RING1蛋白在提高植物对水稻矮缩病毒抗性中的应用

摘要

本发明公开了RING1蛋白在提高植物对水稻矮缩病毒抗性中的应用。本发明提供了蛋白RING1或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体在调控植物抗水稻矮缩病中的应用；所述蛋白RING1的氨基酸序列为序列表中的序列1。本发明的实验证明，本发明发现RING1是一种E3蛋白-泛素连接酶，它能够与RDV外壳蛋白P2相互作用，促使P2被26S蛋白酶体降解，且在水稻中过量表达RING1蛋白，可以降低P2的累积量，从而抑制病毒的扩增，提高水稻的抗病毒能力。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及RING1蛋白在提高植物对水稻矮缩病毒抗性 中的应用。

背景技术

水稻矮缩病毒（Rice Dwarf Virus，RDV）是呼肠孤病毒科（Reoviridae）植物呼 肠孤病毒属（Phytoreovirus）的成员。RDV是引起水稻矮缩病的病原，可以感染水稻， 造成水稻严重减产。RDV的传播需借助于昆虫介体叶蝉。RDV为双链RNA病毒，其基因 组为十二条双链RNA。根据这十二条双链RNA在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率由慢 到快，分别命名为S1到S12。RDV基因组编码至少七种结构蛋白，包括P1、P2、P3、 P5、P7、P8、P9；五种非结构蛋白，包括Pns4、Pns6、Pns10、Pns11、Pns12。

P2是RDV的外壳蛋白，由S2编码，它能够与水稻内根-贝壳杉烯氧化酶及其类似 蛋白相互作用，引起水稻赤霉素含量的降低，是造成水稻矮缩症状的原因之一（Zhu et  al.,2005.The Rice Dwarf Virus P2Protein interacts with ent-Kaurene Oxidases  in vivo,leading to reduced biosynthesis of Gibberellins and rice dwarf  symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945.）。另外，P2在RDV的昆虫介体叶蝉 细胞中，能够引起细胞膜的融合，说明该蛋白在RDV侵染叶蝉过程中发挥作用（Zhou et  al.,2007，The P2capsid protein of the nonenveloped rice dwarf phytoreovirus  induces membrane fusion in insect host cells.Proceedings of the National  Academy of Sciences of USA.104(49):19547-19552.）。

酵母双杂交是研究蛋白-蛋白相互作用的重要技术，通过研究蛋白之间的相互作 用，可以深入了解蛋白在生物体内的功能。

泛素是一种广泛存在于真核生物中的小分子蛋白。它由76个氨基酸残基组成，在 各个物种中是高度保守的。在蛋白的泛素化过程中，泛素C末端的甘氨酸在多种酶的催 化作用下与底物中特定氨基酸残基（大部分情况为赖氨酸残基）共价相连，通常有多 个泛素分子被依次连接在底物蛋白的特定位点上。如果后续的泛素分子被连接到前一 个泛素分子的48位赖氨酸上，那么，被修饰的底物蛋白将被26S蛋白酶体识别并降解， 释放出游离的泛素分子参与新的反应。

通常情况下，蛋白的泛素化修饰需要三个步骤。首先，泛素与泛素活化酶 （ubiquitin-activating enzyme，E1）通过硫酯键相连，形成活性状态。然后，活 化的泛素被传递给泛素连接酶（ubiquitin-conjugating enzyme，E2），两者也是通 过硫酯键相连。最后，由蛋白-泛素连接酶（ubiquitin ligase enzyme，E3）识别并 结合底物蛋白，催化E2上的泛素转移到底物上。该过程重复发生，底物蛋白就被加上 了多个泛素分子的长链。

E3是底物特异性的决定因子。生物体内E3数量庞大，可以分为很多不同的类型。 以拟南芥为例，根据E3分子中亚基的组成和其作用方式的不同，可将其分为以下几种 类型：含有RING（Really Interesting New Gene）finger的E3、含有HECT（Homology  to E6-Associated Carboxy-Terminus）Domain的E3、含有U-box的E3、CRLs （Cullin–RING Ligases）。其中CRLs又可分为四种不同的类型：SCF（the S phase  kinase-associated protein1(SKP1)–cullin1(CUL1)–F-box complex）、BTB（the  bric-a-brac–tramtrack–broad complex）、DDB（the DNA damage-binding Complex） 和APC（the anaphase-promoting complex）。

真核生物大部分的蛋白降解事件都是由泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-26S  Proteasome System，以下简称为UPS）控制的，UPS介导的蛋白降解对于植物应对外界 生物和非生物刺激有非常重要的意义，使得植物能在恶劣的环境下存活下来（Dreher  and Callis,2007)。不仅如此，UPS还能选择性地清除合成过程中出错的蛋白，避免 这些蛋白对生物体造成危害。

