膜联蛋白A3在检测酒精性肝纤维化中的用途

摘要

本发明属于生物技术领域，涉及膜联蛋白A3在检测酒精性肝纤维化中的用途。本发明通过筛选在酒精性肝纤维化和正常肝脏的肝非实质细胞中存在差异表达的蛋白，获得在酒精性肝纤维化的肝非实质细胞中低表达的蛋白质——膜联蛋白A3(ANXA3)，经免疫印迹实验进一步证实了所述ANXA3在酒精性肝纤维化的肝非实质细胞中有较低的表达水平。实验结果证实，所述的膜联蛋白A3可作为分子标志用作检测酒精性肝纤维化；所述的膜联蛋白A3的特异性的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，可用于制备检测酒精性肝纤维化制剂；所述的抗膜联蛋白A3的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，可用于制备检测酒精性肝纤维化试剂盒。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及膜联蛋白A3在检测酒精性肝纤维化中的用途，具体涉及 膜联蛋白A3作为检测酒精性肝纤维化分子标志的用途。

背景技术

现代医学研究发现，酒精性肝纤维化表现为肝脏内的慢性炎症及进行性肝组织纤维化， 随着病程的进展会导致酒精性肝纤维化，是长期酗酒患者死亡的主要原因。有统计显示，酗 酒(酒精滥用和酒精依赖)已经成为当今世界一个重要的公共卫生问题；在美国，67％的成 年人有饮酒习惯，7.4％的成年人酗酒，每年大约有10万人死于酗酒；而在我国，随着人们生 活水平的提高和社交的日益频繁，酒精性肝纤维化的发病率逐年增加，严重威胁国人的健康； 同时，酒精性肝纤维化患者的预后不容乐观，4～5年存活率仍然很低。

酒精诱导的肝损伤是引起肝纤维化的一个重要原因，虽然肝纤维化的临床表现目前已归 类较为清晰明确，但其早期诊断率，特别是酒精性肝纤维化发生早期阶段的诊断仍有待提高。

目前，关于酒精因素是如何诱发肝纤维化的过程，最终导致肝纤维化发生，其中的分子 机制研究尚很缺乏。现已有研究表明，酒精能导致肝细胞膜、线粒体和细胞核的变化。酒精 能引起肝细胞膜通透性的改变，使细胞膜的透性增加，同时导致细胞膜结构上的缺陷 (Molleken，Sitek et al.2009)，且酒精还能导致细胞表面的磷脂总量增加，引起细胞表面电荷 密度升高和脂质过氧化物酶体的增多(Szachowicz-Petelska，Dobrzynska et al.2008)。当前还有 研究发现，酒精还能通过激活caspase-9和caspase-3途径来启动细胞的凋亡(Dan，Popov et al. 2005)。因此，酒精影响肝细胞的机制是非常复杂的，需要利用高通量的办法寻找在酒精性肝 纤维化发生、发展过程中的标志分子，从而为深入阐述酒精性肝纤维化的发病机制，最终筛 选和开发以治疗和诊断为目的的酒精性肝纤维化相关差异表达的基因或/和蛋白质，本领域迫 切需要新的在酒精性肝纤维化中差异表达的基因或/和蛋白质。

膜联蛋白A3 SwissProt的登录号为ANXA3_RAT，细胞质膜上有分布，其为膜联蛋白家 族成员之一(参见http://myhits.vital-it.ch/cgi-bin/view_seq_entry？name＝sw:ANXA3 _RAT&view_sw＝UniProt)；该蛋白家族在细胞生长和信号转导方面发挥调节作用。所述的膜 联蛋白A3的功能在于抑制磷脂酶A3裂解成肌醇1，2-循环磷酸盐和1-磷酸肌醇，同时在 抗凝血方面也发挥作用。

迄今为止，尚未见有关膜联蛋白A3与酒精性肝纤维化直接或间接相关的报道。

发明内容

本发明的目的是提供膜联蛋白A3的新的用途，具体涉及膜联蛋白A3用作检测酒精性肝纤 维化的分子标志的用途。

本发明的另一个目的在于提供膜联蛋白A3特异性的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，该特异性 的抗体在制备检测酒精性肝纤维化制剂中的用途。

本发明的再一个目的在与提供一种抗膜联蛋白A3的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，在制备检 测酒精性肝纤维化试剂盒中的用途。

