14-芳基醚穿心莲內酯衍生物及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了14-芳基醚穿心莲內酯衍生物及其制备方法和应用，其为式（I）结构。该化合物、异构体或其盐可应用于调节核受体FXR功能的药物或预防或治疗与核受体FXR相关疾病药物的制备中。

说明书

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体涉及一种14-芳基醚穿心莲内酯衍生物、立体异构体、 顺反异构体、或其药学上可接受的盐的制备和药学上的应用。这些化合物通过调节核受体 FXR的功能或通过其它相同、相似或不同的作用靶标或作用机理用来治疗和预防肿瘤、 糖尿病和肥胖症及其它代谢性疾病、心血管病变、生殖系统疾病，免疫性疾病、炎症、包 括老年痴呆症和Parkinson症及其它神经障碍类疾病，用于降低胆固醇和血脂，以及治疗 和预防黄热病毒所引起的登革热、丙型肝炎、西尼罗河病毒感染引起的疾病和HIV引起 的爱滋病。

背景技术

核受体(Nuclear receptor或称Nuclear hormone receptor，简称NHR)是一类存在于细 胞质或细胞核内并可扩散与特异性配体(ligand)结合的细胞内信号蛋白,与配体结合后的 受体能与DNA应答元件结合形成配体依赖的转录调控因子从而调节细胞内糖代谢、脂代 谢、能量转换和免疫应答的重要生命过程(Handschin C,S,Roth A,Looser R, Oscarson M,Kaufmann MR,Podvinec M,Gnerre C,Meyer UA Nucl Recept2004,2,7.)，因此 它们在细胞增殖、细胞分化和细胞内外平衡中发挥着关键作用(Evans RM Mol Endocrinol 2005,19,1429-1438.)，在生殖、发育和代谢等生命过程中起重要的调控作用 (Robinson-Rechavi M,Escriva GH,Laudet V J Cell Sci2003,116,585-586.)。

法尼酯衍生物X受体（Farnesoid X Receptor,FXR）是核激素受体超家族成员之一， 具有典型的NHR家族结构。目前的研究发现FXR在调控胆汁酸、脂蛋白和葡萄糖代谢、 肝再生、肠道细菌生长以及肝毒素应答反应等过程中扮演重要作用。在肝脏中，胆固醇被 代谢形成胆汁酸，胆汁酸不仅可以作为生理溶剂以有利于脂溶性维生素和脂肪的吸收、转 运和分布，还可以作为信号分子以激活FXR调节胆汁酸和胆固醇代谢。因此，合成和筛 选可以调控FXR活性的化合物将有利于开发治疗代谢性疾病的新药。

核受体有时与非甾体类抗炎药(NSAID即nonsteroidal anti-inflammatory drug)的作用靶 标COX(cyclooxygenase)酶家族共同发挥作用，如核受体PPARδ、RAR、RXR、和COX-2 在结肠癌中都有表达变化(Delage B,Rullier A,Capdepont M,Rullier E,Cassand P Nutrition  Journal2007,6,20)；在胃癌细胞中胆酸(bile acid)能够诱导COX-2的表达(Park MJ,Kim  KH,Kim HY,Kim K,Cheong J Carcinogenesis2008,29(1),2385-2393)；核受体Nur77抑制 依赖于COX-2的炎症反应(Shao Q,Shen LH,Hu LH,Pu J,Qi MY,Li WQ,Tian FJ,Jing Q, He B J.Molecular Cellular Cardiology2010,49(2),304)；RXRa介导布洛芬类NSAID药物 对Alzheimer症的β-淀粉样物质(β-amyloid)的作用(You X,Zhang YW J Neurochemistry 2009,111,142-149.)；核受体PPARg在大鼠小神经胶质细胞中被氟比洛芬类NSAID药物 HCT1026所激活(Bernardo A,Ajmone-Cat MA,Gasparini L,Ongini E,Minghetti L J  Neurochem.2005,92(4),895-903.)。

