抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11在黄曲霉毒素B1荧光淬灭中的应用及方法

摘要

本发明涉及一种抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11在黄曲霉毒素B1荧光淬灭中的应用及方法。抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11在黄曲霉毒素B1荧光淬灭中的应用方法：在含有黄曲霉毒素B1的样品溶液中加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11，使黄曲霉毒素B1荧光淬灭。抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11可使黄曲霉毒素B1荧光淬灭，且荧光淬灭率可达到90%；应用方法操作简单可控；基于抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11可对黄曲霉毒素B1的荧光进行淬灭的特性可丰富对黄曲霉毒素B1的生物分析、检测的研究手段。

说明书

技术领域

本发明属生物检测领域，具体涉及抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11在黄曲霉毒素B1荧光淬灭中的应用及方法。 

背景技术                                                                                                   

黄曲霉毒素是一类结构类似的化合物，自然界中的黄曲霉毒素主要是由黄曲霉菌和寄生曲霉产生的次级代谢产物。目前发现的黄曲霉毒素有二十余种，其中以黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1最为常见。黄曲霉毒素能对人及动物的肝脏组织产生破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡。黄曲霉毒素被世界卫生组织划定为Ⅰ类致癌物，以黄曲霉毒素B1毒性最强，其毒性是砒霜的68倍。

黄曲霉毒素可发生在热带或亚热带地区的农产品出产过程中，同时在储藏、运输等环节也可能引入黄曲霉毒素的污染。花生是最易发现有黄曲霉毒素的农产品，其他如玉米、无花果、果仁及谷物都有可能受黄曲霉毒素污染。由于我国小农户分散型的种植模式，农产品从农田到餐桌的各个环节都有可能受到黄曲霉毒素的污染。而黄曲霉毒素毒性大，危害严重， 

黄曲霉毒素作为一类天然污染物，不同于化学残留，紧靠法律法规手段很难实现有效控制。因此，检测技术在黄曲霉毒素污染监控中显得尤为重要。

化学残留标记免疫分析是生物检测领域常用的一种方法，其是通过加入荧光标记材料进行荧光标记，然后加入荧光淬灭试剂进行分析检测。常见的荧光淬灭试剂包括卤素离子、重金属离子、硝基化合物、重氮化合物等。而考虑到黄曲霉毒素B1自身具有较强的荧光特性，容易对标记材料的荧光产生干扰，因此，一直没有黄曲霉毒素B1的基于标记材料荧光淬灭特性的免疫分析技术研究报道。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11在黄曲霉毒素B1荧光淬灭中的应用及方法。其可使黄曲霉毒素B1荧光淬灭，方法简单、可靠。 

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案为： 

抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11在黄曲霉毒素B1荧光淬灭中的应用，其中：所述的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11由保藏号为CCTCC NO. C201013的杂交瘤细胞株1C11分泌产生。该杂交瘤细胞株已于2010年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO. C201013。

抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11在黄曲霉毒素B1荧光淬灭中的应用方法，其特征在于：它是在含有黄曲霉毒素B1的样品溶液中加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11，使黄曲霉毒素B1荧光淬灭。 

按上述方案，所述为使黄曲霉毒素B1的荧光进行充分淬灭，在黄曲霉毒素B1的样品溶液中加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11后先混匀，然后于37±5℃放置至少0.5h。 

按上述方案，还包括根据以下方法测定荧光淬灭率：将含有黄曲霉毒素B1的样品溶液中在未加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11前，先于365nm激发波长激发下获取其荧光发射光谱，记录440nm处（荧光发射光谱中荧光强度最大处对应的波长）的荧光强度值；然后再加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11进行淬灭后，再于365nm激发波长激发下获取其荧光发射光谱，记录440nm处（荧光发射光谱中荧光强度最大处对应的波长）的荧光强度值，根据以下公式计算荧光淬灭率： 

荧光淬灭率=荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11淬灭强度值即加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11淬灭前后的440nm处的两个荧光强度的差值/加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11淬灭前的荧光强度值。

按上述方案，上述方法中在含有黄曲霉毒素B1的样品中加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11时，使抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11的浓度达到使体系中黄曲霉毒素B1的荧光充分淬灭的最小浓度，以使样品中黄曲霉毒素B1的荧光进行充分淬灭。 

