用哺乳动物细胞生产高纯度糖基化的重组人胶质细胞源性神经营养因子的方法

摘要

用哺乳动物细胞生产高纯度糖基化的重组人胶质细胞源性神经营养因子的方法，包括如下步骤：构建哺乳细胞表达质粒pcDNA3.1-hGDNF；选用HEK293细胞作为工程细胞，利用细胞转染方法将pcDNA3.1-hGDNF导入所述HEK293细胞内，得到稳定表达hGDNF的HEK293细胞；用ELISA方法筛选出高产率稳定表达hGDNF的HEK293克隆细胞株作为生产hGDNF的工程株；在DMEM培养基中培养所述工程株，将上清液不断收集，并更换新的DMEM培养基，收集后的上清液经过离心、过滤、调pH值为8.2，得到含hGDNF上清液；通过离子交换层析法和凝胶过滤层析法对蛋白质进行纯化。利用本发明生产的重组人胶质细胞源性神经营养因子糖基化程度和纯度均高于用原核细胞生产的同类产品。

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种用哺乳动物细胞生产高纯度糖基化的重组人胶质细胞源性神经营养因子的方法。

背景技术

帕金森病，由Parkinson(1817)首先描述，是一种常见的中老年人神经系统变性疾病，帕金森病是老年人中第四位最常见的神经变性疾病，在≥65岁的人群中，1%患有此病，在＞40岁的人群中则为0.4%，本病也可在儿童期或青春期发病。白种人发病率最高，其次是黄种人。PD是一终身性疾病，迄今为止尚无根治的方法，一旦患病则需要终身治疗，由于手术治疗价格昂贵而且有严格的手术指征，而基因治疗和干细胞治疗尚处于研究阶段，因而药物治疗仍是目前治疗PD的主要方法。

胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophicfactor，GDNF)的神经营养作用主要是通过其两类受体亚基介导，即胶质细胞源性神经营养因子受体alpha(GFRots)亚基和受体酪氨酸激酶Ret亚基。GFRots亚基靠其C端的磷酯酰肌醇键(GPI)锚定在细胞膜的外表面，属膜外蛋白，不能直接转导信号。GDNF首先与GFRαl受体结合形成GDNF-GFRotl复合物，此复合物再与Ret结合形成三聚体复合物，引起Ret的二聚化，并引起酪氨酸残基自磷酸化，从而引起下游的信号转导，发挥GDNF的生理作用。

体内外的许多实验研究均证明GDNF可以促进中脑黑质多巴胺能神经元，颅神经和脊髓运动神经元,脑干的去甲肾上腺素能神经元,基底前脑胆碱能神经元,背根神经节,交感神经元的存活。GDNF在这些不同环境中的表达对于其在神经变性性疾病研究及治疗有着重要的意义。直接将GDNF注入脑内到PD动物模型的黑质纹状体系统内,可改善这些模型动物的行为学症状及其黑质纹状体系统多巴胺能神经元的存活率。所以，GDNF以PD为适应症，潜在的治疗对象还包括坐骨性神经痛、周围神经损伤后造成的慢性神经痛、其它神经退行性疾病以及男性生殖干细胞疾病，因此具有广泛的社会效益和巨大的经济效益。

但是，目前均采用大肠杆菌来表达生产GDNF，但是大肠杆菌作为原核细胞，其表达生产的GDNF为人体所使用时，会产生抗体；同时，GDNF的纯度以及糖基化程度均十分重要，因此急需一种用哺乳动物细胞生产高纯度糖基化的重组人胶质细胞源性神经营养因子的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供用哺乳动物细胞生产高纯度糖基化的重组人胶质细胞源性神经营养因子的方法，从而消除上述背景技术中缺陷。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

用哺乳动物细胞生产高纯度糖基化的重组人胶质细胞源性神经营养因子的方法，包括如下步骤：

S1、构建哺乳细胞表达质粒pcDNA3.1-hGDNF；

S2、选用HEK293细胞作为工程细胞，利用Lipofectamine细胞转染方法将pcDNA3.1-hGDNF导入所述HEK293细胞内，并用G418进行阳性转染细胞筛选，得到稳定表达hGDNF的HEK293细胞；

