用于刺激树突状细胞成熟的组合物以及方法

摘要

本发明涉及一种用于刺激树突状细胞成熟的组合物以及方法。本发明所述的用于刺激树突状细胞成熟的组合物，包括OK-432与IFN-γ，在每毫升树突状细胞培养液中，OK-432的用量是5-10μg/ml，IFN-γ的用量是500-1000U/ml。本发明所述的用于刺激树突状细胞成熟的方法，包括以下步骤：将未成熟树突状细胞用新鲜的树突状细胞培养液悬浮，细胞密度在1×106/ml，加入OK-432与IFN-γ，加入量为在每毫升培养液中OK-432的浓度为5-10μg/ml，IFN-γ的浓度为500-1000U/ml，刺激时间为24-48小时，收获成熟的树突状细胞。采用本发明所述组合物以及方法所制备的成熟DC细胞具有持续分泌IL-12的能力，能持续保持树突状细胞的生物学活性，将在肿瘤免疫的基础研究和临床肿瘤免疫治疗的应用研究领域发挥重要作用。

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学、肿瘤免疫学和肿瘤免疫治疗领域，涉及人树突状细胞培养方法，尤其是涉及一种用于刺激树突状细胞成熟的组合物以及相关的和刺激树突状细胞成熟的的方法。 

背景技术

树突状细胞（DC）是免疫系统内最强大的抗原呈递细胞（APC）。通过抗原摄取、加工及呈递，DC细胞可有效诱导抗原特异性CD4及CD8 T细胞活化，从而激活获得性免疫反应。此外，DC细胞同样可激活NK细胞，增强其增殖能力及杀伤功能，从而增强先天免疫应激反应。因此，如何提高DC细胞的生物学活性，特别是充分发挥DC细胞在肿瘤免疫治疗中的作用受到医务工作人员的极大关注。在最近的一项III期临床试验中，接受DC疫苗治疗的肿瘤患者表现出肿瘤进展延缓、疾病稳定同时生存期延长，证实了DC疫苗在肿瘤免疫治疗中所发挥的作用。然而，尽管已经取得了一些好的结果，但现阶段的DC疫苗对于肿瘤患者的临床缓解率仍然很低。因此，有必要对现有DC细胞培养体系进行进一步完善，以有效提高DC疫苗在临床治疗肿瘤中的作用。 

负载肿瘤相关抗原的成熟DC细胞（MDC）比未成熟的DC细胞（iDC）具有更强的刺激T淋巴细胞产生特异抗肿瘤免疫应答。许多微生物产物如脂多糖（LPS）、双链RNA（dsRNA）以及炎症细胞因子如TNF-α均可刺激DC细胞成熟。在抗肿瘤免疫反应中，Th1免疫反应被认为在抗肿瘤免疫中发挥重要作用；而Th2以及Treg反应则被认为起负面的作用。在这个过程中，DC细胞分泌的IL-12p70水平起了关键性的作用。高水平的IL-12被证实可有效极化Th1细胞的产生，从而辅助诱导抗原特异性的CD8+CTL细胞生成。此外，IL-12还可直接作用CD8+T细胞使其进行克隆增殖，扩大效应功能以及建立免疫记忆群。因此，能够分泌高水平的IL-12是DC细胞生物活性高的标志之一。然 而，尽管目前已经发现有很多制剂能够诱导DC细胞分泌IL-12，但其持续的过程很短暂，在撤去刺激物后，DC细胞分泌IL-12的能力很快在后续培养中消失。这种现象被称之为“DC细胞衰竭”。而在无血清培养体系中，“DC细胞衰竭”现象尤为突出。“DC细胞衰竭”现象可能也部分解释了现阶段DC疫苗在临床肿瘤治疗中表现出来的缓解率较低的重要原因之一。如最近的一项III期临床试验，采用了所谓“金标准”的成熟剂组合，其中包含了IL-1、IL-6、TNF-α以及PEG2，制备成熟的DC细胞疫苗。但在针对晚期的黑色素瘤患者治疗中，并未使疗效显著提高。研究者认为一个可能的原因是使用了PGE2，虽然能够提高DC细胞CCR7的表达水平并增强其向二级淋巴结迁移的能力，但是却会显著抑制IL-12的生成，造成严重的“DC细胞衰竭”现象。因此，有必要寻求更为优化的DC细胞培养方法，使DC细胞能够稳定分泌IL-12，从而在体内诱导更有效的抗肿瘤免疫反应。 