本发明通过筛选在酒精性肝纤维化和正常肝脏的肝非实质细胞中差异表达的蛋白质，获 得一种在酒精性肝纤维化和正常肝脏非实质细胞中存在差异表达的蛋白质(酒精性肝纤维化 细胞中低表达)，经质谱鉴定为膜联蛋白A3；进一步的免疫印迹实验证实，该蛋白质在酒精 性肝纤维化和正常肝脏的肝非实质细胞中存在蛋白质表达水平的差异(酒精性肝纤维化细胞 中表达下调)；基于膜联蛋白A3与酒精性肝纤维化的相关性，以该蛋白的转录本作为一个分 子标志对其转录水平进行定量检测可用作检测酒精性肝纤维化。

本发明的目的通过下述技术方案实行：

本发明以改良的蔗糖密度梯度离心的方法收集离体实验动物正常肝脏和酒精性肝纤维化 的肝非实质细胞，裂解获得细胞蛋白质后，以蛋白质二维凝胶电泳的方法分离蛋白质，通过 ImageMaster软件分析表达差异的蛋白质，并对所获得的差异蛋白质进行质谱鉴定，结果显示， 膜联蛋白A3在酒精性肝纤维化的肝非实质细胞中低表达；免疫印迹反应实验进一步证实， 膜联蛋白A3在肝纤维化的肝非实质细胞中的低表达；实验结果表明，膜联蛋白A3可作为酒 精性肝纤维化的分子标志，对其表达量进行检测可以用来检测酒精性肝纤维化；进一步，可 制备检测酒精性肝纤维化制剂。

本发明中，采用蔗糖密度梯度离心的方法首先分离肝非实质细胞，再以酶解的方式获得 肝非实质细胞的质膜蛋白质；

本发明中，通过二维凝胶电泳方法分离裂解得到的蛋白质，通过ImageMaster 2D Platinum  6.0软件分析，筛选得到差异表达的蛋白质，用戴安纳升级液相色谱Ultimate 3000串联高容 量离子阱质谱(LC-MS/MS)进行分离鉴定；

实验鉴定获得14种非冗余蛋白质在正常肝脏和酒精性肝纤维化肝脏的非实质细胞中差 异表达，其中包括在肝纤维化的肝非实质细胞中表达降低的膜联蛋白A3表达量；质谱分析 获得的膜联蛋白A3的鉴定情况结果如表1所示。

表1：膜联蛋白A3的详细鉴定结果

 蛋白质ID   蛋白质描述   搜库得分   等电点   分子量(kDa)   序列覆盖率  ANXA3_RAT   膜联蛋白A3   86   5.96   36.6   20％ ；

本发明还验证了膜联蛋白A3差异表达：提取肝纤维化非实质细胞的蛋白质，首先进行 SDS-PAGE，将凝胶中的蛋白质转移到PVDF膜上，进行免疫印迹反应，结果与内参β-Actin 进行对比，确定膜联蛋白A3在纤维化组织和正常肝脏组织中的表达，结果表明，膜联蛋白 A3在酒精性肝纤维化组织中低水平的表达，结果与蛋白质二维凝胶电泳的结果一致；

实验结果表明，所述膜联蛋白A3在正常肝脏和酒精性肝纤维化的肝非实质细胞中存在 差异表达，与酒精性肝纤维化的发生、发展有着密切的相关性；以膜联蛋白A3作为一个分 子标志对其表达水平进行检测可用于检测酒精性肝纤维化，其中，膜联蛋白A3作为分子标 志其在肝非实质细胞中的表达量可用作检测酒精性肝纤维化，其中，尤其检测膜联蛋白A3 在肝非实质细胞中转录是否存在下调；进一步，相应的特异性检测膜联蛋白A3的抗体，包 括单克隆抗体和多克隆抗体，由于其能检测膜联蛋白A3的表达水平，因而可用于检测酒精 性肝纤维化或者用于制备检测酒精性肝纤维化的制剂或试剂盒等。