β-羟基-β-甲基戊二酰辅酶A还原酶(hydroxymethylglutaryl-coenzyme A reductase, HMG-CoA reductase)的还原酶还原反应是胆固醇合成的决速步骤。一方面，从化学结构上 考虑穿心莲内酯与HMG-CoA还原酶抑制剂-真菌代谢物洛伐他汀(Lovastatin)或其半合 成衍生物辛伐他汀(Simvastatin)、普伐他汀(Pravastatin)有一定的空间结构相似性，因此穿 心莲内酯及其衍生物可能具有抑制HMG-CoA还原酶的功能；另一方面，胆固醇生物合 成过程中许多核受体及其内源性配体参与其中，所以穿心莲内酯及其衍生物还可能通过其 它机理抑制胆固醇的生物合成。

发明内容

本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一类具有相应活性的14-芳基醚穿心莲內 酯衍生物、立体异构体、顺反异构体、或其药学上可接受的盐。

本发明的另一目的是提供一种上述化合物的制备方法。

本发明的第三个目的是提供一种上述化合物在制药方面的用途。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

式(I)所示的14-芳基醚穿心莲內酯衍生物、异构体或其药学上可接受的盐，

其中，

Z环为苯环、吡啶环、哒嗪环、嘧啶环、吡嗪环、呋喃环、噻唑环、吡咯环、噁唑环、 噻唑环、咪唑环、异恶唑环、异噻唑环或吡唑环；

R¹～R⁵分别独立地选自氢、卤素、氰基、硝基、C_1～6烷基、C_1～6卤代烷基、C_1～6酰 基、C_1～6羧酸基、C_1～6酰胺基、取代或非取代的C_3～6环烷基、取代或非取代的C_1～6烷氧 基、取代或非取代的C_1～6烷硫基、取代或非取代的C_2～6羧酸酯、取代或非取代的氨基、 取代或非取代的磺酰基、取代或非取代的C_2～6烯烃基、取代或非取代的C_3～6环烯烃基、 取代或非取代的C_3～6杂环基、取代或非取代的芳香基、取代或非取代的芳香烷基；所述 取代基选自卤素、氰基、硝基、C_1～6烷基、C_1～6卤代烷基、C_1～6烷氧基、C_1～6烷硫基或 C_2～6烯烃基；

或者R¹～R⁵中相邻的两个基团与Z环共同构成萘、蒽、菲、喹啉、异喹啉、苯并吡 喃、苯并吡喃酮、苯并呋喃、苯并噻吩、吲哚、嘌呤或喋啶基团；

R⁶或R⁷分别独立地选自氢、C_1～6酰基、取代或非取代的C_1～6烷基、取代或非取代的 C_3～6环烷基、取代或非取代的杂环基、取代或非取代的C_2～6烯烃基、取代或非取代的C_3～6环烯烃基、取代或非取代的芳香基、取代或非取代的芳香烷基或取代或非取代杂环烯基；； 所述取代基选自卤素、氰基、硝基、C_1～6烷基、C_1～6卤代烷基、C_1～6烷氧基、C_1～6烷硫基 或C_2～6烯烃基；

或者R⁶和R⁷相连构成C_1～6亚烷基或C_3～6环烷基；

未取代或任意取代芳香烃基、未取代或任意取代杂环芳香烃基、未取代或任意取代芳 香烷基、未取代或任意取代杂环芳香烷基、未取代或任意取代芳香烯烃基、未取代或任意 取代杂环芳香烯基

*表示为R构型或S构型。

优选的，本发明的化合物为如式（II）所示的化合物、异构体或其药学上可接受的盐，

其中，

R¹、R²、R³、R⁴或R⁵分别独立地选自氢、硝基、卤素、C_1～6烷基、C_1～6卤代烷基、 C_3～6环烷基、C_1～6烷氧基、C_2～6羧酸基或C_2～6羧酸酯基；

R⁶或R⁷分别独立地选自氢、C_1～6酰基、C_1～6烷基、C_1～6卤代烷基，或者R⁶和R⁷相 连构成C_1～6亚烷基；

*表示为R构型或S构型。

进一步优选的，本发明的化合物为如式（III）所示的化合物、异构体或其药学上可接 受的盐，

R¹、R²、R³、R⁴或R⁵分别独立地选自氢、硝基、卤素、C_1～3烷基、C_1～3卤代烷基、 C_1～3烷氧基、C_3～6环烷基、C_2～6羧酸基或C_2～6羧酸酯基；

