一种测定重组人胶质细胞源性神经营养因子活性的细胞学方法

摘要

一种测定重组人胶质细胞源性神经营养因子活性的细胞学方法,包括如下步骤：构建表达质粒pcDNA3.1-hGFRα1，然后制备稳定表达hGFRα1的HEK293细胞；构建表达质粒pcDNA3.1-hRET，再制备能够同时表达hGFRα1和hRET以及荧光素酶报告系统的HEK293细胞；将待测rhGDNF加入到同时表达hGFRα1和hRET以及荧光素酶报告系统的HEK293细胞中，培养后测定荧光强度F1；同时设置没有加入待测rhGDNF的空白对照组，培养后测定荧光强度F2；将F1、F2进行比较。本发明能够有效测定重组人胶质细胞源性神经营养因子（rhGDNF）活性，测定结果准确可靠。

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种测定重组人胶质细胞源性神经营养因子活性的细胞学方法。

背景技术

帕金森病，由Parkinson(1817)首先描述，是一种常见的中老年人神经系统变性疾病，帕金森病是老年人中第四位最常见的神经变性疾病，在≥65岁的人群中，1%患有此病，在＞40岁的人群中则为0.4%，本病也可在儿童期或青春期发病。白种人发病率最高，其次是黄种人。PD是一终身性疾病，迄今为止尚无根治的方法一旦患病则需要终身治疗，由于手术治疗价格昂贵而且有严格的手术指征，而基因治疗和干细胞治疗尚处于研究阶段，因而药物治疗仍是目前治疗PD的主要方法。

胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophicfactor，GDNF)的神经营养作用主要是通过其两类受体亚基介导，即胶质细胞源性神经营养因子受体alpha(GFRots)亚基和受体酪氨酸激酶Ret亚基。GFRots亚基靠其C端的磷酯酰肌醇键(GPI)锚定在细胞膜的外表面，属膜外蛋白，不能直接转导信号。GDNF首先与GFRαl受体结合形成GDNF-GFRotl复合物，此复合物再与Ret结合形成三聚体复合物，引起Ret的二聚化，并引起酪氨酸残基自磷酸化，从而引起下游的信号转导，发挥GDNF的生理作用。

体内外的许多实验研究均证明GDNF可以促进中脑黑质多巴胺能神经元，颅神经和脊髓运动神经元,脑干的去甲肾上腺素能神经元,基底前脑胆碱能神经元,背根神经节,交感神经元的存活。GDNF在这些不同环境中的表达对于其在神经变性性疾病研究及治疗有着重要的意义。直接将GDNF注入脑内到PD动物模型的黑质纹状体系统内,可改善这些模型动物的行为学症状及其黑质纹状体系统多巴胺能神经元的存活率。所以，GDNF以PD为适应症，潜在的治疗对象还包括坐骨性神经痛、周围神经损伤后造成的慢性神经痛、其它神经退行性疾病以及男性生殖干细胞疾病，因此具有广泛的社会效益和巨大的经济效益。

但是目前并没有一种能够有效的对重组人胶质细胞源性神经营养因子（rhGDNF）活性进行检测的细胞学方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种测定重组人胶质细胞源性神经营养因子活性的细胞学方法，从而消除上述背景技术中缺陷。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种测定重组人胶质细胞源性神经营养因子活性的细胞学方法,包括如下步骤：

S1、构建表达质粒pcDNA3.1-hGFRα1，然后用转染法制备稳定表达hGFRα1的HEK293细胞；

S2、构建表达质粒pcDNA3.1-hRET，然后以步骤S1中制备的稳定表达hGFRα1的HEK293细胞为基础，用转染法制备能够同时稳定表达hGFRα1和hRET以及荧光素酶报告系统的HEK293细胞；

S3、将待测rhGDNF加入到步骤S2得到的同时稳定表达hGFRα1和hRET以及荧光素酶报告系统的HEK293细胞中，培养后测定荧光强度F1；同时设置没有加入所述待测rhGDNF的空白对照组，培养后测定荧光强度F2；

