一种肌细胞生成素(MyoG)基因的增强子

摘要

一种肌细胞生成素（MyoG）基因的增强子，属于遗传工程技术领域，由调控元件E-box、SRE、KLF3、E-box、Sp1、E-box、Sp1、TEF-1组成，其特征在于MyoG基因增强子调控元件顺序为：E-box、SRE、KLF3、E-box、Sp1、E-box、Sp1、TEF-1；MyoG基因增强子“SE”的核酸序列如SeqIDNo:1所示，长度为147bp。在成肌细胞增殖和分化阶段均能促进MyoG基因表达的人工合成的增强子序列，且能够显著提高MyoG基因的表达活性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种肌细胞生成素（MyoG是myogenin的缩写）基因的增强子，属于遗传工程技术领域。 

背景技术

真核生物基因组中含有基因调节表达的转录调控元件。如启动子、增强子和沉默子等。核心启动子及增强子，以及转录因子与启动子复合物对基因表达的调控具有十分重要的作用。实际上除了核心启动子元件，其他启动子区域的调控元件在细胞特异性基因转录过程中亦具有十分重要的作用。因此，对于肌肉特异性启动子调控元件的研究具有重要研究价值。其中增强子能够增强启动子转录活性。主要位于启动子上游，可远离转录起始点（1～50kb）。也可位于基因内部和下游序列。如很多基因的内含子就是重要的增强子。多数哺乳动物基因启动子和增强子都有组织特异性，但强弱有别。特异性主要由增强子决定。增强子通过与基因调节蛋白（特定转录因子）结合来调节基因的表达。但每一种细胞中基因调节蛋白的种类和数量是不一样的。这就决定了细胞的特异性。目前对于乳腺特异性启动子研究很多，例如羊β-酪蛋白基因启动子特异性很强，仅在乳腺上皮细胞表达，而对于肌肉分化过程中相关基因特异性启动子和增强子的研究较少被关注。 

增强子(enhancer)指增加同它连锁的基因转录频率的DNA序列。增强子是通过启动子来增加转录的。有效的增强子可以位于基因的5′ 端，也可位于基因的3′ 端，有的还可位于基因的内含子中。增强子的效应很明显，一般能使基因转录频率增加10～200倍，有的甚至可以高达上千倍。例如，人珠蛋白基因的表达水平在巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)增强子作用下可提高600～1 000倍。增强子的作用同增强子的取向(5′ -3′ 或3′ -5′)无关，甚至远离靶基因达几千kb也仍有增强作用。 

增强子的发现：1981年Benerji在SV40DNA中发现一个140bp的序列，它能大大提高SV40DNA/兔β—血红蛋白融合基因的表达水平，这是发现的第一个增强子。它位于SV40早期基因的上游，由两个正向重复序列组成，每个长72 bp。目前发现的增强子多半是重复序列，一般长50bp，通常有一个8-12bp组成的“核心”序列，如SV40增强子的核心序列是5′ -GGTGTGGAAAG-3′。 

增强子的分类：增强子可分为细胞专一性增强子和诱导性增强子两类：①组织和细胞专一性增强子。许多增强子的增强效应有很高的组织细胞专一性，只有在特定的转录因子(蛋白质)参与下，才能发挥其功能。②诱导性增强子。这种增强子的活性通常要有特定的启动子参与。例如，金属硫蛋白基因可以在多种组织细胞中转录，又可受类固醇激素、锌、镉和生长因子等的诱导而提高转录水平。增强子能大大增强启动子的活性。增强子有别于启动子处有两点:[1]增强子对于启动子的位置不固定，而能有很大的变动;[2]它能在两个方向产生相互作用。一个增强子并不限于促进某一特殊启动子的转录，它能刺激在它附近的任一启动子。首先被发现的增强子是SV40增强子。两个增强子位于基因组的两个串连的72nbp重复中，约在转录起始点上游200bp处，每个72bp重复中有一个。缺失实验显示两个重复缺失一个并不产生什么影响，而如两个均缺失即将大大降低活体内的转录。有人发现，如果将β珠蛋白基因放在含有72bp重复的DNA分子中，它的转录作用在活体内将增高约200倍以上，甚至当此72bp顺序位于离转录起点上游1400bp或下游3000bp时仍有作用。各个基因中的增强子顺序差别较大，但有一个基本的核心顺序(core sequence)：AAAGGTGTGGGTTTGG 。 