R⁶或R⁷分别独立地选自氢、C_1～3酰基、C_1～3烷基、C_1～3卤代烷基，或者R⁶和R⁷相 连构成C_1～6亚烷基；

*表示为R构型或S构型。

在式(I)、式（II）和式（III）中，优选的，R¹或R⁵分别独立地选自氢、硝基、C_1～3烷基、C_1～3卤代烷基、C_1～3烷氧基、卤素、C_2～6羧酸基或C_2～6羧酸酯基；

在式(I)、式（II）和式（III）中，优选的，R²或R⁴分别独立地选自氢、硝基、C_1～3烷基、C_1～3卤代烷基、C_2～6羧酸基、C_2～6羧酸酯基或卤素；

在式(I)、式（II）和式（III）中，优选的，R³选自氢或硝基。

在式(I)、式（II）和式（III）中，优选的，R¹、R²、R³、R⁴或R⁵分别独立地选自氢、 硝基、甲基、甲氧基、氯、氟或甲酸乙酯基。

在式(I)、式（II）和式（III）中，优选的，R⁶或R⁷分别独立地选自氢或乙酰基，或 者R⁶和R⁷相连构成异亚丙基。

本发明的化合物可采用如下制备方法：

本发明进一步提供了一种优选的化合物的制备方法，其包括如下步骤:

a)穿心莲内酯14-α构型OH通过Mitsunobu反应引入乙酰基，同时14-位的构型发 生变化（从α-构型到β-构型）。惰性气体存在和冰浴下依次往反应三口烧瓶中加 入穿心莲内酯衍生物-醇14-α-OH（1当量），三苯基磷（1～10当量），醋酸（1～10 当量）和无水THF后，然后缓慢加入偶氮二甲酸二异丙酯（DIAD，1～10当量） 的THF溶液，冰浴搅拌1小时后，室温反应过夜。蒸掉大部分THF，用乙酸乙 酯/水（1/1～1/5）萃取数次除去大部分副产物肼后，无水硫酸钠干燥有机层后经柱 层析或者重结晶，得到14-β-OAc产品。

b)14-β-OAc产品溶于甲醇中，加入催化量的对甲苯磺酸，室温搅拌反应30min后蒸 干溶剂，乙酸乙酯稀释，依次用饱和碳酸氢钠溶液、水、饱和氯化钠溶液各洗一 次后，有机相用无水硫酸钠干燥，经柱层析或者重结晶得穿心莲内酯14-OAc差 向异构体或14-差向异构体。

c)将14-差向异构体、催化量对甲苯磺酸吡啶盐（PPTS）、再加入一定量除水的二氯 甲烷，最后加入2,2-二甲氧基丙烷（1-200当量），缓慢加热至40℃，反应3-12 小时后反应基本完全，停止加热并冷却至室温后用乙酸乙酯稀释，饱和碳酸氢钠 溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥后经柱层析或者重结晶得14-β-OH产品。

d)惰性气体存在和冰浴下依次往反应烧瓶中加入穿心莲内酯衍生物-醇（1当量）， 三苯基磷（1～10当量），酚（1～10当量）和无水THF后，然后缓慢加入偶氮二甲 酸二异丙酯（DIAD，1～10当量）的THF溶液，冰浴搅拌1小时后，室温-80℃ 反应过夜。蒸掉大部分THF，用乙酸乙酯/水（1/1～1/5）萃取数次除去大部分副 产物肼后，无水硫酸钠干燥有机层，经柱层析得到A或D系列产品。

e)A或D系列产品溶于甲醇中，加入催化量的对甲苯磺酸，室温搅拌反应3Omin后 蒸干溶剂，乙酸乙酯稀释，依次用饱和碳酸氢钠溶液、水、饱和氯化钠溶液各洗 一次后，有机相用无水硫酸钠干燥，经柱层析得B或E系列产品。

f)反应瓶中依次加入B或E系列产品(1个当量)，氯化锌(0.5～20当量)，醋酐(1～100 当量），于30-90℃加热反应5小时。冷却至室温后加入水、乙酸乙酯，饱和碳酸 氢钠溶液充分洗涤，再经水、饱和氯化钠溶液洗涤后有机相用无水硫酸钠干燥， 经柱层析得C或F系列产品。

