一种利用微生物发酵提高剑麻皂苷产率的方法

摘要

本发明公开了一种利用微生物发酵提高剑麻皂苷产率的方法。使用的目的菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期:2011年2月25日，保藏编号:CCTCC NO:M2011050，分类命名: 棒杆菌GLHZB21，即Corynebacterium sp.GLHZB21，目的菌株经发酵和培养后，加入剑麻废料中，经发酵、离心，取得上清液，在真空干燥箱中去水烘干，即提取到剑麻皂苷。本发明利用微生物发酵可明显提高皂苷产率，与现在流行的酸碱化学提取方法相比产率可提高30%左右，且该微生物具有安全环保、成本低、降解速度快、降解率高等特点，因此该内容可以用于传统的皂苷工业生产中，取代目前的酸碱化学提取工艺方法。

说明书

技术领域：

本发明属于生命科学、生物技术、生物化学、天然产物化学、中药有效成分皂苷的提取和纯化等领域，特别涉及一种利用微生物发酵提高剑麻皂苷产率的方法，具体是从土壤中筛选出一种菌株用于提取剑麻皂苷可以提高剑麻皂苷产率。 

背景技术：

剑麻含有皂苷，剑麻又名凤尾兰，是一种常见的龙舌兰属植物，多年生叶纤维作物，剑麻皂苷来源于剑麻纤维传统生产产品之后废弃的麻汁和麻渣，是合成甾体激素类药物的医药中间体和重要原料；从鲜叶片压榨的汁中能够得到蛋白质、果胶多糖、皂苷等；5%-9%粗蛋白质；阿拉伯半乳聚糖、木聚糖、木葡聚糖等果胶多糖；A、B、C、D、E、F、G等皂苷，其中剑麻皂苷B由海柯皂苷元和葡萄糖、半乳糖、木糖所组成，剑麻皂苷D由海柯皂苷元和葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖所组成；皂苷元有绿莲皂苷元、洛柯皂苷元、巴尔波皂苷元。 

随着生活水平的不断提高，天然药物的使用越来越受到人们的青睐。皂苷以其具有多种生物活性而被广泛应用于食品、保健品、药品；如抗肿瘤、抗炎、抗菌、止血、抗衰老、降血糖、保肝，以及饲料强化剂等，在许多领域具有很大的研究价值和开发前景。 

目前传统的皂苷分离提取的方法主要有：酸碱水解的溶剂法和沉淀法，其局限性是提取分离有效组分的量以及纯化的程度都相对较低，碱溶酸沉，由于酸碱水解法条件比较剧烈，常伴有皂苷的脱水、构型变换等副反应，并且要注意选用合适的试剂以避免对苷元的破坏；超声萃取法能够避免高温高压对有效成分的破坏，但是它对容器壁的厚薄和容器的摆放位置有很高的要求，否则就会影响到浸出效果；超临界萃取法，对物料有较好的渗透性和较强的溶解能力，对物料成分某些的提取具有更高的效率，但是由于皂苷类化合物羟基多、极性大，需要加大压力和加入适当的催化剂来提高萃取产率，所以要大规模生产高浓度的皂苷仍然成本较高。上述表明，亟待开发新式绿色环保、经济、可持续发展的提取分离方法。 

生物工程发酵的方法已经日新月异，在生物领域的应用越来越广泛；通过加入目的菌株，加速植物细胞壁的破除并尽可能的释放出纤维素里面的有效成分，从而降低了剑麻皂苷的提取难度，通过采用料液菌、温度、发酵时间等因素的最适配比，能够达到节约原料、试剂、动力、劳力和减少环境污染的目的，将发酵成本降到最低，为大规模生产提供更经济的方法。 

发明内容：

本发明的目的是为降低剑麻皂苷提取难度，提供一种利用微生物发酵提高剑麻皂苷产率的方法。  

具体步骤为： 

(1)制备培养基： 

a.称取去皮土豆100-250克，并将土豆切成方块，加0.5-2.0升水后加热煮沸20-40分钟，之后冷却至室温，用四层纱布过滤，所得滤液定容至0.5-2.0升，备用。 

b.取步骤(1)第a步所制得的备用滤液0.05-1.5升置于三角瓶中，再向三角瓶内加入1.0-2.0克的琼脂粉，用牛皮纸包扎三角瓶口，在1.103MPa、121℃条件下灭菌20分钟，然后将三角瓶内产物迅速地倒入直径为9厘米的培养皿内，加盖，待琼脂凝固后，即制得固体培养基，备用。 

c.将步骤(1)第a步所制得的备用滤液中剩余的滤液0.5-1.95升移至1.0-2.5升容器内，用牛皮纸包扎瓶口，在1.103MPa、121℃的条件下灭菌20分钟，制得液体发酵培养基，备用。 