长期以来，如何在树突状细胞培养过程中提高树突状细胞（DC）的生物学活性，有效刺激T淋巴细胞增生，诱导产生更强的抗肿瘤的特异性免疫应答一直是困扰人们的一大难题。由于这一技术的难于解决，使得树突状细胞在临床肿瘤治疗中受到极大的限制，临床治疗肿瘤患者的缓解率很低。如何在树突状细胞培养过程提高其生物学活性，使其能有效刺激的T淋巴细胞能大量扩增，并诱导产生更强的抗肿瘤的免疫应答是目前研究的热点。到目前为止，大量研究表明：树突状细胞疫苗在临床肿瘤治疗中对肿瘤患者的缓解率低的最主要原因是培养的树突状细胞的生物学活性难于持续维持，造成严重的所谓“DC细胞衰竭”，从而难于诱导机体产生强大的抗肿瘤免疫反应。 

临床级药物OK-432在过去的研究中已被证实是DC细胞一种有效的成熟剂，可增强DC细胞表面标记物的表达以及炎症细胞因子的分泌，进而有效诱导抗肿瘤免疫反应。然而，这种方法仅仅是发现在OK-432刺激物存在的情况下，DC细胞能够分泌高水平的IL-12；在撤去OK-432刺激物后，DC细胞分泌IL-12的能力明显降低，特别是在无血清培养体系中，这种现象表现的更为突出。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于刺激树突状细胞成熟的组合物，采用该组合物刺激树突状细胞（DC）所制备的成熟DC细胞具有持续分泌IL-12的能力，能持续保持树突状细胞的生物学活性，进而能更有效地诱导Th1的抗肿瘤免疫及抗肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。 

本发明所述的用于刺激树突状细胞成熟的组合物，包括OK-432与IFN-γ，在每毫升树突状细胞培养液中，OK-432的用量是5-10μg/ml，IFN-γ的用量是500-1000U/ml。 

根据本发明所述的组合物的进一步特征，所述的树突状细胞培养液是无血清树突状细胞培养液，例如，德国CellGenix公司的无血清DC细胞培养液（Serum-free Dendritic Cell Medium）。其他常用于树突状细胞的必需培养基液可用于本发明。 

本发明的另一个目的在于提供一种刺激树突状细胞成熟的培养液。 

本发明所述的刺激树突状细胞成熟的培养液，包括根据本发明所述的用于刺激树突状细胞成熟的组合物。 

本发明的再一个目的在于提供一种刺激树突状细胞成熟的培养试剂盒。 

本发明所述的刺激树突状细胞成熟的培养试剂盒，包括根据本发明所述的用于刺激树突状细胞成熟的培养液。通常，组成该培养试剂盒的其他组件，包括树突状细胞培养瓶（袋）、树突状细胞保存管等，与常规的树突状细胞培养试剂盒一致。 

本发明的另一个目的在于提供一种用于刺激树突状细胞成熟的方法。 

本发明所述的用于刺激树突状细胞成熟的方法，包括以下步骤：将未成熟树突状细胞用新鲜的树突状细胞培养液悬浮，细胞密度在1×10⁶/ml，加入OK-432与IFN-γ，加入量为在每毫升培养液中OK-432的浓度为5-10μg/ml，IFN-γ的浓度为500-1000U/ml，刺激时间为24-48小时，收获成熟的树突状细胞。 