增强子的特点作用：增强子具有组织特异性，例如免疫球蛋白基因的增强子只有在B淋巴胞内，活性才最高。除此以外，在胰岛素基因和胰凝乳蛋白酶基因的增强子中都发现了有很强的组织特异性。此外，所有的增强子中均有一段由交替的嘧啶-嘌呤残基组成的DNA，这种DNA极易形成Z-DNA型；故有人认为在形成一小段Z-DNA后，增强子才有功能。在酵母中有类似增强子的顺序，称为上游激活顺序(UAS)。UAS能向两个方向起作用。并位于启动子上游的任何距离处，但在启动子下游则无作用(有别于一般的增强子)。小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)DNA的转录可受糖类固醇激素的刺激。这个能受激素影响的顺序位于转录起点上游约100bp处。此顺序能和激素及其蛋白受体组成的复合物相结合。当将此顺序放在某基因的启动子的任一方面(即上游或下游)和各种不同的距离时，它仍能刺激该基因的转录。所以增强子激活作用可能是糖类固醇能调控一组靶基因的机制:糖类固醇激素进入细胞后即与其受体结合。结合作用激活受体，使其能识别存在于增强子中的共同顺序，进而激活了在增强子附近能对糖类固醇起反应的基因。即当糖类固醇-受体复合物和增强子结合时，其附近的启动子即起始转录。 

骨骼肌特异性启动子在肌肉细胞不同的分化阶段，其作用是不同的。成体骨骼肌特异性启动子与早期胚胎的肌肉形成、外周肌肉卫星细胞增殖和分化时所需骨骼肌特异性启动子有明显不同。研究表明，MyoG基因是骨骼肌发育过程中的重要正向调控因子，在肌肉分化调节基因中具有重要地位，其遗传变异被认为与肌纤维数量、生长速度相关，并最终导致产肉量的增加。MyoG基因可调控中胚层细胞分化为成肌细胞，再由单核成肌细胞融合为多核的肌纤维。因此MyoG基因的启动子被认为在肌肉分化形成肌管时活性很高，而在成肌细胞和成体肌肉细胞中活性很弱。如何通过对启动子调控元件进行分析及功能预测，设计筛选具有高效性和肌肉特异性的MyoG基因的增强子序列，提高MyoG基因的启动子在成肌细胞和成体肌肉细胞中活性成为急需解决的一大难题。所以发明一种能够增强MyoG基因的启动子活性的肌细胞生成素（MyoG）基因的增强子是必要的。 

发明内容

为了克服MyoG基因的启动子在肌肉分化形成肌管时活性很高，而在成肌细胞和成体肌肉细胞中活性很弱的难题，本发明提供了一种肌细胞生成素（MyoG）基因的增强子，该一种肌细胞生成素（MyoG）基因的增强子是为增强MyoG基因的启动子活性，利用公知的实验方法，首先克隆牛MyoG基因的天然启动子，采用启动子缺失片段活性分析法，确定一个合适大小和活性的核心启动子片段，并通过双荧光素酶活性测定试剂盒检测启动子缺失片段活性。然后通过对启动子调控元件进行分析及功能预测，然后通过设计筛选具有高效性和肌肉特异性的MyoG基因的增强子序列，并连接在MyoG基因核心启动子片段的上游，其能够有效的调控牛MyoG基因在肌肉细胞早期分化过程中在时间和空间上的精确表达，能够显著提高MyoG基因在成肌细胞中的表达活性，从而达到增强MyoG基因的启动子活性，增强MyoG基因的启动子在成肌细胞和成体肌肉细胞中活性的目的。 

