近红外漫反射光谱测定注射用丹参多酚酸水分含量的方法

摘要

本发明涉及一种近红外漫反射光谱测定注射用丹参多酚酸中水分含量的方法，包括：步骤1，建立近红外定量校正模型；步骤2，测定样品中水分含量。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种近红外漫反射光谱测定注射用丹参多酚酸中水分的含量的 方法。

背景技术：

近红外(near infrared spectroscopy，NIR)光谱介于可见光谱区与中红外光 谱区之间，波长范围为780～2500nm(12820～4000cm^-1)的分子光谱，其主要 谱峰反映分子中C-H、N-H、O-H等含氢基团的倍频和合频吸收。由于此区 间谱带宽，谱图重叠严重，而且吸收信号弱，所含信息复杂，所以近红外的分析 应用价值一直没有得到重视。近年来，随着近红外(NIR)光谱分析技术的迅速 发展，而且具有快速、无损、准确等特点，在药物分析领域得到越来越广泛的应用。

注射用丹参多酚酸是基于传统中药材丹参而发展起来的一种新型冻干粉针 剂，主要组方为丹参多酚酸，其配方和制备方法：注射用丹参多酚酸是丹参多酚 酸，加入甘露醇等辅料和注射用水，经活性炭除热原、微孔滤膜过滤，再冷冻干 燥而得。具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦之功效。临床上主要用于中风病恢 复期淤血阻络证，症见半身不遂、口舌歪斜、偏身麻木。按注射用丹参多酚酸现 行质量标准测定水分含量，采用2010版《中国药典》一部附录IX H水分测定第 一法(烘干法)测定，检测时间约7小时，同时检测结果差异大，精确度灵敏度 不高，操作复杂。

本发明经过研究，意外的发现采用NIR漫反射光谱法测定注射用丹参多酚 酸中的水分含量仅需要2min，测定速度快、过程操作简单、无化学污染、无需 破坏样品。该方法准确可行，可用于中药制剂水分含量的测定，对于生产中大批 量样品水分含量的检测具有潜在的应用的前景。

发明内容：

本发明利用近红外漫反射光谱分析技术对注射用丹参多酚酸中的水分进行 无损、快速的定量分析。

本发明提供一种近红外漫反射光谱测定注射用丹参多酚酸中水分的含量的 方法，该方法包括以下步骤：

步骤1，建立近红外定量校正模型：

a取注射用丹参多酚酸样品30-50份作为校正集，用布擦拭干净西林瓶底部；

b开机预热光谱仪1小时后，以空气作为空白对照进行背景扫描，然后从西林瓶 底部用近红外漫反射光谱仪扫描，得到校正集样品光谱图；

c将步骤a中注射用丹参多酚酸校正集样品30-50份，根据2010版《中国药典》 一部附录IX H水分测定第一法(烘干法)得到每个样品中的水分含量；

d以光谱图为依据，对近红外透射光谱数据进行处理，建立水分的最优近红外定 量校正模型。

其中，步骤d中所述数据处理方法为：将由步骤b中校正集样品的原始光谱 经二阶导数预处理，在11993.1～6098.8cm^-1和5450.7～4598.2cm^-1谱段内，选择 维数为4，运用偏最小二乘法(PLS)将校正集样品的NIR光谱与烘干法测定的 水分含量进行回归关联，建立水分的最优近红外定量校正模型并分析，结果R²为0.9911，内部交叉验证均方差(RMSECV)为0.210。

步骤2，测定样品中水分含量：

a取注射用丹参多酚酸待试样品，用布擦拭干净西林瓶底部；

b开机预热光谱仪1小时后，以空气作为空白对照进行背景扫描，然后从西林瓶 底部用近红外漫反射光谱仪扫描，得到待试样品光谱图；

c根据步骤1中建立的近红外定量校正模型测得待测样品的水分含量。

其中，扫描参数为：测量温度：21～25℃，湿度：51～58％，开机预热光谱仪 1小时，漫反射检测，扫描波长范围为4000～12000cm^-1，分辨率8cm^-1，每份样 品扫描3次，取其平均光谱，得到光谱图。

本发明的测定方法，是经过多次筛选实验获得的，筛选过程如下：

1.1实验仪器和材料

Matrix-F(SFDA版)型傅里叶变换近红外光谱仪，配置漫反射积分球附件、光 纤探头和定量分析软件为OPUS6.5(德国布鲁克公司)；Mettler XS105电子天平 (上海梅特勒托利多仪器有限公司)；DGG-101-1BS型电热鼓风干燥箱(天津市 天宇实验仪器有限公司)；