本发明的另一需要解决的技术问题是提供上述14-芳基醚穿心莲内酯衍生物、立体异 构体、顺反异构体、或其药学上可接受的盐在医药中的应用：

14-芳基醚穿心莲内酯衍生物化合物、立体异构体、顺反异构体、或其药学上可接受 的盐用于调节核受体FXR(Farnesoid X receptor)的功能以及预防和治疗与FXR相关的疾病 药物中的应用。

14-芳基醚穿心莲内酯衍生物、立体异构体、顺反异构体、或其药学上可接受的盐用 于治疗和预防肿瘤及用于胆固醇和血脂代谢异常，如降低胆固醇和血脂。

14-芳基醚穿心莲内酯衍生物、立体异构体、顺反异构体、或其药学上可接受的盐用 于治疗和预防糖尿病和肥胖症及其它代谢性疾病、心血管病变、生殖系统疾病，免疫性疾 病、炎症、老年痴呆症和Parkinson症及其它神经障碍类疾病，

一种药物组合物，其主要以本发明的14-芳基醚穿心莲内酯衍生物、立体异构体、顺 反异构体、或其药学上可接受的盐作为活性成分与至少一种药学上可接受的载体组成。

定义

构成本发明的一部分是药学上可接受的溶剂化物，可以使结晶水合物或者是与其它溶 剂结晶物，如乙醇等。

构成本发明的一部分是药学上可接受的盐：

如果本发明化合物为碱性的，则适当的“药学上可接受的盐”包括本发明化合物和无机 酸或有机酸反应形成的本发明化合物的常规无毒盐。例如，包括得自无机酸例如盐酸、氢 溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等的盐，也包括得自有机酸例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、 硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷 氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、 羟乙基磺酸、三氟乙酸等的盐。

如果本发明化合物为酸性的，则适当的“药学上可接受的盐”是指本发明化合物通过药 学上可接受的无毒碱包括无机碱及有机碱制备的盐。得自无机碱的盐包括铝盐、铵盐、钙 盐、铜盐、铁盐、亚铁盐、锂盐、镁盐、锰盐、亚锰盐、钾盐、钠盐、锌盐等。得自药学 上可接受的有机无毒碱的盐，所述碱包括伯胺、仲胺和叔胺的盐，取代的胺包括天然存在 和合成的取代胺、环状胺及碱性离子交换树脂。例如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、二 乙胺、2－二乙基氨基乙醇、2－二甲基氨基乙醇、氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N－乙基 吗啉、N－乙基哌啶、葡萄糖胺、氨基葡萄糖、组氨酸、异丙基胺、赖氨酸、甲基葡萄糖 胺、吗啉、哌嗪、哌啶、多胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、 氨基丁三醇等。

本发明所述化合物可具有不对称中心、手性轴及手性面，且存在的外消旋物、外消 旋物混合物及单一非对映体和所有可能的同分异构体及其混合物包括旋光异构体均包括 在本发明内。另外，本发明公开的化合物可以互变异构体存在，且两种互变异构形式都 包括在本发明的范围内，即使仅描述了其中一种互变异构结构。例如，任何要求保护的 下列化合物A都理解为包括互变异构结构B，且反之亦然，同样包括其混合物。

本发明存在双键顺反异构体时，以单一异构体存在，或者是顺式异构体和反式异构 体的混合物，即使仅描述了其中一种异构结构。

本发明所用术语“烃基”意指包括C1-C18烷基、C2-C18烯基、C2-C18炔基、芳基、 芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、杂环基、杂环烷基。自取代基划入环系统的线表示所指的键 可连接到任何能取代的环的原子上。如果环系统为多环，其意味着这种键仅连接到邻近环 的任何适当的碳原子上。

术语“任意取代”要理解本领域普通技术人员可选择本发明化合物的取代基及取代型 式而提供化学上稳定的并可通过本领域技术和方法自可以获得的原料可以合成的化合物。 如果取代基自身被超过一个基团取代，应理解这些基团可在相同碳原子上或不同碳原子 上，只要使结构稳定。