S3、用ELISA方法筛选出高产率稳定表达hGDNF的HEK293克隆细胞株作为生产hGDNF的工程株；

S4、蛋白质的生产，在DMEM培养基中培养所述工程株，将上清液收集，并每隔4天更换新的DMEM培养基，收集后的上清液经过离心、过滤、调pH值为8.2，得到含hGDNF上清液；

S5、通过离子交换层析法和凝胶过滤层析法对蛋白质进行纯化，从而得到高纯度糖基化的重组人胶质细胞源性神经营养因子（rhGDNF）。

作为一种改进，所述步骤S1中，以pcDNA3.1-为表达载体，利用限制内切酶xho I和Not I将表达载体线性化，再用T4DNA连接酶把hGDNF cDNA（用限制内切酶xho I和Not I双切后）连接至pcDNA3.1表达载体中，构建的表达质粒为pcDNA3.1-hGDNF。

作为一种改进，所述步骤S2中，细胞转染方法的具体步骤为：

A、把2μg pcDNA3.1-hGDNF加入到110μl Opt i-MEM培养基中，轻轻混匀后放置室温备用；

B、加15μl的Lipofectamine（DNA转染试剂）至150μl Opti-MEM培养基中，轻轻混匀后放置室温备用；

C、将步骤A和步骤B的液体混合，得到DNA-Lipofectamine混合物；

D、将步骤C得到的DNA-Lipofectamine混合物，在25℃室温下放置30分钟；

E、然后加320μl Opti-MEM培养基到步骤D的DNA-Lipofectamine混合物中，轻轻混匀；

F、用2ml Opti-MEM培养基洗HEK293细胞一次，然后取500μl步骤E的DNA-Lipofectamine混合物，加入到HEK293细胞中；

G、在37℃、5%CO2（体积浓度，下同）的细胞培养箱中培养5小时，然后去掉上清液，加入新鲜配制的3ml DMEM培养液，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养24小时；

H、当细胞在培养皿底部的覆盖率达到80%后，用0.01M PBS洗细胞一次，然后加入新鲜的、含有500μg/ml G418的DMEM培养液对已转染的细胞基因组中插入了hGDNF基因的阳性细胞进行筛选，两周后，得到稳定表达hGDNF的HEK293细胞。

作为一种进一步的改进，所述步骤G、H的DMEM培养液中，还含有其中含有体积百分比为10%的胎牛血清、以及总量为1wt%的青霉素、链霉素、谷氨酸和非必需氨基酸。

作为一种改进，所述步骤S3中，用ELISA方法对HEK293稳定细胞株克隆的上清液中hGDNF进行定量测定，筛选出高表达克隆细胞株利用无血清DMEM培养基和悬浮培养驯化，得到生产hGDNF的HEK293工程株。

上述ELISA方法即酶联免疫吸附测定法，它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）。测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。其方法简单，方便讯速，特异性强。

作为一种改进，所述步骤S4中，将生产hGDNF的HEK293工程株在无血清DMEM培养基中悬浮培养12天，期间每4天收集一次上清液，并添加新鲜DMEM培养基；将收集的上清液合并后以1000转/分的转速离心10分钟；然后用0.45μm的过滤膜进行过滤，得到的滤液用0.5M NaOH调节至pH值为8.2，得到得到含hGDNF上清液。

作为一种改进，所述步骤S5中，离子交换层析法的步骤为：选用XK16/20层析柱(GE Healthcare)，先用1.5M的NaCl平衡液平衡所述XK 16/20层析柱，再利用150mM的NaCl溶液平衡，调所述XK 16/20层析柱的pH值为8.2；将含hGDNF上清液过柱，并利用0.59M～0.82M的NaCl溶液进行洗脱，得到含有hGDNF的洗脱液。

作为一种进一步的改进，所述离子交换层析法中，1.5M的NaCl平衡液中含有10mM磷酸盐、5mM EDTA。

作为一种改进，所述步骤S5中，凝胶过滤层析法的步骤为：将含有hGDNF的洗脱液放入50mM的NaCl溶液中，用HiPrep26/10层析柱除盐、浓缩、冻干，然后将样品溶解在纯净水中，以0.5ml/分的速率上Superdex200HR10/30层析柱，使用AKTA纯化仪10进行纯化，从而得到所述高纯度糖基化的重组人胶质细胞源性神经营养因子。