根据本发明所述的方法的进一步特征，所述的树突状细胞培养液是Cellgro公司的树突状细胞专用的无血清培养液。 

根据本发明所述的方法的进一步特征，所述的未成熟树突状细胞是采用外周血贴壁的单核细胞在Cellgro公司的树突状细胞专用的无血清培养液中进行 常规培养至第5天而收集的悬浮生长的未成熟树突状细胞。 

根据本发明所述的方法的进一步特征，所述的培养液中含有：1000U/ml的GM-CSF和400U/ml的IL-4。 

本发明的再一个目的在于提供一种成熟的树突状细胞。 

本发明所述的成熟的树突状细胞是采用根据本发明所述的方法刺激获得的成熟的树突状细胞。 

本发明还提供了一种成熟的树突状细胞在制备抗肿瘤免疫反应的药物中的应用。 

本发明的实验已经确认，在树突状细胞培养液，尤其是无血清培养体系中，将OK-432联合IFN-γ共同刺激，所制备的成熟DC细胞能够在后续撤去刺激物的培养中仍然具有持续分泌IL-12的能力，进而更有效地诱导Th1的抗肿瘤反应和抗肿瘤特异性CTL反应，所制备的成熟DC细胞能产生更强的抗肿瘤免疫反应。 

本发明为制备高生物活性的成熟树突状细胞提供了一种有效的组合物和方法，通过本发明获得的成熟树突状细胞，能表达更高水平的MHC及共刺激分子，分泌更高水平的共刺激细胞因子，同时能够保持稳定分泌IL-12的能力，进而更有效地诱导Th1反应及抗肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞反应；同时也能够更有效的活化NK细胞，这将大大提高DC细胞生物活性的维持，并有助于提高DC细胞在临床肿瘤治疗过程中提高临床疗效，有望提高DC细胞疫苗治疗肿瘤患者的临床疗效，由于这种刺激DC细胞成熟的方法简单操作性强，必将具有广阔的临床应用前景。 

附图说明

图1显示了OK-432联合IFN-γ刺激对DC细胞表型、分泌炎症细胞因子以及迁移能力的影响。图1包括：图1A、图1B、图1C、图1D、图1E、图1F以及图1G。在横坐标中，iDC表示未成熟树突状细胞；OK-432表示OK-432刺激成熟；OK-432+IFN-γ表示OK-432联合伽玛干扰素处理；αDC1表示阿尔法1型成熟因子组合处理；CCL19表示趋化因子19；CCL21表示趋化因子21。在纵坐标中，MFI值是指荧光强度值。其中，图1A和图1B是不同刺激物 组合刺激后，DC细胞表面成熟分子CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR表达水平的流式检测；图1C和图1D是不同刺激物组合刺激后，DC细胞分泌炎症细胞因子IL-12p70、TNF-α以及IL-6的水平检测，其中C为刺激物存在的情况下DC细胞炎症细胞因子分泌的水平，D为刺激物撤去后DC细胞炎症因子分泌的水平；图1E和图1F是不同刺激物组合刺激后，DC细胞表达趋化因子受体CCR7的水平检测；图1G是不同刺激物组合刺激后，DC细胞针对趋化因子CCL19以及CCL21的趋化迁移能力检测。 

图2显示了OK-432联合IFN-γ成熟的DC对CD4+T细胞分泌细胞因子的影响。其中，图2A为不同刺激物组合刺激成熟的DC细胞与CD4+T细胞共培养7天后，细胞培养上清中细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-5、IL-10的分泌水平；图2B为不同刺激物组合刺激成熟的DC细胞与CD4+T细胞共培养7天后，加入抗CD3单抗及CD28单抗刺激后，细胞培养上清中细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-5、IL-10的分泌水平。 