按上述方案，所述使体系中黄曲霉毒素B1的荧光充分淬灭的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11最小浓度的含义为：在体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11为某一浓度时，随着该浓度的增加，体系中黄曲霉毒素B1的荧光淬灭率也不随之增加，该浓度即为使体系中黄曲霉毒素B1的荧光充分淬灭的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11最小浓度。具体获得方法如下：将含有黄曲霉毒素B1的样品在未加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11前，先于365nm激发波长激发下获取其荧光发射光谱，记录440nm处（荧光发射光谱中荧光强度最大处对应的波长）的荧光强度值；然后在上述黄曲霉毒素B1标准品溶液中加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11，获得不同浓度抗黄曲霉毒毒通用单克隆抗体的体系，采用如上条件进行荧光淬灭，将淬灭后的荧光强度值与初始荧光强度值相比，获得不同浓度抗黄曲霉毒素B1抗体时的荧光淬灭率，通过比较其荧光淬灭率，在抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11为某一浓度时，随着该浓度的增加，体系中黄曲霉毒素B1的荧光淬灭率也不随之增加，则该浓度即为使体系中黄曲霉毒素B1的荧光充分淬灭的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11最小浓度。 

自然状态下的黄曲霉毒素B1在受紫外光（365nm）激发时能发出荧光，荧光发射光谱中荧光强度最大处对应的波长为440nm，而当该黄曲霉毒素B1与其特异性的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11反应后再受到紫外光（365nm）激发时，黄曲霉毒素B1的荧光则可绝大部分被淬灭。 

本发明的有益效果： 

抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11可使黄曲霉毒素B1荧光淬灭，且荧光淬灭率可达到90%；

操作简单可控；

基于抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11可对黄曲霉毒素B1的荧光进行淬灭的特性，可丰富对黄曲霉毒素B1的生物分析、检测的研究手段。如基于抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11对黄曲霉毒素B1荧光进行淬灭的特性可对农产品中黄曲霉毒素B1含量进行快速检测等。

附图说明

图1为系列浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液与其抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11反应前后荧光强度的比较，图中：每一浓度值对应的两列中：左列为各浓度黄曲霉毒素B1标准品溶液的荧光强度，右列为加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11反应淬灭后的荧光强度。 

图2为黄曲霉毒素B1浓度标准曲线c₁（x₁，y₁），浓度范围为0.1～1ng/mL； 

图3为黄曲霉毒素B1浓度标准曲线c₂（x₂，y₂），浓度范围为1～10ng/mL。

具体实施方式                 

下述所用抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11是采用保藏编号为CCTCC NO：C201013的杂交瘤细胞株1C11根据专利申请号为CN201010245095.5的专利中报道的方法预先制得，具体制备方法如下：

用保藏编号为CCTCC NO. C201013的杂交瘤细胞株1C11注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33 μL，室温混合30min，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L 和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2 mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4 ℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，对纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11，将抗体置-20℃冰箱中备用；

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸，加水定容至100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得。

实施例1 抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11在含有黄曲霉毒素B1标准品溶液中黄曲霉毒素B1荧光淬灭中的应用 

配制10ng/mL的黄曲霉毒素B1标准品溶液，扫描该样品溶液在365nm激发波长激发下的荧光发射光谱，记录440nm处的荧光强度值，再在该样品溶液中加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11，混匀，然后于37±5℃放置1h，使黄曲霉毒素B1荧光淬灭，然后在365nm激发波长激发下获得其荧光发射光谱，记录440nm处的荧光强度值，计算荧光淬灭率，荧光淬灭率=荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11淬灭强度值即加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11淬灭前后的440nm处的两个荧光强度的差值/加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11淬灭前的荧光强度值。

具体在加入不同量的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11使体系中抗黄曲霉毒素B1抗体的浓度分别为0.1，0.5 ，5，10, 20，30，40ng/mL，荧光淬灭率结果分别如下：抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11浓度为0.1ng/mL时，黄曲霉毒素B1的荧光淬灭率31%；抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11浓度为0.5 ng/mL时，淬灭率为37%；抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11浓度为5ng/mL时，淬灭率为49%；抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11浓度为10ng/mL时，淬灭率为78%；抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11浓度为20ng/mL时，淬灭率均为91%，且体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体含量继续增加时至抗体浓度为30或40ng/mL时，淬灭率仍为91%。 

实施例2  抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11在含有黄曲霉毒素B1的花生样品溶液中黄曲霉毒素B1荧光淬灭中的应用 