S4、将F1、F2进行比较，若F1＞F2，则说明待测的rhGDNF具有活性；若F1≤F2，则说明待测的rhGDNF不具有活性。

作为一种改进，步骤S1中，以pcDNA3.1-为表达载体，利用限制内切酶XhoI和Not I将载体线性化，再用T4DNA连接酶将hGFRα1cDNA连接至pcDNA3.1中，构建表达质粒pcDNA3.1-hGFRα1。

作为一种进一步的改进，步骤S1中，转染法的详细步骤为：

A、把2μg pcDNA3.1-hGFRα1加入到110μl Opti-MEM培养基中，轻轻混匀后放置室温备用；

B、加15μl的Lipofectamine（DNA转染试剂）至150μl Opti-MEM培养基中，轻轻混匀后放置室温备用；

C、将步骤A和步骤B的液体混合，得到DNA-Lipofectamine混合物；

D、将步骤C得到的DNA-Lipofectamine在室温（25℃）放置30分钟；

E、然后加320μl Opti-MEM培养基到步骤D的DNA-Lipofectamine混合物中，轻轻混匀备用；

F、用2ml Opti-MEM培养基洗HEK293细胞一次，然后取500μl步骤E的DNA-Lipofectamine混合物，加入到HEK293细胞中；

G、在37℃、5%二氧化碳的细胞培养箱中培养5小时,然后去掉上清液，留下贴壁生长的HEK293细胞，换上新鲜配置的3ml DMEM培养液，且所述DMEM培养液中含体积百分比为10%的胎牛血清、以及总重为1wt%的青霉素、链霉素、谷氨酸、非必需氨基酸，在37℃、5%二氧化碳的细胞培养箱中培养24小时；

H、当细胞在培养皿底部的覆盖率达到80%后，用生理盐水清洗细胞，并加入新鲜配制的含G418的选择性DMEM培养基对已转染的细胞基因组中插入了hGFRα1基因的阳性细胞进行筛选，所述选择性DMEM培养基中含体积百分比为10%的胎牛血清、总重为1wt%的青霉素、链霉素、谷氨酸和非必需氨基酸，以及500μg/ml的G418；两周后，得到稳定表达hGFRα1的HEK293细胞。

作为一种改进，步骤S2中，以pcDNA3.1-为表达载体，利用限制内切酶XhoI和Not I将载体线性化，再用T4DNA连接酶将hRET cDNA连接至pcDNA3.1-载体中，构建表达质粒为pcDNA3.1-hRET。

作为一种进一步的改进，步骤S2中，转染法的详细步骤为：

A、把2μg pcDNA3.1-hRET加入到110μl含有0.75μg pFR-Luc(荧光素酶报告基因载体)、0.25μg pFA2-Elk1（信号通路报告载体）的Opti-MEM培养基中，轻轻混匀后放置室温备用；

B、加15μl的Lipofectamine（DNA转染试剂）至150μl Opti-MEM培养基中，轻轻混匀后放置室温备用；

C、将步骤A和步骤B的DNA-Lipofactamine液体混合，得到DNA-Lipofectamine混合物；

D、将步骤C得到的DNA-Lipofectamine混合物在室温（25℃）下放置30分钟；

E、然后加320μl Opti-MEM培养基到步骤D的DNA-Lipofectamine混合物中，轻轻混匀；

F、用2ml Opti-MEM培养基洗步骤S1得到的具有pcDNA3.1-hGFRα1的HEK293稳定细胞株一次，然后取500μl步骤E的DNA-Lipofectamine混合物，加入到HEK293细胞中；

G、在37℃5%二氧化碳的细胞培养箱中培养5小时，然后去掉上清液，换上新鲜配制的3ml DMEM培养液，且所述DMEM培养液中含体积百分比为10%的胎牛血清、以及总重为1wt%的青霉素、链霉素、谷氨酸、非必需氨基酸，在温度为37℃、5%二氧化碳的培养箱中培养24小时；

H、当细胞在培养皿底部的覆盖率达到80%后，用3ml磷酸盐缓冲液清洗细胞，然后加入1ml胰蛋白酶将细胞悬浮，收集并离心后，去掉上清液，并加入适量体积的Opti-MEM培养基，且所述Opti-MEM培养基中含有体积百分比为0.5%的胎牛血清、以及总重为1wt%的青霉素、链霉素、谷氨酸、非必需氨基酸，使细胞浓度为2x10⁵个/ml，在37℃、5%二氧化碳的细胞培养箱中培养16个小时。