图3显示了OK-432联合IFN-γ成熟的DC对CD3+、CD8+T细胞杀伤肿瘤细胞活性及分泌细胞因子的影响。图中，E:T是指效应细胞：靶细胞。其中，图3A为不同刺激物组合刺激成熟的DC细胞激活的CD8+T细胞对肝癌细胞BEL-7402的杀伤能力检测；图3B为不同刺激物组合刺激成熟的DC细胞激活的CD3+总T细胞对肝癌细胞BEL-7402的杀伤能力检测；图3C为不同刺激物组合刺激成熟的DC细胞激活的CD3+T细胞中CD4+T细胞及CD8+T细胞分泌IFN-γ水平检测；图3D为不同刺激物组合刺激成熟的DC细胞激活的CD3+T细胞中CD4+T细胞及CD8+T细胞表达早期成熟分子CD69水平检测；图3E为不同刺激物组合刺激成熟的DC细胞激活的CD8+T细胞分泌IFN-γ及表达CD69水平检测。 

图4显示了OK-432联合IFN-γ成熟的DC对NK细胞杀伤肿瘤细胞活性及分泌细胞因子的影响。图中，E:T是指效应细胞：靶细胞。其中，图4A为不同刺激物组合刺激成熟的DC细胞激活的NK细胞对肝癌细胞BEL-7402杀伤能力检测；图4B为不同刺激物组合刺激成熟的DC细胞激活的NK细胞分泌炎症细胞因子IFN-γ及TNF-α水平检测；图4C为不同刺激物组合刺激成熟的DC细胞激活的NK细胞表达早期成熟分子CD69水平检测。 

图5显示了OK-432联合IFN-γ成熟的DC细胞诱导的CTL体内抑制肿瘤生长。图中，iDC是指未成熟树突状细胞刺激的T细胞处理；OK是指OK-432成熟的树突状细胞刺激的T细胞处理；OKG是指OK-432联合伽玛干扰素成熟的树突状细胞刺激T细胞处理；αDC1－αDC1是指阿尔法1型成熟因子组合成熟的树突状细胞刺激的T细胞处理。其中，图5A为不同刺激物组合刺激成熟的DC细胞激活的T细胞与肝癌细胞BEL-7402共同注射到小鼠皮下后，肿瘤细胞的生长曲线；图5B为38天后，不同处理的各组所取出的肿瘤组织的尺寸；图5C为38天后，不同处理的各组所取出的肿瘤组织的重量。 

图6显示了OK-432联合IFN-γ刺激对DC细胞中p38及NF-κB信号通路的影响。 

具体实施方式

实施例1：外周血单核细胞来源的成熟DC细胞（MoDC）的制备 

采用密度梯度离心法分离获得外周血单核细胞（PBMC）。采用Quanta-007无血清培养基悬浮分离的PBMC，以1×10⁸的数量铺于75cm²的培养瓶（培养瓶购置于BD公司）中，置于CO₂培养箱中静置培养1小时。轻轻晃动培养瓶，吸出未贴壁的淋巴细胞，置于新的培养瓶中，补加20U IL-2以及双抗，继续培养备用。贴壁细胞加入含GM-CSF 1000U/ml，IL-4 400U/ml以及双抗的Cellgro公司无血清DC细胞专用培养液进行培养。隔天全量补新鲜培养液一次。在DC培养液中常规培养至第5天，贴壁细胞分化为未成熟的DC细胞。收集悬浮生长的未成熟DC细胞（iDC），600×g离心洗涤，用新鲜的DC培养液重新悬浮，细胞密度在1×10⁶/ml。 

DC细胞的成熟方案按以下进行：OK-432（10μg/ml）和IFN-γ（1000U/ml）联合加入细胞培养液中，刺激时间24-48小时，即可收获成熟的树突状细胞。经流式细胞检测，所获得的成熟的树突状细胞的CD40、CD80、CD86以及HLA-DR表达均在90%以上，IL-12p70分泌量达到10ng/ml以上。结果表明，这种方法培养出的树突状细胞的生物活性要比以往的方法培养出的DC细胞活性更强。 