将浓度为500ng/mL的黄曲霉毒素B1甲醇储备液用稀释液磷酸盐缓冲液稀释，配置得到系列浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液（浓度分别为10、7.5、5、3.5、2、1.5、1、0.75、0.5、0.3、0.1和0 ng/mL），所述的磷酸盐缓冲液配方如下：0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至1000mL。取各系列浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液2mL在365nm激发波长下激发，获取各系列浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液的荧光发射光谱，记录波长440nm处的荧光强度值，见图1。然后在各浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液中加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11，使各体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11的终浓度均为20 μg/mL，混匀，放置1h，取各体系溶液2mL，在365nm激发波长下激发，获取各系体系的荧光发射光谱，取最大波长440nm处的荧光强度值，见图1。

实施例3 

基于抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11对黄曲霉毒素B1荧光进行淬灭的特性，可用于花生中黄曲霉毒素B1的添加检测应用实验，具体应用方法如下：

Ⅰ 荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11淬灭强度与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线c（x，y）的建立

（1）将浓度为500ng/mL的黄曲霉毒素B1甲醇储备液用稀释液磷酸盐缓冲液稀释，配置得到系列浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液（浓度分别为10、7.5、5、3.5、2、1.5、1、0.75、0.5、0.3、0.1和0 ng/mL），所述的磷酸盐缓冲液配方如下：0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至1000mL。取各系列浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液2mL在365nm激发波长下激发，获取各系列浓度的黄曲霉毒素B1标准品溶液的荧光发射光谱，记录波长440nm处的荧光强度值，见图1。

（2）向上述10ng/mL的黄曲霉毒素B1标准品溶液中分别加入不同量的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11，获得不同浓度抗黄曲霉毒通用单克隆抗体1C11的体系（体系中抗黄曲霉毒素B1抗体的浓度分别为0.1，0.5 ，5，10, 20，30，40ng/mL），采用如上条件进行荧光淬灭，将荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11淬灭强度值与加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11淬灭前的荧光强度值相比，获得不同浓度的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11的荧光淬灭率。具体结果：抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11浓度为0.1ng/mL时，黄曲霉毒素B1的荧光淬灭率31%；抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11浓度为0.5 ng/mL时，淬灭率为37%；抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11浓度为5ng/mL时，淬灭率为49%；抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11浓度为10ng/mL时，淬灭率为78%；抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11浓度为20ng/mL时，淬灭率均为91%，且体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体含量继续增加时至抗体浓度为30或40ng/mL时，淬灭率仍为91%，说明体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11浓度为20ng/mL时，即可使黄曲霉毒素B1的荧光充分淬灭。故结合成本，选用下述体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11的浓度为20ng/mL。 

（3）向步骤（1）的各黄曲霉毒素B1标准品溶液中分别加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11，使各体系中抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11的终浓度均为20 μg/mL，所述抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11由保藏号为CCTCC NO：C201013的杂交瘤细胞株1C11产生，混匀，放置1h，取各体系溶液2mL，在365nm激发波长下激发，获取各系体系的荧光发射光谱，取最大波长440nm处的荧光强度值，见图1。 

（4）对黄曲霉毒素B1标准品浓度为0.1-1ng/mL的范围和1-10ng/mL的范围分别进行拟合即分段拟合得到小浓度时荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11淬灭强度与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线c₁（x₁，y₁），曲线方程为：y₁=10⁶x₁+8859，其中：x₁黄曲霉毒素B1浓度，0.1-1ng/mL，y₁为荧光被抗黄曲霉毒素B1抗体1C11淬灭强度即加入抗黄曲霉毒素B1抗体1C11前后的440nm处荧光强度的差值，见图2，和得到大浓度时荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11淬灭强度与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线c₂（x₂，y₂），曲线方程为：y₂=71535x₂+10⁶，其中：x₂黄曲霉毒素B1浓度，1-10ng/mL，y₂为荧光被抗黄曲霉毒素B1抗体1C11淬灭强度即加入抗黄曲霉毒素B1抗体1C11前后的440nm处荧光强度的差值，见图3。 