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 

一种肌细胞生成素（MyoG）基因的增强子的技术方案包括以下步骤：

① 日本和牛MyoG基因的启动子的克隆与测序。首先通过PCR法获得日本和牛MyoG基因序列，并连接于pGL3-Basic（荧光素酶报告基因质粒）表达载体上，命名为pGL3-MyoG，并克隆MyoG基因5′端调控区长度为2125bp的核酸序列，采用启动子缺失片段活性分析的方法获得1个长度为373bp，且具有较高肌肉特异性启动子活性的较为理想的缺失片段即pGL3-MyoGpro373（通过之前的实验确立的，发明人实验室已经存在的一种载体）。对该启动子片段进行生物信息学分析，即采用转录因子预测软件对其进行转录因子结合位点的预测。

② 根据生物信息学的分析结果，对MyoG启动子进行缺失片段的克隆及测序，从而获得一些不同长度和位置的启动子片段，同时构建不同启动子缺失片段的表达载体。根据初步对MyoG天然启动子序列的生物信息学分析及其启动子调控元件的顺序，以及目前已经研究发现在牛肌肉细胞中一些肌肉特异性基因启动子调控元件的核心序列，本发明人工设计并合成一种肌肉特异性增强子序列，将其连接于pGL3-MyoGpro373表达载体的373片段之前，通过提高MyoG基因启动子活性以实现对MyoG基因在肌肉细胞早期分化过程中的表达调控。增强子序列所包含的基因表达调控元件及其顺序为E-box、SRE、KLF3、E-box、Sp1、E-box、Sp1、TEF-1，其核酸序列信息如下所示：5′ caacacCCAAATATGGctcgagccacCCGCCCaggtagagcc 

gCAGGTGtagccacCCGCCCaggtagagccgCAGGTGtagccagggggcTCAGGTTtctgtgatcgcgCTAAAAATAACTaaccgcgagcgaCATTCTTgcgggg-3′（Seq ID No:1），147个碱基长度，（人工合成增强子的合成由南京金斯瑞生物科技及公司完成并克隆到表达载体pUC57上），将其命名为SE，从而能够将该人工合成的增强子片段通过双酶切与pGL3-MyoGpro373表达载体相连接。

真核表达载体pGL3-SE-MyoGpro的构建：首先，提取质粒pUC57-SE和pEGFP-C1，分别进行EcoRI和HindIII双酶切， 37℃，酶切4h完成后，1%的琼脂糖凝胶电泳检测结果，回收大小约为147bp的人工合成增强子（SE）序列和载体大片段，将人工合成增强子（SE）序列与载体pEGFP-C1连接，轻轻混匀，瞬时离心，16℃恒温过夜反应，连接完成后，20μL产物全部转化DH5α感受态细胞，以卡那霉素筛选阳性克隆，提取质粒，EcoRI和HindIII双酶切鉴定阳性重组质粒，鉴定正确的阳性克隆分别命名为SE-pEGFP-C1。其次，小量质粒提取SE-pEGFP-C1和pGL3-MyoGpro，分别用kpnI、BglII双酶切， 37℃，酶切4h反应完成后，1%的琼脂糖凝胶电泳检测结果，回收大小约为147bp的人工合成增强子（SE）序列和载体大片段，将人工合成增强子（SE）片段与载体pGL3-MyoGpro连接，轻轻混匀，瞬时离心，16℃恒温过夜反应，连接完成后，20μL产物全部转化DH5α感受态细胞，以氨苄青霉素筛选阳性克隆，提取质粒，KpnI和BglII双酶切鉴定阳性重组质粒，鉴定正确的阳性克隆分别命名为pGL3-SE-MyoGpro。 

③ 将不同启动子缺失片段分别进行牛成纤维细胞和小鼠C2C12细胞的转染实验和双荧光素酶报告基因的检测，比较不同缺失片段的启动子活性。在转染实验中，一般采用对宿主细胞转染实验方法进行启动子活性分析，从而最终获得调控牛MyoG基因转录的高效、特异性表达。而通过双荧光素酶活性测定发现，人工合成肌肉增强子使MyoG启动子活性提高约2倍。例如在小鼠C2C12细胞和牛成纤维细胞培养过程中，当培养细胞的生长密度到达80%-90%左右时，弃去培养液，用无钙镁离子的PBS冲洗三遍，加入0.5ml的0.25%胰蛋白酶消化，37℃放置1-2min。显微镜下80%细胞变圆时，加入5.5ml含DMEM细胞培养液+15%标准胎牛血清的细胞生长培养液终止消化，按1：2比例进行传代。结果表明人工合成肌肉增强子能使MyoG启动子活性在成肌细胞增殖和分化阶段都能提高。 