本发明所用术语“烷基”意指包括具有特定碳原子数目的支链的、直链的或环状的饱和 脂肪烃基。“C1-C18烷基”中“C1-C18”的定义包括以直链或支链排列的具有1、2、3、4、 5、6、7、8～18个碳原子主链的基团。例如，“C1-C18烷基”具体包括甲基、乙基、正丙 基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基、庚基、辛基、环丙基、甲基-环丙 基、2,2-二甲基-环丁基、2-乙基-环戊基、环己基等。

术语“烯基”指直链、支链或环状的，主链含有12～18个碳原子及至少一个碳-碳双键 的非芳香烃基。因此，“C12-C18烯基”指主链具有12～18个碳原子的烯基。烯基包括乙烯 基、丙烯基、丁烯基、2-甲基丁烯基和环己烯基等。烯基的直链、支链或环状部分可含有 双键且如果指明了取代的烯基则此部分可被取代。

术语“炔基”指直链、支链或环状的，主链含有12～18个碳原子及至少一个碳碳三键的 非芳香烃基。因此，“C12-C18炔基”指具有12～18个碳原子的炔基。炔基包括乙炔基、丙 炔基、丁炔基、3-甲基丁炔基等。炔基的直链、支链或环状部分可含有三键且如果指明了 取代的炔基则此部分可被取代。

术语“芳基”是指环中多达3-10个原子的任何稳定的单环或每个环中多达3-10个原子 双环碳环，其中至少一个环为芳香环。芳基的实例包括苯基、萘基、蒽基及联苯基。

术语“芳烷基”包括其中上述“烷基”被上述“芳基”取代的基团。芳烷基的实例包括苄 基、苯乙基、萘基亚甲基、蒽基亚甲基。

术语“杂芳基”代表环中多达3-10个原子的稳定的单环或每个环中多达3-10个原子双 环碳环，其中至少一个环为芳香环且含有1-4个选自O、N和S的杂原子。本定义范围内 的杂芳基包括但不限于吖啶基、咔唑基、噌啉基、喹噁啉基、吡唑基、吲哚基、苯并三唑 基、呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、异喹啉基、噁唑基、异噁唑基、 吲哚基、吡嗪基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基。

术语“杂芳烷基”包括其中上述“烷基”被上述“杂芳基”取代的基团。杂芳基的实例包括 呋喃亚甲基、吡啶乙基、吡咯亚甲基。

术语“杂环基”是指含有1-4个选自O、N和S等杂原子的3-12元芳香性或非芳香性 杂环，且包括双环基团。“杂环基”因此包括上面提及的杂芳基，也包括其二氢化及四氢化 类似物。“杂环基”进一步的实例包括但不限于苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并吡喃基、苯 并吡唑基、苯并三唑基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、咔唑基、咔啉基、噌啉基、呋喃基、 咪唑基、二氢吲哚基、吲哚基，吲唑基、异苯并呋喃基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、 异噁唑基、噁二唑基、噁唑基、噁唑啉、异噁唑啉、氧杂环丁烷基（oxetanyl）、吡喃基、 吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并吡啶基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、 喹啉基、喹噁啉基、四氢吡喃基、四唑基、四唑并吡啶基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、 三唑基、氮杂环丁烷基、l,4－二噁烷基、氮杂环庚烷基（hexallydroazepinyl）、哌嗪基、 哌啶基、吡啶－2－酮基、吡咯烷基、吗啉基、硫代吗啉基（thiomorpholinyl）、二氢苯并咪唑基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、二氢苯并噁唑基、二氢呋喃基、二氢咪唑基、 二氢吲哚基、二氢异噁唑基、二氢异噻唑基、二氢噁二唑基、二氢噁唑基、二氢吡嗪基、 二氢吡唑基、二氢吡啶基、二氢嘧啶基、二氢吡咯基、二氢喹啉基、二氢四唑基、二氢噻 二唑基、二氢噻唑基、二氢噻吩基、二氢三唑基、二氢氮杂环丁烷基、亚甲基二氧基苯甲 酰基、四氢呋喃基和四氢噻吩基及其N-氧化物。杂环取代基的连接可通过碳原子或通过 杂原子实现。

