熊竹素在制备抑制血管异常新生药物中的应用

摘要

本发明公开了一种黄酮类化合物熊竹素在制备抑制血管异常新生药物中的应用，本发明将熊竹素作为一种血管新生抑制剂，因此可将熊竹素用于治疗由体内血管异常新生而引起的癌症、风湿性关节炎、糖尿病性失明、系统性红斑狼疮等疾病。经实验证明，本发明所述熊竹素对血管的异常生长具有显著的抑制作用。因此本发明所述熊竹素可用于制备抑制血管新生的药物。

说明书

技术领域

本发明属于植物药用成分和抑制血管新生化合物领域，特别是涉及熊竹素在制备抑制血管异常新生药物中的应用。

背景技术

血管新生是体内一个重要的生理和病理过程，正常情况下，其促进和抑制处于一个动态平衡状态，只发生在胚胎形成、伤口愈合以及妇女生理周期等几个过程。然而，一旦这种平衡被打破，就会伴随很多疾病的出现以及免疫系统的紊乱。尤其是当体内存在的血管新生促进因子超过了血管新生抑制因子，平衡就会偏向于新血管的生成，从而可能导致癌症、风湿性关节炎、糖尿病性失明、系统性红斑狼疮等严重疾病的发生。

目前已上市的和正在进行I-IV 期临床的血管新生抑制剂主要是抗体药物，抗体虽然具有定位准确的优点，但是必须采用静脉注射的方式给药，相比之下作为口服的低分子药物理所当然地应受到医疗一线的欢迎。因为低分子化合物的生产成本低，而且可以减轻患者和政府的医疗负担。另外，由于慢性疾病所呈现的多重特征，近年来，基于基因组学的方法，通过瞄准新靶标来大量寻找和发现人们所期望化合物的药物研发模式遇到了很多困难。因此，尝试从具有多重药效作用的天然植物或草药中去寻找具有血管新生抑制功能的活性低分子化合物成为未来新药研究的一个热点。

甘西鼠尾草（Salvia przewalskii Maxim）为唇形科鼠尾草属植物，在我国甘肃西部、四川西部、云南西北部及西藏等地分布较多，其主要成分及活性与丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）类似，是一种传统的中药材，虽然鼠尾草属植物化学成分和药理活性的研究历史悠久，但主要仍集中在对丹参及其几个主要代用品种的研究，尤其是对于该属植物在血管新生方面的调控作用，除丹参外，目前尚未见关于其他品种的相关报道。本发明中所述熊竹素为从甘西鼠尾草中分离得到的黄酮类化合物，其具有抗氧化、抗菌和抗炎的药理活性，目前尚未见报道该化合物可作为血管新生抑制剂具有抑制血管新生的活性。熊竹素化学结构式如下：

发明内容

本发明的目的是提供一种熊竹素的新医药用途，即熊竹素在制备抑制血管异常新生药物中的应用，其作为抑制血管异常新生药物的主要活性成分制成药物，作为血管新生抑制剂来治疗因血管异常新生所导致的相关疾病。

本发明所述应用中还可以加入一种或多种药物上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的填充剂、稀释剂、粘合剂、赋形剂、吸收促进剂、填充剂、表面活性剂和稳定剂等，必要时还可加入香味剂、色素和甜味剂等。

本发明所述应用除制成胶囊外，还可以制成丸剂、粉剂、片剂、粒剂、口服液和注射液等多种形式。

本发明所述的熊竹素从天然植物甘西鼠尾草中分离获得，实验采用溶剂超声提取、反复硅胶柱层析、过滤、重结晶等方法制备得到熊竹素单体，实验所用试剂为石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、丙酮、正相硅胶。实验成本低、操作简单、效率高。其结构通过¹H-NMR和¹³C-NMR数据来确定。

本发明利用人脐静脉内皮细胞（HUVEC），通过MTT实验，来检测熊竹素在体外对血管新生的影响，实验结果显示，熊竹素浓度在2.5、5.0、10 mg/L时能够有效的抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的增殖，从而起到抑制血管新生的作用。

本发明利用鸡胚尿囊膜作为体内实验模型，进行抑制血管新生的活性测试，通过鸡胚尿囊膜上血管的生长情况，来测试熊竹素对血管新生的影响，实验结果显示，熊竹素能够有效的抑制鸡胚尿囊膜血管的生长，其中在给药浓度为10.0、15.0 mg/L时，显示出较强的血管新生抑制活性。