④ 对活性较高的启动子缺失片段进行点突变分析，结合细胞转染实验进一步确立其内部启动子调控元件。细胞转染。转染质粒用无内毒素质粒提取试剂盒提取。质粒转染试剂为聚乙烯亚胺（PEI）。转染前24h将细胞以4-8×10⁵cells/well的密度铺与24孔板内。待细胞完全贴壁生长至80%～90%融合时，按照PEI转染操作步骤将不同表达载体和海肾基因内参质粒phRL-TK以50:1（质量比）的比例分别共转染小鼠C2C12细胞和牛成纤维细胞，pGL3-Basic空载体和phRL-TK以同样的条件作为阴性对照组共转染细胞，转染4h后，换成分化培养液（2%马血清+98%DMEM细胞培养液），转染72h后收集细胞。 

⑤ 通过不同的研究方案，选取一系列高效、特异性的肌肉特异性启动子调控元件，进行牛MyoG人工合成启动子片段的构建。在本发明的实验验证中，分别将人工启动子片段与MyoG天然启动子的缺失片段进行连接，并进行牛成纤维细胞和小鼠C2C12细胞的转染实验和双荧光素酶报告基因的检测，从而获得高效、特异性的牛MyoG基因的启动子序列。双荧光素酶报告基因检测，是采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒（Promega）来测定报告基因的表达水平。实验步骤简述如下：弃去24孔板中的细胞培养液，用PBS洗涤细胞2次，加入100ul细胞裂解液（1×PLB），室温放置15min后，收集细胞裂解液。取20ul细胞裂解液至荧光测定管中，加入100ul检测试剂（firefly luciferase。LARII），混匀后用化学发光仪（FB 12 Luminometer）测定发光值，记录10s时的值，最后加入100ul的Stop&GLO试剂，测定作为内标的Renilla荧光素酶发光值，同时检测10s时的值，两者比值即为荧光素酶的相对活性RLA（Relative Luciferase Activity）。RLA的数值为3次重复实验结果平均值±标准差。具体操作步骤参见Promega检测试剂盒说明书。 

本发明的有益效果为：本发明涉及一种肌细胞生成素（MyoG）基因的增强子。本发明的特征为在成肌细胞增殖和分化阶段均能促进MyoG基因表达的人工合成的增强子序列，且能够显著提高MyoG基因的表达活性。通过设计筛选具有高效性和肌肉特异性的人工合成启动子，从而有效的调控牛MyoG基因在肌肉细胞早期分化过程中在时间和空间上的精确表达。这对于验证MyoG基因在肌肉分化过程及调控肌纤维生成的作用机理及调控MyoG基因用于高产转基因肉牛的生产方面具有十分重要的理论意义和应用价值。一种肌细胞生成素（MyoG）基因的增强子制作简单，功能多样，可操作性强，效果明显。 

附图说明    

下面结合附图对本发明进一步说明。

图1是真核表达载体pGL3-SE-MyoGpro的构建过程图。将人工合成的增强子片段分别连接到MyoG启动子之前，并构建相应的真核表达载体。 

图2 是人工合成增强子SE的调控元件组成顺序及核酸序列（长度为147bp）。 

图3是 小鼠C2C12细胞转染结果图。通过对比转染小鼠C2C12细胞后各表达载体的相对表达量可以发现，SE人工增强子序列均具有一定提高转录活性的作用，可提高110%左右。 

图4 是牛成纤维细胞转染结果图。通过转染牛成纤维细胞，并检测转染后各表达载体的相对表达量，可以发现除阳性对照CMV外其余各表达载体均几乎不表达，说明人工合成增强子序列SE并不改变MyoG基因启动子的肌肉特异性。 

具体实施方式

在本说明书的上下文中，除非特别指明否则本说明书所用的任何术语具有本领域技术人员在本领域中通常理解的含义，而未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。 