注射用丹参多酚酸样品(53份样品，天津天士力之骄药业有限公司提供)。

1.2实验方法

1.2.1水分含量的测定

根据2010版《中国药典》一部附录IX H水分测定第一法(烘干法)，测定 的数值作为注射用丹参多酚酸的真实值。为了增加水分测定的线性范围和分布的 均匀性，人为增加注射用丹参多酚酸样品中水分的含量。

1.2.2NIR光谱的采集

53份样品，用布擦拭干净西林瓶底部，开机预热光谱仪1小时后，以空气 作为空白对照进行背景扫描，然后进行样品扫描，分别从西林瓶底部扫描其近红 外光谱。具体扫描参数为：测量温度：21～25℃，湿度：51～58％，漫反射检测， 扫描波长范围为4000～12000cm^-1，扫描次数64次，分辨率8cm^-1，每份样品扫 描3次，取其平均光谱，如图1所示。

2结果与讨论

2.1水分定量分析模型的建立方法

根据其水分的含量测定结果，从收集到的53份样品中，选取43份有代表性 的样品做校正集，用于建立校正模型；剩余10份样品为验证集，对模型进行外 部检验。校正集和验证集样品中水分的含量分布范围见表1。以决定系数(R²) 和校正均方差(RMSECV)作为模型评价指标，选择合适的建模参数以获得最 优的校正模型；R²越大、RMSECV越小、表明校正模型建立越合理；以预测均 方差(RMSEP)作为对模型预测性能的评价指标，RMSEP越小，表明模型的预 测性能越好。

表1校正集和验证集水分的含量分布范围表(％/份)

2.2光谱谱段的选择

水分在NIR光谱区有两个很强的特征谱带，水分子中-OH伸缩振动的一级 倍频(2v)约在1440nm(6944cm^-1)，合频在1940nm(5155cm^-1)附近。尽管PLS 法允许处理全谱信息，但是建模波段过宽，必然含有大量的冗余信息，由于各成 分分子结构存在差异，使得各自对应的最优建模波段不相同，所以必须在一定的 区间内建立数学模型来确定近红外光谱和含量的关系，因此波段的选择，有利于 提高模型的预测准确性。所以在建立水分定量模型所用谱区进行选择和优化时， 最好包括水分的这两个特征吸收谱带。结合R²和RMSECV为参考指标，经过对 多个谱段的比较，最终选择最佳谱段为11993.1～6098.8cm^-1和 5450.7～4598.2cm^-1。其中12000～11993.1cm^-1吸收谱段曲线光滑，没有明显吸收 峰，并且噪音也较大；4598.2～4000cm^-1吸收谱段噪音较大，影响模型的预测能 力；而7502.2～6800.8cm^-1和5450.7～4247.1cm^-1不仅包含水分的这两个特征吸 收谱带，所含有的有效信息也最丰富。

2.3光谱预处理方法的优化

在NIR光谱的采集过程中，由于仪器状态、样品状态和测量条件的差异， 会使光谱中往往包含一些与待测样品无关因素的干扰，导致近红外光谱的基线漂 移和光谱信号的重叠严重。西林瓶瓶底形态的不完全一致和样品的背景颜色，也 常会导致近红外光谱产生明显的漂移和平移现象。中药冻干粉针剂存在大小不同 的颗粒，存在明显的散射现象。所以选择合适的光谱预处理技术能剔除干扰信号， 提取有用的特征信息，从而消除仪器不稳、环境变化和样品不均等因素带来的影 响，提高模型预测的精度和稳定性。

本实验采用OPUS6.5数据分析软件，选择在11993.1～6098.8cm^-1和 5450.7～4598.2cm^-1谱段内，进行数据分析，参考仪器自动优化功能，通过不断调 整进行优化选择预处理方法。实验过程中主要以模型的决定因子(R²)和内部验 证均方差(RMSECV)为指标进行检测，R²越接近于1，RMSECV越小说明模 型越好。最终发现二阶导数预处理方法在其所有预处理方法中最好，RMSECV 最小，校正模型的决定因子R²为0.9911接近于1。中药冻干粉针剂近红外漫反 射色谱法光谱的采集，选择预处理方法时通常重点考虑的西林瓶瓶底性状不完全 一致、样品的背景颜色引起的光谱漂移和平移现象，不同大小的颗粒引起存的明 显的散射现象，这几个方面也是模型失效的主要原因。而二阶导数可以部分消除 应用中仪器性能的变化对测量光谱的影响，强化谱带特征、克服谱带重叠和颗粒 分布不均匀及颗粒大小产生的散射现象^[9]。