术语“环状”表明环中含有3多个碳或者其它原子的环状化合物。

术语“多环”包括其中形成至少2个环的结构，这些环之中至少有两个环之间有1个共 同原子的螺环或至少2个共同的原子的并（合）环或桥（跨）环结构。典型的结构如金刚 烷、降冰片、降冰片烯、蒎烷、（异）樟烷、蒈烷等的基本结构。这些环上可以含有或不 含取代基的结构，这些多环结构可以杂多环。

术语“杂环基”包括其中上述“烷基”被上述“杂环基”取代的基团。杂环基实例包括咪唑 亚甲基、吡咯烷乙基、四唑亚甲基。

术语“卤素”意指包括氟、氯、溴和碘。

术语“单独”是指独立应用的变量在应用于应用之间独立变化。

本发明所述穿心莲内酯衍生物可以被配制为药用组合物，按照多种合适选择的给予方 式给患者用药，这些途径包括全身例如口服或胃肠外，通过静脉内、肌肉、透皮或皮下等。

优选的穿心莲内酯衍生物的给药方式是口服，但需根据化合物的具体物理和化学特点 和稳定性的不同，以及治疗目的的差异决定使用的用药剂型和给药方式，包括但不限于缓 释可控的用药方式。

具体实施方式

实施例1：穿心莲内酯14-β构型衍生物的合成

穿心莲内酯14-α构型OH通过Mitsunobu反应引入乙酰基，同时14-位的构型发生变 化（从α-构型到β-构型）。惰性气体存在和冰浴下依次往反应三口烧瓶中加入穿心莲内酯 衍生物-醇14-α-OH（1当量），三苯基磷（1～10当量），醋酸（1～10当量）和无水THF 后，然后缓慢加入偶氮二甲酸二异丙酯（DIAD，1～10当量）的THF溶液，冰浴搅拌1 小时后，室温反应过夜。蒸掉大部分THF，用乙酸乙酯/水（1/1～1/5）萃取数次除去大部 分副产物肼后，无水硫酸钠干燥有机层后经柱层析或重结晶，得到14-β-OAc产品，收率 ～70%。

14-β-OAc产品溶于甲醇中，加入催化量的对甲苯磺酸，室温搅拌反应30min后蒸干 溶剂，乙酸乙酯稀释，依次用饱和碳酸氢钠溶液、水、饱和氯化钠溶液各洗一次后，有机 相用无水硫酸钠干燥，经柱层析或重结晶得穿心莲内酯14-OAc差向异构体或14-差向异 构体，收率在～90%。

将14-差向异构体、催化量对甲苯磺酸吡啶盐（PPTS）、再加入一定量除水的二氯甲 烷，最后加入2,2-二甲氧基丙烷（1-200当量），缓慢加热至40℃，反应3-12小时后反应 基本完全，停止加热并冷却至室温后用乙酸乙酯稀释，饱和碳酸氢钠溶液洗涤，有机相用 无水硫酸钠干燥后经柱层析或重结晶得14-β-OH产品，收率在～82%。

实施例2：A或D系列化合物的合成

惰性气体存在和冰浴下依次往反应烧瓶中加入穿心莲内酯衍生物-醇（1当量），三苯 基磷（1～10当量），酚（1～10当量）和无水THF后，然后缓慢加入偶氮二甲酸二异丙酯 （DIAD，1～10当量）的THF溶液，冰浴搅拌1小时后，室温-80℃反应过夜。蒸掉大部 分THF，用乙酸乙酯/水（1/1～1/5）萃取数次除去大部分副产物肼后，无水硫酸钠干燥有 机层，经柱层析或重结晶得到A或D系列产品，产率在30～80%。上述化合物¹H NMR、 ¹³C NMR、高分辨质谱数据见表格1。

实施例3：B或E系列化合物的合成

A或D系列产品溶于甲醇中，加入催化量的对甲苯磺酸，室温搅拌反应3Omin后蒸 干溶剂，乙酸乙酯稀释，依次用饱和碳酸氢钠溶液、水、饱和氯化钠溶液各洗一次后，有 机相用无水硫酸钠干燥，经柱层析或重结晶得B或E系列产品，收率在～90%。上述化合 物¹H NMR、¹³C NMR、高分辨质谱数据见表格1。