Ⅱ 花生中黄曲霉毒素B1的添加检测： 

称取已磨好的花生空白样品5克，加入100μL黄曲霉毒素B1的甲醇储备液，黄曲霉毒素B1的添加浓度为10 ng/g花生空白样品，放置半小时，待甲醇挥发完后加入15mL体积浓度为80%的甲醇水（含质量分数为4%的氯化钠），在50～60℃水浴下超声10分钟，定量滤纸过滤，取滤液4mL 加入2mL石油醚，涡旋1分钟，静置分层，取下层甲醇水3mL，加入9 mL水，混匀，将该稀释的样品提取液用孔径为0.45μm的混合滤膜过滤，取10mL滤液流过黄曲霉毒素B1免疫亲和柱，用1mL甲醇洗脱亲和柱，收集甲醇洗脱液，在60℃下用氮气吹干，再用2mL上述稀释液将黄曲霉毒素悬起，即为样品溶液，扫描样品溶液在365nm激发波长激发下的荧光发射光谱，再向样品溶液中加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11至抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11终浓度为20μg/mL，混匀，放置1小时后，在365nm激发波长激发下获得其荧光发射光谱，记录440nm处的荧光强度值。

检测结果：根据加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11后体系荧光被抗体淬灭强度值，将待测样品溶液荧光被抗体淬灭强度值即加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11前后的440nm处荧光强度的差值代入大浓度时荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11淬灭强度与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线c₂（x₂，y₂）（如图2-2）中，得到样品溶液中的黄曲霉毒素B1浓度，再结合样品处理过程中的稀释情况，根据样品处理过程中浓度的变化关系计算出实际花生样品中的黄曲霉毒素B1的添加浓度为9.4 ng/g。 

实施例4 

基于抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11对黄曲霉毒素B1荧光进行淬灭的特性，可用于花生样品中黄曲霉毒素B1含量的检测应用实验，具体应用方法如下：

Ⅰ 荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11淬灭强度与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线c（x，y）的建立如上述实施例3所述。

Ⅱ 花生中黄曲霉毒素B1含量的检测： 

称取已磨好的待测花生样品1#，2#或3# 5克，加入15mL体积浓度为80%的甲醇水（含质量分数为4%的氯化钠），在50～60℃水浴下超声10分钟，定量滤纸过滤，取滤液4m L 加入2mL石油醚，涡旋1分钟，静置分层，取下层甲醇水3mL，加入9mL水，混匀，将该稀释的样品提取液用孔径为0.45μm的混合滤膜过滤，取10mL滤液流过黄曲霉毒素B1的免疫亲合柱，用1mL甲醇洗脱亲和柱，收集甲醇洗脱液，在60℃下用氮气吹干，再用2mL上述稀释液将黄曲霉毒素悬起，即为样品溶液，扫描样品溶液在365nm激发波长激发下的荧光发射光谱，记录440nm处的荧光强度值，再向样品溶液中加入抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11，至抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体1C11终浓度为20μg/mL，混匀，放置1小时后，在365nm激发波长激发下获得其荧光发射光谱，记录440nm处的荧光强度值。

检测结果：根据加入黄曲霉毒素B1抗体后体系荧光被抗体淬灭的值，确定将各样品溶液的荧光被抗体淬灭的值即加入抗体前后的440nm荧光强度的差值代入小浓度时荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体淬灭强度与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线c₁（x₁，y₁）或大浓度时荧光被抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体淬灭强度与黄曲霉毒素B1浓度的关系曲线c₂（x₂，y₂），得到样品溶液中的黄曲霉毒素B1浓度，再结合样品处理过程中的稀释情况，根据样品处理过程中浓度的变化关系计算出花生样品中的黄曲霉毒素B1的浓度，得到花生样品1的待测溶液中黄曲霉毒素B1浓度为检出限0.1ng/mL以下，即样品1#中黄曲霉毒素B1含量为未检出；花生样品2的待测溶液中黄曲霉毒素B1浓度为0.6ng/mL，即样品2#中黄曲霉毒素B1含量为2.16μg/kg；花生样品3的待测溶液中黄曲霉毒素B1浓度为3.2ng/m L，即样品3#中黄曲霉毒素B1含量为11.52μg/kg。同时采用国家标准方法GB/T 18979-2003检测上述花生样品1#,2#或3#，其检测结果依次为：花生样品1#中黄曲霉毒素B1未检出，花生样品2#中黄曲霉毒素B1含量为2.3μg/kg，花生样品3#中黄曲霉毒素B1含量为12.2μg/kg。结合上述检测可看出：上述两种检测方法的检测结果相对相差均在10%以内。