作为一种进一步的改进，所述凝胶过滤层析法中50mM的NaCl溶液的pH为8.2，且含有10mM磷酸盐缓冲液。

发明人对生产的高纯度糖基化的重组人胶质细胞源性神经营养因子进行了糖基化程度检测，方法步骤如下：将经过纯化的2μg hGDNF悬浮于30μl生理盐水中，在pH为7.5、含有0.1wt%十二烷基硫酸钠、20mM的磷酸盐以及50mMβ-巯基乙醇的溶液中加热到100℃，并保持5分钟，使之变性；在冰上冷却5分钟后，再加入0.75wt%的NP-40；然后再添加0.0025单位的N-糖基化酶F，在37℃下放置6小时；阴性对照为不添加N-糖基化酶F处理的样品，然后用蛋白印迹法进行分析，得到的结果如图1所示，从图中可以看出，经过N-糖基化酶F处理后hGDNF的分子量明显减小，从而可以获知本发明中制备的hGDNF具有较高的糖基化程度。

同时，发明人也对生产的高纯度糖基化的重组人胶质细胞源性神经营养因子进行了体外生物活性的分析：利用纯化的hGDNF用PC12细胞株（该细胞株对hGDNF的刺激有反应能力）进行体外生物活性的分析。在培养皿中加入DMEM培养基（含体积百分比为5%热灭活的马血清、体积百分比为10%胎牛血清、100单位/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素）；然后将，每平方厘米接种PC12细胞20000个细胞；室温下连续培养24个小时后，加入50ng纯化的用HEK293所表达的糖基化的hGDNF；同时，设阳性对照和阴性对照，阳性对照为用大肠杆菌表达生产的无糖基化的hGDNF（R&D Sys tem货号212-GD-010），另外一个不加入hGDNF作为阴性对照。

7天后利用显微镜观察PC12细胞株的生长状况。

结果：第一组的PC12细胞株具有很多的神经元细胞分支，第二组分支较少，第三组基本无分支。

这就证明，本发明生产的hGDNF具有活性，能够有效刺激PC12细胞株使之产生反应。

由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

本发明提供的采用哺乳动物细胞生产重组人胶质细胞源性神经营养因子（rhGDNF），而且经过检测生产的重组人胶质细胞源性神经营养因子糖基化程度和纯度较高，非常适合治疗中枢神经系统退行性疾病、神经病变和外周神经损伤。

附图说明

图1是hGDNF糖基化程度检测结果图；

图2是纯化hGDNF之前对hGDNF蛋白表达水平的测定结果图；

图3是离子交换层析法线性洗脱的结果图；

图4是pcDNA3.1-的质粒图谱。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

下述实施例中，采用的溶剂、培养基、材料等均为公知。例如：pcDNA3.1-为Invitrogen公司生产的载体质粒，其质粒图谱如图4所示；Lipofectamine为Invitrogen公司出产的DNA转染试剂。

实施例1

用哺乳动物细胞生产高纯度糖基化的重组人胶质细胞源性神经营养因子的方法，包括如下步骤：

S1、构建哺乳细胞表达质粒pcDNA3.1-hGDNF：详细步骤为：以pcDNA3.1-为表达载体，利用限制内切酶xho I和Not I将表达载体线性化，再用T4DNA连接酶把hGDNF cDNA连接至pcDNA3.1表达载体中，构建的表达质粒为pcDNA3.1-hGDNF。

S2、选用HEK293细胞作为工程细胞，利用细胞转染方法将pcDNA3.1-hGDNF导入所述HEK293细胞内，得到稳定表达hGDNF的HEK293细胞，细胞转染方法的具体步骤为：

A、把2μg pcDNA3.1-hGDNF加入到110μl Opti-MEM培养基中，轻轻混匀后放置室温备用；

B、加15μl的Lipofectamine（DNA转染试剂）至150μl Opti-MEM培养基中，轻轻混匀后放置室温备用；

C、将步骤A和步骤B的液体混合，得到DNA-Lipofectamine混合物；

D、将步骤C得到的DNA-Lipofectamine混合物，在25℃室温下放置30分钟；

E、然后加320μl Opt i-MEM培养基到步骤D的DNA-Lipofectamine混合物中，轻轻混匀；

F、用2ml Opti-MEM培养基洗HEK293细胞一次，然后取500μl步骤E的DNA-Lipofectamine混合物，加入到HEK293细胞中；

G、在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养5小时，然后去掉上清液，加入新鲜配制的3ml DMEM培养液（其中含有10%体积百分比的胎牛血清、以及总量为1wt%的青霉素、链霉素、谷氨酸和非必需氨基酸），在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养24小时；