本发明的进一步目的是提供体外检测膜联蛋白A3表达的方法，尤其涉及一种体外检测 酒精性肝纤维化肝非实质细胞中膜联蛋白A3表达是否异常的方法，其包括步骤：

(1)用特异性抗体检测待检肝非实质细胞中膜联蛋白A3蛋白的数量；

(2)将步骤(1)得到的检测数量与正常肝脏肝非实质细胞中膜联蛋白A3的数量进行 比较，测得的结果低于正常值，则表示被检样本中膜联蛋白A3的表达异常。

本发明实验结果证实了膜联蛋白A3与酒精性肝纤维化的相关性，为酒精性肝纤维化的 诊断和/或治疗提供了全新的参考途径；所述的膜联蛋白A3可用作检测酒精性肝纤维化的分 子标志的应用；所述的膜联蛋白A3的特异性的抗体，可用于制备检测酒精性肝纤维化制剂， 和制备检测酒精性肝纤维化试剂盒。

附图说明

图1显示了正常肝脏和酒精性肝纤维化肝非实质细胞中膜联蛋白A3的表达量，其中， N代表正常肝脏，A代表酒精性肝纤维化肝脏，6、9代表肝纤维化造模后的6、9周所取肝 脏样品，1、2、3代表3次重复，圆圈及箭头所指处代表膜联蛋白A3所在的位置。

图2显示了正常肝脏和酒精性肝纤维化中膜联蛋白A3的免疫印迹结果，其中， N代表正常肝脏，A代表酒精性肝纤维化肝脏，6、9代表肝纤维化造模后的6、9周所取肝 脏样品，β-Actin为内参对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件参考《分子克隆实验指南》 (第三版，冷泉港出版社)中所述的条件或者制造厂商的建议条件。

实施例1制备酒精性肝纤维化肝非实质细胞蛋白质样品

本实施例中所使用的尿素、硫脲、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二硫苏糖醇(DTT)、3-[(3- 胆酰胺丙基)-二乙铵]-1-丙磺酸(CHAPS)均购自Sigma公司，DNA酶购自Takara。

本实施例以蔗糖密度梯度离心的方法首先分离肝非实质细胞，再以酶解的方式获得肝非 实质细胞的质膜蛋白质，具体步骤如下：

取离体的酒精性肝纤维化动物实验模型肝脏组织在冰冷的生理盐水中剪碎，用组织匀浆 器匀浆悬浮在冷的缓冲液A(50mM HEPES，1mM CaCl2 and 1mM PMSF，pH7.4)中的组织碎 片，将匀浆好的悬液置于50ml离心管中，4℃条件下，15000g离心15min，取沉淀与60％蔗糖 混合，至到混合物中的蔗糖浓度为44％。将42.3％的蔗糖溶液小心滴加到44％蔗糖混合物上层， 4℃条件下，100000g离心2.5h，取离心管最上层的组织碎片即为分离得到的质膜蛋白质粗提 样本，将该沉淀物在缓冲液B(50mM HEPES，1mM PMSF，pH 7.4)中洗涤两遍。将粗提样 本与60％的蔗糖混和，直到混合物中的蔗糖浓度为44％，将42.3％、41.0％、39.0％、37.0％依 次滴加到44％蔗糖混合物上层。100000g离心6h，取最上层37.0％蔗糖中的组织碎片在缓冲液B 中洗涤两遍，即为所提取的质膜。

将获得的肝非实质质膜加入裂解缓冲液(8mol/L尿素、4％CHAPS、65mmol/L DTT、2 mol/L硫尿、1％NP-40、0.5mmol/L PMSF、1％DNA酶)，在冰上作用30min，再在室温下孵 育30min。裂解得到的蛋白质用Bradford法测定蛋白质含量后-80℃保存备用。

实施例2筛选差异表达蛋白质

本实施例中所使用的丙烯酰胺、N，N′-亚甲基双(丙烯酰胺)、甘氨酸、十二烷基硫酸 钠(SDS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、尿素、甘油购自美国Amresco公司，过硫酸胺(AP)、 TEMED购自Bio-Rad。

将裂解得到的蛋白质通过二维凝胶电泳的方法分离，通过ImageMaster 2D Platinum 6.0 软件分析，找出差异表达的蛋白质，并对所获得的差异蛋白质用戴安纳升级液相色谱Ultimate  3000串联高容量离子阱质谱(LC-MS/MS)进行分离鉴定，具体步骤如下：

双向凝胶电泳的第一向等电聚焦电泳采用pH 3～10非线性胶条，电泳程序设置：水化 30V，12h；电泳：500V，1h；1000V，1h；8000V，30min，梯度；8000V，5h，线性； 总功率达44千瓦。第二向十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，分离胶 浓度为11.5％。电泳完后，剥胶，用考马斯亮蓝染胶，Image scanner扫描仪成像。所得图像 用ImageMaster 2D Platinum 6.0软件将电泳图谱分成2个类别进行找点、匹配等分析，找出差 异蛋白质点。