蛋白的泛素化降解途径在植物对抗病原微生物过程中也发挥着重要的作用。植物 生长过程中不可避免的会遭遇病毒、细菌、真菌、线虫、昆虫等生物的危害，但是植 物受到这些有害物种的侵害时并不都会产生病症，这是因为植物本身具有多种防御系 统来对抗这些外来侵害。近些年，越来越多的证据暗示，UPS在植物应对病原物的过程 中可能起着重要的作用。但是，蛋白的泛素化降解是特异性的，其特异性由与蛋白相 互作用的E3酶决定，相对于生物体中存在的数量庞大的E3酶，目前已知的E3酶与其底 物的对应关系仅有少量报道。有关RDV的在先研究从未提及该病毒与任何水稻E3酶的相 互作用，也没有报道表明任何水稻E3酶具有抗RDV作用。

发明内容

本发明的一个目的是提供蛋白RING1或其编码基因或含有所述编码基因的重组载 体的用途。

本发明提供的蛋白RING1或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体在调控植 物抗水稻矮缩病中的应用；

所述蛋白RING1的氨基酸序列为序列表中的序列1。

上述应用中，所述水稻矮缩病的病原为水稻矮缩病毒（Rice Dwarf Virus）。

上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，上述单子叶植物为水稻。

上述应用中，所述含有所述编码基因的重组载体为将蛋白RING1的编码基因插入 表达载体中得到的重组载体；在本发明的实施例中，重组载体pCambia1301-FlagRING1 制备方法按照实施例2的一的方法进行。

所述蛋白RING1的编码基因的核苷酸序列具体为序列表中的序列2。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将蛋白RING1的编码基因导入目的植物中， 得到转基因植物，所述转基因植物的水稻矮缩病抗性高于所述目的植物；

所述蛋白RING1的氨基酸序列为序列表中的序列1。

上述方法中，所述蛋白RING1的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列2。

上述方法中，所述水稻矮缩病的病原菌为水稻矮缩病毒（Rice Dwarf Virus）。

上述方法中，所述蛋白RING1的编码基因通过重组载体导入目的植物；

所述重组载体为将所述蛋白RING1的编码基因插入表达载体中得到的重组载体。 在本发明的实施例中，重组载体pCambia1301-FlagRING1制备方法按照实施例2的一 的方法进行。上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，上述单子叶植物为 水稻。

所述转基因植物的水稻矮缩病抗性高于所述目的植物具体体现在接RDV后，所述 转基因植物的感染的RDV病毒的植株数目少于所述目的植物；可通过鉴定是否含有RDV 病毒的目的基因（S2的部分片段）或者植株的感病特征来确定感染的RDV病毒的植株。

本发明的另一个目的是提供一种重组载体。

本发明提供的重组载体，为将蛋白RING1的编码基因插入表达载体中得到的重组 载体；

所述蛋白RING1的氨基酸序列为序列表中的序列1；

所述蛋白RING1的编码基因的核苷酸序列具体为序列表中的序列2。

在本发明的实施例中，重组载体pCambia1301-FlagRING1制备方法按照实施例2 的一的方法进行。

上述蛋白RING1在作为蛋白-泛素连接酶中的应用也是本发明保护的范围；

所述蛋白RING1的氨基酸序列为序列表中的序列1。

其中植物表达载体包括但不局限于pCambia1300、pCambia1301、pCambia3301、 pWM101等；水稻品种优选为对RDV敏感的品种如中花11、秀水11、日本晴、武3等；水 稻组织或细胞的转化方法可选自农杆菌介导法、基因枪法、电击法、花粉管导入法、 脂质体融合法以及其他任意可将质粒导入的方法。

本领域的技术人员懂得，通过置换、取代、附加或缺失蛋白序列中的一个或多个 氨基酸，可对其进行修饰而不改变其功能。因此，本发明应该被理解为包括了对RING1 蛋白进行的上述修饰。

RING1基因的碱基序列不局限于序列表中序列2所示，还包括具有将RING1及带有上 述修饰的RING1蛋白中各氨基酸残基对应的任一密码子进行选择并组合的DNA序列。该 密码子的选择可以按照常规方法，也可以参考宿主的密码子偏好型。

本发明的实验证明，本发明发现RING1是一种E3蛋白-泛素连接酶，它能够与RDV外 壳蛋白P2相互作用，促使P2被26S蛋白酶体降解；在水稻中过量表达RING1蛋白，可以 降低P2的累积量，从而抑制病毒的扩增，提高水稻的抗病毒能力。