在上述刺激方法中，所采用的OK-432是已经临床应用的一种溶血性链球 菌A型Su株制剂，例如采用日本中外制药公司生产的OK-432，或者采用国产制剂，商品名为“沙培林”（通用名称：A群链球菌制剂；英文名称：Group A Streptococcus Preparation；成分：经青霉素处理的A群溶血性链球菌的冻干品）。 

在上述刺激方法中，所采用的IFN-γ是采用国产制剂，商品名为“上生雷泰”（通用名称：重组人干扰素γ；生产企业：上海生物制品研究所）。 

在上述刺激方法中，所采用的DC细胞培养液是采用CellGenix公司（德国弗赖堡）无血清DC细胞培养液（Serum-free Dendritic Cell Medium），商标为CellGro，订购号为20801-0500及20801-0100（瓶装）或20901-0500（袋装）。 

本发明采用OK-432联合IFN-γ共同刺激，所制备的成熟DC细胞，能使DC细胞表达更高水平的MHC及共刺激分子，分泌更高水平的细胞因子，同时能够保持稳定分泌IL-12的能力，进而更有效地诱导Th1的抗肿瘤免疫及抗肿瘤特异性CTL免疫应答；同时也能够有效的活化NK细胞。因此，该技术必将在肿瘤免疫的基础研究和临床肿瘤免疫治疗的应用研究领域发挥重要作用，有望提高DC细胞疫苗治疗肿瘤患者的临床疗效。本发明所述刺激DC细胞成熟的方法与现有技术相比的独特的优势将通过以下的实施例来进一步详细说明。 

实施例2：OK-432联合IFN-γ诱导DC细胞表达更高水平的表面标记物及分泌更高水平细胞因子 

首先，测定不同成熟方法对DC细胞表面标记物表达及细胞因子分泌的影响。如图1A和图1B所示，单纯OK-432（OK-DC组）、OK-432联合IFN-γ（OKG-DC组）以及αDC1型成熟因子组合刺激（αDC1-DC组）均可增强DC细胞表面标记物的表达。OK-DC与αDC1-DC两组的表达水平没有显著差异。然而，OK-432联合IFN-γ刺激的DC细胞（OKG-DC），其表面标记物包括CD40、CD80、CD86、HLA-DR的表达水平显著高于OK-DC与αDC1-DC两组。 

其次，又进一步测定了DC细胞在不同成熟剂刺激下分泌细胞因子的水平。从图1C和图1D可见，3种成熟方法均可提高DC细胞分泌炎症因子IL-12、TNF-α以及IL-6的水平。而OK-432联合IFN-γ刺激可诱导DC细胞产生非常高水平的IL-12，其量极显著的高于OK-DC及αDC1-DC两组细胞的水平。更重要的是，撤去成熟刺激剂后，在后续的二次培养中，只有OKG-DC仍然具有 稳定分泌高水平IL-12能力，而其它两组DC细胞则分泌较低水平的IL-12。此外，OKG-DC在二次培养中分泌TNF-α和IL-6的水平也显著高于其它两组DC细胞。 

实施例3：OK-432联合IFN-γ刺激成熟的DC细胞具有更高的迁移能力 

由于DC细胞的迁移能力决定了其在体内进入二级淋巴节诱导T细胞活化的水平，测定了3种不同成熟方法对DC细胞迁移能力的影响。从图1E、图1F至图1G可见，3种成熟方法均能增强DC细胞表达CCR7的水平，OKG-DC组的DC细胞CCR7表达水平显著高于OK-DC组的DC细胞，而与αDC1-DC组的水平没有显著差异。与此相一致，与OK-DC组的DC细胞相比，OKG-DC组的DC细胞针对CCR7配体CCL19及CCL21表现出更高的趋化迁移能力，而与αDC1-DC组的DC细胞迁移能力没有显著差异。 