实施例1 pGL3-MyoGpro373的获得 

本发明首先通过PCR法获得MyoG基因5′端调控区长度为2125bp的核酸序列，采用启动子缺失片段活性分析的方法获得1个长度为373bp，且具有较高肌肉特异性启动子活性的较为理想的缺失片段即pGL3-MyoGpro373（通过之前的实验确立的，实验室已经存在的一种载体）。

Tissue DNA Kit提取基因组DNA 步骤如下： 

1. 弃去培养液，用4mlPBS洗涤细胞3次，然后用500μl胰蛋白酶消化细胞，将细胞转移到离心管中，1000rpm室温离心5min，彻底去上清；

2. 加入25ulOB蛋白酶,混匀，于65℃水浴处理5min，让细胞完全裂解；

3. 加入220ulBuffer BL,涡旋混匀，于70℃处理10min；

4. 加入220ul无水乙醇涡旋混匀；

5. 将第4步得到的所有溶解液转入柱子中（包括所有的沉淀物），12000rpm离心1min以结合DNA，弃去滤过液和收集管；

6. 加入500ulHB Buffer，12000rpm离心1min，弃去滤过液和收集管；

7. 加入700ulDNA Wash Buffer，12000rpm离心1min，弃去滤过液；

8. 重复步骤7；

9. 12000rpm离心空心2min，以干燥柱子；

10. 将柱子置于1.5mlEP管，加入50~200ul70℃预热的DNA Elution Buffer，室温静置3min，15000rpm离心1min，以洗脱DNA。

PCR反应条件：94℃        5min                                

参照《分子克隆实验指南》方法，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检查。

（1）用1×TAE缓冲液配制0.8%琼脂糖凝胶，琼脂糖加热溶化后加入溴化乙锭EB制成电泳凝胶板待用。 

（2）取扩增产物加 6×Loading Buffer（上样缓冲液）混匀，加入上样孔，同时以标准DNA分子质量（DL-2000 / DL-15000 Marker）作为对照，100V/cm恒流电泳15min，紫外凝胶成像系统观察并留取照片分析结果。 

 PCR产物的胶回收纯化：从琼脂糖凝胶中回收DNA片段采用北京TransGen公司胶回收试剂盒进行，具体方法如下： 

(1)将含目的片段条带的琼脂糖块割下，放入1.5mL的离心管中。

(2)按每100mg琼脂糖加入300μL的溶胶液，置于55℃水浴10min，使琼脂糖完全溶化，每2min颠倒混匀一次。将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱装住，室温静置1-2min，12000rpm离心30s，将收集管中废液去掉。 

   (3)700μL漂洗液漂洗，10000rpm离心30s倒掉废液，重复一次再倒掉废液，10000rpm下离心30s。 

(4)将吸附柱放到新的1.5mL离心管中，在吸附柱中央加入洗脱缓冲液H₂O 30 μL-50μL，室温放置1-2min，10000rpm离心1min。1.5mL离心管中的DNA储存于-20℃中。 

质粒的双酶切 

 Double digestion of the plasmid

酶切反应条件为：37℃水浴，3h。酶切反应完成后，0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

 重组质粒pGL3-MyoG的连接反应 

 pGL3-MyoG plasmid combined by T4 DNA Ligase

连接条件：16℃过夜。

连接完成后，20μL产物全部转化DH5α感受态细胞，涂布LB固体培养基，37℃倒置培养过夜。挑单克隆菌体提取质粒，BglII和HindIII双酶切鉴定阳性重组质粒。 

转化过程： 

（1）将感受态细胞从冰箱中取出，置冰上，待其融化。

（2）取15μL DNA连接产物加入100μL感受态细胞中，轻轻混合后，冰浴30min。 

（3）42℃热休克90s，然后迅速置于冰上冷却2min。 

（4）将感受态细胞全部加入到装有600μL LB的1.5 mL管中，37℃摇菌培养1h，使宿主菌复苏并表达抗性基因。 

（5）离心10000rpm 1min弃上清，将剩余的菌液吹打垂悬并涂布于含有相应氨卞抗生素的LB琼脂培养基，20 mL LB培养基中应放20μL 氨卞抗生素。37℃倒置培养12~16h，待菌落长出后，随机挑选单个菌落做进一步培养鉴定。 