以上实验结果表明：熊竹素对血管的异常新生具有较强的抑制作用，所以其可以作为制备血管新生抑制剂的有效成分，用于治疗由血管新生引发的癌症及相关疾病。

附图说明

图1是本发明从甘西鼠尾草中分离得到熊竹素的工艺流程示意图；

图2是本发明中不同给药浓度的熊竹素作用于人脐静脉内皮细胞（HUVEC）后MTT试验测试结果示意图；

图3是本发明中不同浓度熊竹素对HUVEC细胞株增殖影响的抑制率结果比较示意图；

图4是本发明中熊竹素作用于鸡胚尿囊膜，抑制血管新生的实验标本示意图；

图5是本发明中熊竹素作用于鸡胚尿囊膜，对鸡胚尿囊膜血管新生抑制作用的结果数据经Image Pro Plus（IPP, version5.1, Media Cybernetics）图像分析软件处理后血管面积比较柱状示意图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但在本发明的保护范围不限于下述的实施例，实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件进行实验。

实施例1 ：熊竹素的制备（下述实施例中使用的熊竹素是采用如下方法制备得到的）

实验采用干燥甘西鼠尾草（全草）7.3 kg，粉碎过60目筛，用100%丙酮（每次20 L）室温下超声提取5次，提取液减压浓缩得粗浸膏300 g；将所得到的粗浸膏上正相硅胶柱（80~100 目，青岛海洋化工）（干法上样），依次用纯石油醚、石油醚-乙酸乙酯混合液（石油醚:乙酸乙酯为9:1、3:1、1:1、3:7）洗脱，收集各部分洗脱液，减压浓缩，用TLC进行检测，将成分大致相同的馏分进行合并；对石油醚:乙酸乙酯 = 1:1洗脱液洗脱部分（52 g）进行分离，分离方法为正相硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯混合液（5:1、2:1、1:1、1:2）进行洗脱，在石油醚:乙酸乙酯为1:2的洗脱馏分中析出黄色颗粒状物质，吸除母液，然后对黄色颗粒状物质进行重结晶，即得到熊竹素26 mg（见图1），该化合物经核磁共振检测得到的¹H-NMR和¹³C-NMR数据与陈艳华在《广东紫珠地上部分的化学成分》一文中所述熊竹素（kumatakenin）的¹H-NMR和¹³C-NMR数据基本一致，¹H-NMR和¹³C-NMR数据如下：

¹H-NMR (400 MHz, C₅D₅N) δ: 12.70 (1H, s, 5-OH), 8.03 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2′, 6′), 7.00 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3′, 5′), 6.45 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.36 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 3.94 (3H, s, 7- OMe), 3.88 (3H, s, 3-OMe)；13C-NMR (100 MHz, C₅D₅N) δ: 182.9 (C-4), 164.6 (C-7), 162.8 (C-9), 159.1 (C-2), 153.5 (C-5), 153.3 (C-4′), 132.9 (C-3), 128.7 (C-2′, 6′), 121.9 (C-1′), 116.7 (C-3′, 5′), 106.1 (C-10), 103.5 (C-6), 91.3 (C-8), 60.3 (3-OMe), 56.1 (7-OMe)。

   根据以上波谱数据，确定该化合物即为熊竹素。

 实施例2：熊竹素对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖的影响实验（MTT）

将人脐静脉内皮细胞（HUVEC）在37℃，5% CO₂条件下培养24小时后，将其按照每孔3000个细胞的密度接种至96孔板中，在上述条件下再培养24小时后，将熊竹素制成0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mg/L的不同浓度药液，并加至96孔板中，在37℃，5% CO₂ 的条件下继续培养72小时，加入MTT（3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐）每孔20 μL继续孵育4 h，弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，震荡1 h，于酶标仪490 nm处测吸光度OD值（见图2）。

实验结果如图3所示，当熊竹素浓度为2.5 mg/L时，人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的增殖活性明显下降，抑制率明显上升(抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值)。

 实施例3：熊竹素对鸡胚尿囊膜血管新生抑制作用实验

取新鲜种鸡蛋在温度为37.8℃，CO₂浓度为5%，湿度适宜的条件下孵育7天，在气室端开窗（1×1 cm），用直径为6 mm的无菌滤纸片作为给药载体，放置于尿囊膜上，按照5.0、10.0、15.0 mg/L的不同浓度给药组给药，设置空白组（生理盐水组）和阳性对照药组（地塞米松组），用无菌透明胶带封窗，在上述条件下继续孵育，48 h后，向给药部位滴加固定液（甲醇:丙酮=1:1）对血管做固定处理15 min后，取下尿囊膜组织，对尿囊膜组织表面血管用数码相机微距拍照，用Image Pro Plus（IPP, version5.1, Media Cybernetics）图像分析软件对图片中血管面积进行计算，结果显示熊竹素10.0、15.0 mg/L可以显著抑制血管新生（见图4-5）。

从图4原始标本的照片中可以明显看出，当熊竹素的给药浓度为10.0、15.0 mg/L时，血管生长明显受到抑制；

图5为不同浓度的熊竹素作用于鸡胚尿囊膜后，鸡胚尿囊膜给药区域血管面积的柱状图，实验结果显示，当给药浓度为10.0、15.0 mg/L，血管面积较生理盐水组明显降低，显示出对血管新生的抑制作用。