2.4模型维数的确定

在建模过程中，PLS模型采用不同的维数，模型的预测能力有较大的差异。 在校正集样本一定的情况下，维数太多，包含过多的测量噪音，出现过拟合现象； 维数过少，会导致用来建模的信息不全，光谱中一些有用信息未被包含从而导致 模型预测能力差。为了提高光谱有效信息的利用率，同时避免“过拟合”现象， 本实验采用内部交叉验证法考察不同维数对RMSECV值的影响，结果见图2。 其最小的RMSECV值，对应的即为最佳维数，如图所示，最佳维数为4。

2.5模型的建立与评价

样品近红外漫反射光谱经过二阶导数预处理后，在11993.1～6098.8cm^-1和 5450.7～4598.2cm^-1谱段内，选择维数为4，运用偏最小二乘法(PLS)将43份校 正集样品的NIR光谱与水分含量值进行回归关联，建立水分的最优近红外定量 校正模型，结果R²为0.9911，内部交叉验证均方差(RMSECV)为0.210。图3 为水分预测值和测定值的相关图。在建模过程中，运用软件自动优化功能以及比 较原始光谱图剔除了3个异常点(13和49号)，并剔除了偏离结果的样品(30 号)。

2.6水分定量分析模型的外部检验

将10份验证集样品的近红外光谱输入校正模型，预测注射用丹参多酚酸中 水分的含量，并与烘干法测定的真实值进行比较，验证校正模型的准确性。结果 模型的外部验证均方差(RMSEP)为0.243，平均相对误差为5.229％；以验证 集样品的近红外预测值和烘干法测得的真实值的比值作为预测回收率，所得平均 回收率为99.063％。可以看出预测值和真实值相对吻合，说明模型有较好的预测 能力，表2为10份样品的预测值和真实值的实验结果。

表2 NIR定量分析模型对注射用丹参多酚酸中水分含量的预测结果

4结论

注射用丹参多酚酸所含成分复杂，在11993.1～6098.8cm^-1和 5450.7～4598.2cm^-1谱段，通过近红外建模方法对数据的拟合，可以较准确的预 测其中水分的含量。并且NIR近红外漫反射色谱法具有快速、无损、准确的特 点，相比烘干法测定水分节省很多时间。该方法对保证中药制剂终产品稳定具有 现实意义，为中药及其制剂质量的快速评价和在线监控提供一定的参考依据。

附图说明：

图1注射用丹参多酚酸近红外漫反射光谱图

图2 RMSECV值随维数的变化图

图3校正集预测值和真值相关图

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

步骤1，建立近红外定量校正模型：

a取注射用丹参多酚酸样品30份作为校正集，用布擦拭干净西林瓶底部；

b开机预热光谱仪1小时后，扫描参数为：测量温度：21～25℃，湿度：51～58％， 漫反射检测，扫描波长范围为4000～12000cm^-1，分辨率8cm^-1，以空气作为空白 对照进行背景扫描，然后从西林瓶底部用近红外漫反射光谱仪扫描，每份样品扫 描3次，取其平均光谱，得到校正集样品光谱图。

c将步骤a中注射用丹参多酚酸校正集样品30份，根据2010版《中国药典》一 部附录IX H水分测定第一法(烘干法)得到每个样品中的水分含量，见下表1；

表1样品水分含量

d将由步骤b中校正集样品的原始光谱利用近红外自带分析软件OPUS6.5预处 理并分析，得到预处理方法为二阶导数，得到谱段为在11993.1～6098.8cm^-1和 5450.7～4598.2cm^-1，选择维数为4。运用偏最小二乘法(PLS)将校正集样品的 NIR光谱与烘干法测定的水分含量进行回归关联，建立水分的最优近红外定量校 正模型并分析，结果R²为0.9911，内部交叉验证均方差(RMSECV)为0.210。 步骤2，测定样品中水分含量：

a取批号为20100101的注射用丹参多酚酸样品3份，用布擦拭干净西林瓶底部；

b采用步骤1b中同样的方法，得到待试样品光谱图；

c根据步骤1中建立的近红外定量校正模型测得待测样品的水分含量，分别为 2.102％、2.940％和4.042％。为了进一步验证本试验，采用药典中烘干法测得样 品中的实际水分的含量分别为2.130％、2.876％和4.281％，两者误差在允许范围 之内。

实施例2

步骤1，建立近红外定量校正模型：同实施例1；

步骤2，测定样品中水分含量：

a取取批号为20100302的注射用丹参多酚酸样品3份，用布擦拭干净西林瓶底 部；

b采用步骤1b中同样的方法，得到待试样品光谱图；

c根据步骤1中建立的近红外定量校正模型测得待测样品的水分含量，分别为 4.662％、4.544％和4.044％。为了进一步验证本试验，采用药典中烘干法测得样 品中的实际水分的含量分别为4.790％、4.644％和4.282％，两者误差在允许范围 之内。