实施例2 增强子片段“SE”的人工合成与表达载体的构建 

根据初步对MyoG天然启动子序列的生物信息学分析及其启动子调控元件的顺序以及目前已经研究发现在牛肌肉细胞中一些肌肉特异性基因启动子调控元件的核心序列，本发明人工设计并合成一种肌肉特异性增强子序列，将其连接于pGL3-MyoGpro373表达载体的373片段之前，通过提高MyoG基因启动子活性以实现对MyoG基因在肌肉细胞早期分化过程中的表达调控（见图1）。增强子序列所包含的基因表达调控元件及其顺序为E-box（Seq ID No:2）、SRE（Seq ID No:3）、KLF3（Seq ID No:4）、E-box（Seq ID No:5）、Sp1（Seq ID No:6）、E-box（Seq ID No:7）、Sp1（Seq ID No:8）、TEF-1（Seq ID No:9），其核酸序列信息如下所示：5`caacacCCAAATATGGctcgagccacCCGCCCaggtagagccgCAGGTGtagccacCCGCCCaggtagagccgCAGGTGtagccagggggcTCAGGTTtctgtgatcgcgCTAAAAATAACTaaccgcgagcgaCATTCTTgcgggg-3′（Seq ID No:1），147个碱基长度（人工合成增强子的合成由南京金斯瑞生物科技及公司完成并克隆到表达载体pUC57上），将其命名为SE（图2），从而能够将该人工合成的增强子片段通过双酶切与pGL3-MyoGpro373表达载体相连接。

真核表达载体pGL3-SE-MyoGpro的构建：真核表达载体pGL3-SE-MyoGpro的构建过程为，小量质粒提取pUC57-SE和pEGFP-C1，分别进行EcoRI和HindIII双酶切，反应体系见下表： 

 质粒的双酶切

  

37℃，酶切4h完成后，1%的琼脂糖凝胶电泳检测结果，回收大小约为147bp的人工合成增强子（SE）序列和载体大片段，将人工合成增强子（SE）序列与载体pEGFP-C1连接，反应体系如表。

 重组质粒SE-pEGFP-C1的连接反应 

 

轻轻混匀，瞬时离心，16℃恒温过夜反应，连接完成后，20μL产物全部转化DH5α感受态细胞，以卡那霉素筛选阳性克隆，提取质粒，EcoRI和HindIII双酶切鉴定阳性重组质粒，鉴定正确的阳性克隆分别命名为SE-pEGFP-C1。

小量质粒提取SE-pEGFP-C1和pGL3-MyoGpro，分别用kpnI、BglII双酶切，反应体系见下表 

质粒的双酶切

37℃，酶切4h反应完成后，1%的琼脂糖凝胶电泳检测结果，回收大小约为147bp的人工合成增强子（SE）序列和载体大片段，将人工合成增强子（SE）片段与载体pGL3-MyoGpro连接，反应体系如下表。

重组质粒pGL3-SE-MyoGpro的连接反应 

人工合成增强子（SE）9μLT4 DNA Ligase Buffer2μLT4 DNA Ligase1μLpGL3-MyoGpro3μL双蒸水H₂O5μL

轻轻混匀，瞬时离心，16℃恒温过夜反应，连接完成后，20μL产物全部转化DH5α感受态细胞，以氨苄青霉素筛选阳性克隆，提取质粒，KpnI和BglII双酶切鉴定阳性重组质粒，鉴定正确的阳性克隆分别命名为pGL3-SE-MyoGpro。（琼脂糖凝胶电泳检查、回收纯化、酶切、连接过程与①中相同）

实施例3 MyoG启动子活性的分析

采用对宿主细胞转染实验方法进行启动子活性分析，从而最终获得调控牛MyoG基因转录的高效、特异性表达。通过双荧光素酶活性测定发现，人工合成肌肉增强子使MyoG启动子活性提高约2倍。进一步研究发现人工合成肌肉增强子能使MyoG启动子活性在成肌细胞增殖和分化阶段都能提高（图3和图4）。