(2)目的菌株的平面培养和发酵培养： 

在无菌条件下，将斜面保存的目的菌株涂布在步骤(1)第b步制得的固体培养基上，20-35℃下培养36小时，然后取出菌株，接种到50-200毫升步骤(1)第c步制得的液体发酵培养基中，在28-36℃下以100-300转/分钟的速度摇床振荡发酵培养72小时，制得发酵液；所述目的菌株微生物现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期:2011年2月25日，保藏编号:CCTCC NO:M2011050，分类命名: 棒杆菌GLHZB21（Corynebacterium sp.GLHZB21）。 

(3)剑麻废料中剑麻皂苷的提取： 

取步骤(2)制得的发酵液30毫升置于离心管中，4000-6000 转/分钟的转速离心20分钟，弃上清液，剩余部分加入到100毫升无菌水中稀释，稀释后的菌液中加入5-20克剑麻废料，在摇床上以200转/分钟的振荡速度发酵24小时后，取发酵液5毫升，以4000-6000 转/分钟的转速离心15分钟，取上清液，在真空干燥箱中去水烘干，即提取到剑麻皂苷。 

通过吸光实验，加入菌体的料液比未加入菌体的料液在450nm的吸光值大概可以增加30%左右，说明剑麻皂苷产率提高。 

本发明利用微生物发酵可以明显提高皂苷产率，与现有的方法相比，该微生物具有安全环保、成本低、降解速度快、降解率高等特点，因此该内容可以 用于传统的皂苷工业生产中的化学提取工艺方法。 

附图说明

图1为在目镜和物镜分别为10倍和100倍下观察到的本发明微生物的形态照片。 

图2为本发明微生物菌落照片。 

具体实施方式

实施例： 

(1)制备培养基： 

a.称取去皮土豆200克，并将土豆切成方块，加1升水后加热煮沸30分钟，之后冷却至室温，用四层纱布过滤，所得滤液定容至1升，备用。 

b.取步骤(1)第a步所制得的备用滤液0.1升置于250毫升的三角瓶中，再向三角瓶内加入1.5克的琼脂粉，用牛皮纸包扎三角瓶口，在1.103MPa、121℃条件下灭菌20分钟，然后将三角瓶内产物迅速地倒入直径为9厘米的培养皿内，加盖，待琼脂凝固后，即制得固体培养基，备用。 

c.将步骤(1)第a步所制得的备用滤液中剩余的滤液0.9升移至1.5升容器内，用牛皮纸包扎瓶口，在1.103MPa、121℃的条件下灭菌20分钟，制得液体发酵培养基，备用。 

(2)目的菌株的平面培养和发酵培养： 

在无菌条件下，将斜面保存的目的菌株涂布在步骤(1)第b步制得的固体培养基上，30℃下培养36小时，然后取出菌株，接种到200毫升步骤(1)第c步制得的液体发酵培养基中，在30℃下以200转/分钟的速度摇床振荡发酵培养72小时，制得发酵液；所述目的菌株微生物现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期:2011年2月25日，保藏编号:CCTCC NO:M2011050，分类命名: 棒杆菌GLHZB21(Corynebacterium sp.GLHZB21)。 

(3)剑麻废料中剑麻皂苷的提取： 

取步骤(2)制得的发酵液30毫升置于离心管中，4500转/分钟的转速离心20分钟，弃上清液，剩余部分加入到100毫升无菌水中稀释，稀释后的菌液中加入10克剑麻废料，在摇床上以200转/分钟的振荡速度发酵24小时后，取发酵液5毫升，以4500 转/分钟的转速离心15分钟，取上清液，在真空干燥箱中去水烘干，即提取到剑麻皂苷。 

该微生物发酵方法处理剑麻残渣与传统酸碱化学方法相比，产率提高 30.1%。