实施例4：OK-432联合IFN-γ刺激成熟的DC细胞更有效的诱导Th1反应 

接下来测定不同成熟方法对DC细胞诱导Th1反应的影响。如图2A和图2B所示，发现3组成熟的DC细胞均可诱导CD4+T细胞分泌更高水平IFN-γ和TNF-α，同时IL-5及IL-10的水平则有所降低。相比之下，OKG-DC组刺激的CD4+T细胞分泌最高水平的IFN-γ。采用CD3及CD28刺激可进一步提升CD4+T细胞分泌IFN-γ和TNF-α的水平，而OKG-DC组刺激的CD4+T细胞分泌的IFN-γ仍然表现出最高水平；TNF-α分泌水平也有同样的趋势。 

实施例5：OK-432联合IFN-γ刺激成熟的DC细胞更有效的诱导肿瘤特异性CTL反应 

进一步测定不同成熟方法对DC细胞诱导肿瘤特异性CTL反应的影响。采用HLA-A2限制的AFP多肽负载成熟的DC细胞，然后与CD3+或CD8+T细胞混合培养。发现，与其余两组相比，OKG-DC组的DC细胞诱导增殖的CD3+或CD8+T细胞，均可更高效地杀伤AFP阳性的肝癌细胞（参见图3A和图3B）。进一步的测定发现，OKG-DC组诱导的CD3+或CD8+T细胞，均分泌更高含量的IFN-γ以及表达更高水平的CD69（参见图3C，图3D，图3E）。 

实施例6：OK-432联合IFN-γ刺激成熟的DC细胞更有效的活化NK细胞 

除了诱导抗原特异性的CTL反应外，还测定了不同成熟方法对DC细胞活化先天免疫NK细胞的影响。与前面的结果相一致，与其它两组相比，OKG-DC组的DC细胞刺激的NK细胞具有对肿瘤细胞最高的杀伤活性（参见图4A）。同时，OKG-DC组活化的NK细胞分泌最高水平的IFN-γ、TNF-α以及表达最高水平的CD69（参见图4B和图4C）。 

实施例7：OK-432联合IFN-γ刺激成熟的DC细胞诱导的CTL更有效地在体内抑制肿瘤的生长 

前面的实施例主要通过体外实验证实了OK-432联合IFN-γ刺激成熟的DC细胞可更有效的刺激CTL产生，并有效的杀伤肿瘤细胞。这里通过小鼠移植瘤的体内实验进一步验证这一发现。如图5所示，当注射了由OK-432联合IFN-γ刺激成熟的DC细胞诱导产生的CTL后，小鼠肿瘤生长速度与其它组相比显著降低。在肿瘤细胞接种38天后，处死小鼠，取出肿瘤组织。结果发现OK-432联合IFN-γ实验组的肿瘤体积最小，而且肿瘤重量也最轻。因此，体内实验的结果进一步证实了OK-432联合IFN-γ刺激成熟的DC细胞诱导的CTL可有效的杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞的生长。 

实施例8：OK-432联合IFN-γ刺激更有效的激活DC细胞中p38和NF-κB信号通路 

由于前面的研究已经发现OK-432可通过激活p38和NF-κB信号通路来促进DC细胞的成熟，因此在此探讨不同成熟方法对DC细胞中p38和NF-κB信号通路激活的影响。如图6所示，发现3种成熟刺激均能够使p38MAKP信号通路中关键信号分子p38蛋白以及下游的ATF2蛋白迅速磷酸化。在120min的时间点，发现OKG-DC组p38蛋白以及ATF2蛋白的磷酸化水平最高。同样，3种成熟刺激均能够使NF-κB信号通路种关键分子I-κB蛋白以及下游的p65蛋白迅速磷酸化。在120min的时间点，发现OKG-DC组I-κB蛋白以及p65蛋白的磷酸化水平最高。