作为一种改进，步骤S3中，将待测的rhGDNF配成浓度为1.0～83.3ng/μl的待测溶液，并将所述待测溶液加入到步骤S2得到的同时表达hGFRα1和hRET以及荧光素酶报告系统的HEK293细胞中，在37℃5%二氧化碳的细胞培养箱中培养16小时后，然后室温放置20分钟，将在室温平衡后的萤光素酶检测试剂底物100μl（Promaga货号E1483）加入到HEK293细胞中，混匀后立即用荧光读板仪（Wallac1420Work Station Victor Plate Reader）测定荧光强度F1；同时设置没有加入所述待测溶液的空白对照组，相同条件培养后测定荧光强度F2。

由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

本发明能够有效测定重组人胶质细胞源性神经营养因子（rhGDNF）活性，测定结果准确可靠。

附图说明

图1是本发明的rhGDNF剂量-反应关系曲线图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1

一种测定重组人胶质细胞源性神经营养因子活性的细胞学方法,包括如下步骤：

S1、以pcDNA3.1-为表达载体，利用限制内切酶XhoI和Not I将载体线性化，再用T4DNA连接酶将hGFRα1cDNA连接至pcDNA3.1中，构建表达质粒pcDNA3.1-hGFRα1，然后用转染法制备表达hGFRα1的HEK293细胞，详细步骤为：

A、把2μg pcDNA3.1-hGFRα1加入到110μl Opti-MEM培养基中，轻轻混匀后放置室温备用；

B、加15μl的Lipofectamine（DNA转染试剂）至150μl Opti-MEM培养基中，轻轻混匀后放置室温备用；

C、将步骤A和步骤2B的DNA-Lipofactamine液体混合，得到DNA-Lipofectamine混合物；

D、将步骤C得到的DNA-Lipofectamine在室温（25℃）放置30分钟；

E、然后加320μl Opti-MEM培养基到步骤D的DNA-Lipofectamine混合物中，轻轻混匀备用；

F、用2ml Opti-MEM培养基洗HEK293细胞一次，然后取500μl步骤E的DNA-Lipofectamine混合物，加入到HEK293细胞中；

G、在37℃、5%二氧化碳的细胞培养箱中培养5小时,然后去掉上清液，留下贴壁生长的HEK293细胞，换上新鲜配置的3ml DMEM培养液，且所述DMEM培养液中含体积百分比为10%的胎牛血清、以及总重为1wt％的青霉素、链霉素、谷氨酸、非必需氨基酸，在37℃、5%二氧化碳的细胞培养箱中培养24小时；

H、当细胞在培养皿底部的覆盖率达到80%后，用生理盐水清洗细胞，并加入新鲜配制的选择性DMEM培养基对已转染的细胞基因组中插入了hGFRα1基因的阳性细胞进行筛选，所述选择性DMEM培养基中含体积百分比为10%的胎牛血清、总重为1wt%的青霉素、链霉素、谷氨酸和非必需氨基酸，以及500μg/ml的G418；两周后，得到稳定表达hGFRα1的HEK293细胞。

S2、以pcDNA3.1-为表达载体，利用限制内切酶XhoI和Not I将载体线性化，再用T4DNA连接酶将hRET连接至pcDNA3.1-载体中，构建表达质粒为pcDNA3.1-hRET，然后以步骤S1中制备的表达hGFRα1的HEK293细胞为基础，用转染法制备能够同时表达hGFRα1和hRET以及荧光素酶报告系统的HEK293细胞，详细步骤为：

A、把2μg pcDNA3.1-hRET加入到110μl含有0.75μg pFR-Luc(荧光素酶报告基因载体)、0.25μg pFA2-Elk1（信号通路报告载体）的Opti-MEM培养基中，轻轻混匀后放置室温备用；