H、当细胞在培养皿底部的覆盖率达到80%后，用0.01M PBS洗细胞一次，然后加入新鲜的、含有500μg/ml G418的DMEM培养液（其中含有体积百分比为10%的胎牛血清、以及总量为1wt%的青霉素、链霉素、谷氨酸和非必需氨基酸）对已转染的细胞基因组中插入了hGDNF基因的阳性细胞进行筛选，两周后，得到稳定表达hGDNF的HEK293细胞。

S3、用ELISA方法筛选出高产率稳定表达hGDNF的HEK293克隆细胞株作为生产hGDNF的工程株，详细步骤为：用ELISA方法对HEK293稳定细胞株克隆的上清液中hGDNF进行定量测定，筛选出高表达克隆细胞株利用无血清DMEM培养基和悬浮培养驯化，得到生产hGDNF的HEK293工程株。

S4、蛋白质的生产，在DMEM培养基中培养所述工程株，将上清液不断收集，并更换新的DMEM培养基，收集后的上清液经过离心、过滤、调pH值为8.2，得到含hGDNF上清液，详细步骤为：将生产hGDNF的HEK293工程株在无血清DMEM培养基中悬浮培养12天，期间每4天收集一次上清液，并添加新鲜DMEM培养基；将收集的上清液合并后以1000转/分的转速离心10分钟；然后用0.45μm的过滤膜进行过滤，得到的滤液用0.5M NaOH调节至pH值为8.2，得到得到含hGDNF上清液。

在纯化hGDNF之前，取少量含hGDNF上清液用蛋白质印迹法（Western Blot）进行hGDNF蛋白表达水平的鉴定。具体做法是：将15μl含的hGDNF的上清液中加入5μl样品缓冲液（含1wt%β-巯基乙醇）然后加热到100℃，并保持5分钟后使蛋白质变性，放置冰上冷却后，将20μl样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转印到硝酸纤维素薄膜上。并用第一抗体抗hGDNF的特异抗体（R&DSystem货号AB-212-NA）和第二抗体偶联HRP（SantaCruz货号SC2354）来检测，检测结果如图2所示。

S5、通过离子交换层析法和凝胶过滤层析法对蛋白质进行纯化，从而得到高纯度糖基化的重组人胶质细胞源性神经营养因子（rhGDNF）：其中，离子交换层析法的步骤为：选用XK 16/20层析柱(GE Healthcare)，先用1.5M的NaCl平衡液（含有10mM磷酸盐、5mM EDTA）平衡所述XK16/20层析柱，再利用150mM的NaCl溶液平衡，调所述XK 16/20层析柱的pH值为8.2；将含hGDNF上清液过柱，并利用0.71M的NaCl溶液进行洗脱，得到含有hGDNF的洗脱液；凝胶过滤层析法的步骤为：将含有hGDNF的洗脱液放入50mM的NaCl溶液（pH为8.2，且含有10mM磷酸盐缓冲液）中，用HiPrep26/10层析柱除盐、浓缩、冻干，然后将样品溶解在纯净水中，以0.5ml/分的速率上Superdex200HR10/30层析柱，使用AKTA纯化仪10进行纯化，从而得到所述高纯度糖基化的重组人胶质细胞源性神经营养因子。

实施例2

其他操作与实施例1相同，不同的是，本实施例在离子交换层析法中采用0.59M的NaCl溶液进行洗脱。

实施例3

其他操作与实施例1、2相同，不同的是，本实施例在离子交换层析法中采用0.82M的NaCl溶液进行洗脱。

对比例：

其他操作与实施例1、2、3相同，不同的是，本实施例在离子交换层析法中采用线性梯度浓度为150mM～1M的NaCl溶液进行洗脱，将洗脱液分管收集（每管2ml），将收集管中的样品用上述蛋白质印迹法进行hGDNF含量测定，有效的测定结果如图3所示。从图中可得知，12～30管（即NaCl溶液为0.59M～0.82M时）中收集到洗脱液中hGDNF的含量最高，而其他浓度下，hGDNF几乎没有被洗脱。

本发明不局限于上述具体实施方式，一切基于本发明的技术构思，所作出的结构上的改进，均落入本发明的保护范围之中。