取差异蛋白质点脱色脱水冻干后，每管中加入约5μL胰酶(0.02μg/μL)。37℃酶解过夜 (16～18h)。酶解后的样品先经过C18预柱(300μm id x5mm，5μm)脱盐，流速为20μL/min， 流动相为2％ ACN，0.1％FA。然后以300nL/min的流速经C-18反向柱(75μm id x 15cm  length，3μm，PepMapTM)进行分离，色谱的梯度为4-48％，梯度时间为40min。通过C18 色谱柱分离的肽段由纳流喷针进入HCT质谱进行实时的离子化分析检测。HCT质谱每秒钟 进行一次一级扫描和5次二级扫描分析。

用DataAnalysis 3.2软件整合肽指纹图谱和串联质谱二级图谱，通过Mascot软件查询 SwissProt数据库。MS误差：±0.6Da，MS/MS误差：1.2Da.固定修饰是半胱氨酸被修饰为脲甲 基半胱氨酸(Carbamidomethyl-Cys)，可变修饰为甲硫氨酸氧化(Oxidation(M))，每个肽段允 许有1个不完全裂解位点，离子选择(+1，+2，+3)，模式为：单同位素，置信区间为95％， P＜0.05，蛋白质得分36分以上结果可靠。

用上述方法鉴定到14种非冗余蛋白质在正常肝脏和酒精性肝纤维化肝脏的非实质细胞 中差异表达，其中包括在肝纤维化的肝非实质细胞中表达降低的膜联蛋白A3表达量。如图1 所示，考马斯亮蓝染色的双向凝胶电泳显示膜联蛋白A3在纤维化过程中表达下调(图注：6、 9代表酒精性肝纤维化的不同时间点，N代表组织来源于正常肝脏，A代表组织来源于肝纤 维化肝脏，圆圈代表膜联蛋白A3所在的位置)。

质谱分析获得的膜联蛋白A3的详细鉴定情况如表2所示。

表2：膜联蛋白A3的详细鉴定结果

 蛋白质ID   蛋白质描述   搜库得分   等电点   分子量(kDa)   序列覆盖率  ANXA3_RAT   膜联蛋白A3   86   5.96   36.6   20％ 。    

实施例3验证膜联蛋白A3差异表达

本实施例中所使用的抗膜联蛋白A3的抗体购自ProteinTech Group Inc.；β-Actin的抗体 和辣根过氧化物酶标记的二抗均购自Santa；PVDF膜购自Millipore。

提取肝纤维化非实质细胞的蛋白质，首先进行SDS-PAGE，将凝胶中的蛋白质转移到 PVDF膜上，进行免疫印迹反应，结果与内参β-Actin进行对比，以确定膜联蛋白A3在纤维 化组织和正常肝脏组织中的表达，包括以下步骤：

将50mg蛋白质进行电泳，电泳采用11.5％分离胶，电泳结束后转膜，将PVDF膜过夜封 闭，封闭后的膜在TBST中洗膜3次，37℃孵育抗膜联蛋白A3的抗体2h，再将PVDF膜在TBST 中洗涤3遍，在辣根过氧化物酶标记的二抗中孵育2h，同上述步骤洗膜后在暗室进行曝光显 色。

膜联蛋白A3的表达量通过除以内参β-Actin的量得到的比值即为所测膜联蛋白A3的蛋 白质含量，结果如图2所示，与正常肝脏中的膜联蛋白A3的相对含量相比，酒精性肝纤维 化中的含量明显较低，结果表明，膜联蛋白A3在酒精性肝纤维化组织中有较低水平的表达， 上述结果与蛋白质二维凝胶电泳的结果一致。

实验结果证实，膜联蛋白A3在正常肝脏和酒精性肝纤维化的肝非实质细胞中存在差异 表达，显然与酒精性肝纤维化的发生、发展有着密切的相关性，因此，以膜联蛋白A3作为 一个分子标志对其表达水平进行检测可以用于检测酒精性肝纤维化；相应的特异性检测膜联 蛋白A3的抗体，由于其能检测膜联蛋白A3的表达水平，因而可用于检测酒精性肝纤维化或 者用于制备检测酒精性肝纤维化的制剂或试剂盒等，这对于本领域的技术人员来说是显而易 见的。