B、加15μl的Lipofectamine（DNA转染试剂）至150μl Opti-MEM培养基中，轻轻混匀后放置室温备用；

C、将步骤A和步骤B的DNA-Lipofactamine液体混合，得到DNA-Lipofectamine混合物；

D、将步骤C得到的DNA-Lipofectamine混合物在室温（25℃）下放置30分钟；

E、然后加320μl Opti-MEM培养基到步骤D的DNA-Lipofectamine混合物中，轻轻混匀；

F、用2ml Opti-MEM培养基洗步骤S1得到的具有pcDNA3.1-hGFRα1的HEK293稳定细胞株一次，然后取500μl步骤E的DNA-Lipofectamine混合物，加入到HEK293细胞中；

G、在37℃5%二氧化碳的细胞培养箱中培养5小时，然后去掉上清液，换上新鲜配制的3ml DMEM培养液，且所述DMEM培养液中含体积百分比为10%的胎牛血清、以及总重为1wt%的青霉素、链霉素、谷氨酸、非必需氨基酸，在温度为37℃、5%二氧化碳的培养箱中培养24小时；

H、当细胞在培养皿底部的覆盖率达到80%后，用3ml磷酸盐缓冲液清洗细胞，然后加入1ml胰蛋白酶将细胞悬浮，收集并离心后，去掉上清，并加入适量体积的Opti-MEM培养基，且所述Opti-MEM培养基中含有体积百分比为0.5%的胎牛血清、以及总重为1wt%的青霉素、链霉素、谷氨酸、非必需氨基酸，使细胞浓度为2x10⁵个/ml，在37℃5%二氧化碳的细胞培养箱中培养16个小时。

S3、将待测的rhGDNF配成浓度为42.2ng/μl的待测溶液，并将所述待测溶液加入到步骤S2得到的同时表达hGFRα1和hRET以及荧光素酶报告系统的HEK293细胞中，在37℃5%二氧化碳的细胞培养箱中培养16小时后，然后室温放置20分钟，将在室温平衡后的萤光素酶检测试剂底物100μl（Promaga货号E1483）加入到HEK293细胞中，混匀后立即用荧光读板仪（Wallac1420WorkStation Victor Plate Reader）测定荧光强度F1；同时设置没有加入所述待测溶液的空白对照组，相同条件培养后测定荧光强度F2。

S4、将F1、F2进行比较，发现F1＞F2，则说明待测的rhGDNF具有活性。

实施例2

其他步骤与实施例1相同，不同的是，步骤S3中将待测的rhGDNF配成浓度为1.0ng/μl的待测溶液。

结果：将F1、F2进行比较，发现F1与F2基本相等，则说明待测的rhGDNF不具有活性。

实施例3

其他步骤与实施例1、2相同，不同的是，步骤S3中将待测的rhGDNF配成浓度为83.3ng/μl的待测溶液。

结果：将F1、F2进行比较，发现F1＜F2，则说明待测的rhGDNF不具有活性。

对比实施例

其他步骤与实施例1、2、3相同，不同的是，步骤S3中将有活性的rhGDNF（储备液浓度为250μg/μl）进行100倍稀释。然后对稀释后rhGDNF的再进行1:3倍比稀释。测定rhGDNF的终浓度范围为0-250ng/μl共8个浓度，依次为250、83.3、27.8、9.3、3.1、1.0、0.3、0ng/μl。将上述各浓度的rhGDNF加入到上述细胞中，并设置空白对照（未加入rhGDNF）以及阴性对照组（细胞未转染pcDNA3.1-hRET）。在37℃5%二氧化碳的细胞培养箱中培养16小时后，从37℃5%二氧化碳的细胞培养箱中取出，室温放置20分钟。将在室温平衡后的萤光素酶检测试剂底物100μl（Promaga货号E1483）加入到细胞中，混匀后立即用96孔荧光读板仪（Wallac1420Work Station Victor Plate Reader）测定荧光强度，并绘制rhGDNF剂量-反应关系曲线图，如图1所示。

从图中可以明显发现，当rhGDNF的浓度为1.0～83.3ng/μl时，其相对荧光单位明显的大于空白对照组，当rhGDNF的浓度超过83.3ng/μl时，两者的差值基本不再增加。

本发明不局限于上述具体实施方式，一切基于本发明的技术构思，所作出的结构上的改进，均落入本发明的保护范围之中。