小鼠C2C12细胞和牛成纤维细胞培养。当培养细胞的生长密度到达80%-90%左右时，弃去培养液，用无钙镁离子的PBS冲洗三遍，加入0.5ml的0.25%胰蛋白酶消化，37℃放置1-2min。显微镜下80%细胞变圆时，加入5.5ml含DMEM细胞培养液+15%标准胎牛血清的细胞生长培养液终止消化，按1：2比例进行传代。 

细胞转染。转染质粒用无内毒素质粒提取试剂盒提取。质粒转染试剂为聚乙烯亚胺（PEI）。转染前24h将细胞以4-8×10⁵cells/well的密度铺与24孔板内。待细胞完全贴壁生长至80%～90%融合时，按照PEI转染操作步骤将不同表达载体和海肾基因内参质粒phRL-TK以50:1（质量比）的比例分别共转染小鼠C2C12细胞和牛成纤维细胞，pGL3-Basic空载体和phRL-TK以同样的条件作为阴性对照组共转染细胞，转染4h后，换成分化培养液（2%马血清+98%DMEM细胞培养液），转染72h后收集细胞。 

双荧光素酶报告基因检测。采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒（Promega）测定报告基因的表达水平。实验步骤简述如下：弃去24孔板中的细胞培养液，用PBS洗涤细胞2次，加入100ul细胞裂解液（1×PLB），室温放置15min后，收集细胞裂解液。取20ul细胞裂解液至荧光测定管中，加入100ul检测试剂（firefly luciferase。LARII），混匀后用化学发光仪（FB 12 Luminometer）测定发光值，记录10s时的值，最后加入100ul的Stop&GLO试剂，测定作为内标的Renilla荧光素酶发光值，同时检测10s时的值，两者比值即为荧光素酶的相对活性RLA（Relative Luciferase Activity）。RLA的数值为3次重复实验结果平均值±标准差。具体操作步骤参见Promega检测试剂盒说明书。 

1×PLB的制备：根据所需用量计算，将1倍体积的5×PLB加到4倍体积的蒸馏水中，混合均匀，4℃保存。该溶液在每次使用前配制新鲜的。 

LARⅡ：用荧光检测缓冲液（Luciferase Assay Buffer Ⅱ）溶解冻干粉，混合均匀后在-20℃可存一个月，在-70℃可存一年。 

Stop & Glo?试剂：取适量的50×Stop & Glo? Substrate加入到所需要量的Stop & Glo? Buffer中，使终浓度成为1倍浓度。 

样品制备 

    弃去24孔板中的细胞培养液，加入1×PBS清洗培养细胞，洗涤2次。去掉清洗液，加入100μl新鲜配制裂解液（1×PLB）。室温放置15min，收集细胞裂解液于离心管中。12 000 r/min离心5min，取20μL上清液于干净的离心管中，样品保存于-20℃。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书其等效物界定。 

<110> 东北农业大学

<120>一种肌细胞生成素（MyoG）基因的增强子

<160>10

<210>1

<211>147

<212>DNA   

<213> 人工序列

<400>1

caacacCCAA ATATGGctcg agccacCCGC CCaggtagag ccgCAGGTGt agccacCCGC        60

CCaggtagag ccgCAGGTGt agccaggggg cTCAGGTTtc tgtgatcgcg CTAAAAATAA        120

CTaaccgcga gcgaCATTCT Tgcgggg                                              147

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gagccgCAGGTGtagcca                                                        18

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

caacacCCAA ATATGGctcg ag                                                   22

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

cagccaatca caCAGCCcag gcccc                                                  25

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gagccgCAGGTGtagcca                                                         18

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

agccacCCGC CCaggtag                                                         18

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

gagccgCAGGTGtagcca                                                         18

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

agccacCCGC CCaggtag                                                         18

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

gagcgaCATT CTTgcgggg                                                        19

<210>10

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ATTGAAAGGA GCAGATGAGG                                                 10

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

TCAGAAGAGA CTTGTTCCTG CCACC                                          15