。 

统计结果如表8所示，受试者食用含有BR101菌粉的胶囊30天后，受试者自我评估食用前后类风湿性关节炎相关症状是否具有差异情形。经统计分析后，就症状发生的严重程度，在手指关节、日常生活总分等均具有统计上显著差异(Table6.，P＜0.05)；而在症状发生频率上，受试者在腕部关节、手指关节及日常生活上均有显著差异。显示受试者在食用含有 BR101菌粉的胶囊30天后，于症状严重程度及发生频率上有明显的改善(P值＜0.05)，表示食用BR101确实能使类风湿性关节炎患者除了降低症状严重程度之外，还具有改善生活品质的能力。所有的受试者均完成30天的实验，在实验期间内没有严重不良的反应产生。 

表8非正式人体试验结果分析〔N＝14〕 

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。