实施例4：C或F系列化合物的合成

反应瓶中依次加入B或E系列产品(1个当量)，氯化锌(0.5～20当量)，醋酐(1～100 当量），于30-90℃加热反应5小时。冷却至室温后加入水、乙酸乙酯，饱和碳酸氢钠溶 液充分洗涤，再经水、饱和氯化钠溶液洗涤后有机相用无水硫酸钠干燥，经柱层析或重结 晶得C或F系列产品，产率40～90%。上述化合物¹H NMR、¹³C NMR、高分辨质谱数据 见表格1。

表格1部分化合物的¹H NMR、¹³C NMR、高分辨质谱数据

实施例5：核受体法尼酯X受体(FXR)配体筛选基本方案

使用可模拟体内的生物状态的体外筛选模型，按照公开的筛选方法，筛选本发明所述 的14-芳基醚穿心莲内酯衍生物调节核受体FXR活性。

通常待测定化合物溶解在DMSO中配成梯度溶液，在使用前用PBS稀释成含 2%DMSO的工作溶液，不含药物的对照工作溶液为含2%DMSO的PBS，含药工作溶液和 不含药物的对照工作溶液加入到实验孔中被稀释20倍，所有实验孔中最终DMSO的浓度 为0.1%。化合物活性测定同时设置空白组、阳性药物或阳性化合物的对照组。

将处于对数生长期的293T细胞以2x10⁴/孔传代于96孔细胞培养板中，培养过夜，长到 80～90%满时用于转染。

用优化培养液DMEM稀释Lipofectamine2000试剂(0.5μl/100μl)和质粒DNA。优化培 养液稀释后质粒浓度为pCMV-Gal4-FXR-LBD，25ng/孔、pFR-Luci，50ng/孔、pFRTlaczeo  plasmid，50ng/孔。Lipofectamine2000稀释5分钟后，将稀释后的脂质体和质粒DNA等体 积混合，再在室温放置20min后移取脂质体/DNA混合物。

迅速将上述细胞换液成含有10％胎牛血清的DMEM100μl。将加样器头深入液面下逐 滴加入脂质体/DNA混合物，并轻轻摇晃混匀。

将待测化合物溶于DMSO中，在细胞瞬时转染质粒6个小时后，分别加入不同浓度的 化合物及同浓度的DMSO对照。放于5％CO₂培养箱中继续培养24个小时。根据Promega公 司Steady-Glo kit说明书利用VERITAS^TMMicroplateluminometer(Turner Biosystems)测定细 胞的荧光值，荧光值反应FXR活性，并以Gal作为内标进行校正。取20μl细胞裂解物置于 96孔板中，加入100×Mg溶液1.5μl，1×ONPG溶液33μl，0.1mol/L磷酸钠(pH7.5)95.5μl。 37℃温浴至出现黄色，加入50μl,0.1mol/L Na₂CO₃终止反应读取OD₄₀₅。

对于拮抗剂的活性研究需要同时加入受体相应的内源性激动剂鹅脱氧胆酸 (chenodoxycholic acid,CDCA)(终浓度25μM)。

部分化合物的拮抗剂的活性见表格2。目前文献报道主要是FXR激动剂或者同时具 有部分激动剂和部分拮抗剂特征的调节剂（如GW4064、MFA-1等，见PNAS2008,105(14): 5337–5342；J.Surgery Concepts&Practice2010年第04期）。本专利报道的FXR拮抗剂 的化合物比另一篇文献报道的FXR拮抗剂化合物具有更好的活性（J.Med.Chem.2012,55, 7037-7053的最好FXR抑制剂的IC₅₀在8.9μM，本专利表格2中前B2、A3、A2、14-α-OH、 A4、A6、A8、A9、A10、A11共10个化合物活性IC₅₀低于5.0μM，14-β-OAc、E1、 B1、B3、D2、B9、B10、B11共8个化合物的IC₅₀小于或接近8.9μM）。

表格2部分化合物的FXR拮抗剂的活性