附图说明

图1为P2和RING1蛋白在酵母中相互作用的结果

图2为免疫共沉淀实验验证P2和RING1相互作用的结果

图3为体外实验证明RING1具有E3蛋白-泛素连接酶活性的结果

图4为P2和RING1在293T细胞中共表达的免疫印迹检测结果

图5为转RING1水稻的Western鉴定

图6为转RING1水稻和野生型水稻在RDV侵染后的RDV病毒相关基因的RT-PCR检测

图7为健康和感病（感染RDV）水稻症状图

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下将用实施例对本发明进行详细说明，但这些实施例并非对本发明的限制。

实施例1、RING1蛋白及其编码基因的获得

一、RING1蛋白及其编码基因的获得

水稻文库的构建所用试剂盒为HybriZAP-2.1Two-Hybrid Predigested Vector/ Gigapack Cloning Kit（Stratagene），文库构建及筛选方法根据说明书进行。所用诱 饵克隆pGBK-S2与专利号ZL200510114386.X所公布克隆相同。所用酵母菌株为AH109。 筛选得到的阳性克隆经测序和序列分析，确定其编码的蛋白片段具有序列表中序列1 所示的氨基酸序列的12-308个氨基酸，将该蛋白全长（即序列1对应蛋白）命名为RING1， 其编码基因为序列表中序列2所示的核苷酸，将其命名为RING1。

二、RING1全长序列的克隆及含有该片段的重组载体的获得

根据序列2设计引物，并在引物两端加上所需酶切位点，引物序列为 RING1-5'EcoRI：5’-GAATTCATGGATCTGGAGAGGTCG-3’，RING1-3'SalI： 5’-GTCGACTTACAAGAATGGCGGCATCC-3’。

依照说明书，用Invitrogen公司的TRIzol Reagent提取中花11水稻（Oryza sativa  L.japonica cv.Zhonghua11,许昱等《“中花11”水稻谷蛋白Gt1基因克隆及蜡质基 因启动子引导Gt1基因表达载体的构建》，上海师范大学学报（自然科学版），2010 年4月第39卷第2期，204页，公众可从北京大学获得）的总RNA，用该公司的SuperScript  II逆转录酶进行逆转录，得到cDNA。逆转录所用引物为16个核苷酸的Oligod（T）引 物。

以逆转录所得cDNA为模板，以上述基因特异性引物RING1-5'EcoRI和RING1-3'SalI 进行PCR（Polymerase Chain Reaction）反应，得到1287bp的PCR产物，该PCR产物具 有序列表中序列2所示的核苷酸。

回收PCR产物后用限制性内切酶EcoR I和Sal I进行酶切，回收1285bp带有粘性末 端的PCR产物；将载体pGADT7（Clontech公司，产品目录号：630442）用限制性内切酶 EcoR I和Sal I双酶切，回收7987bp载体骨架；将上述1285bp带有粘性末端的PCR产物 与7987bp载体骨架用T4连接酶连接，转化大肠杆菌菌株DH5α，得到转化子。提取转化 子的质粒送去测序，该质粒为将序列表中序列2所示的基因RING1插入载体pGADT7的 EcoR I和Sal I酶切位点间得到的载体，将该质粒命名为pGAD-RING1，即为重组载体。

实施例2、体外证明RING1蛋白与RDV P2的相互作用

一、酵母双杂交实验证明RING1与RDV P2的相互作用

将实施例1得到的重组载体pGAD-RING1与pGBK-S2（S2为RDV P2蛋白的编码基因， RDV P2蛋白的编码基因导入pGBK中得到的。记载该载体的非专利文献为Zhu et al., 2005.The Rice Dwarf Virus P2Protein interacts with ent-Kaurene Oxidases in  vivo,leading to reduced biosynthesis of Gibberellins and rice dwarf symptoms. Plant Physiology.139:1935-1945；公众可从北京大学获得）共转化酵母菌株AH109 （购自Clontech公司，产品目录号为630444），酵母转化方法采用公知的PEG/LiAc法； 转化后的酵母细胞涂布营养缺陷型平板SD/-Trp-Leu，30℃条件下培养2天。转化子划 线至SD/-Trp-Leu-His-Ade营养缺陷型平板，30℃培养4天，观察转化子的生长情况。 该实验同时设负对照pGADT7（产品目录号为：630442）和pGBK-S2、pGAD-RING1和pGBK （购自Clontech公司产品目录号为630443）。

结果如图1所示（A：pGAD-RING1和pGBK-S2；B：pGADT7和pGBK-S2；C：pGAD-RING1 和pGBK）。结果证明，RING1全长蛋白与RDV P2能在酵母中相互作用。

二、免疫共沉淀实验证明RING1与RDV P2的相互作用

1、pWM101-FLAGHPR1及pCambia1301-HAS2克隆的构建

以pGAD-RING1质粒为模板，以引物FLAGRING1-5'KpnI（序列为： 5’-GGTACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGATGGATCTGGAGAGGTCG-3’）和RING1-3'PstI （序列为：5’-CCTGCAGTTACAAGAATGGCGGCATC-3’）进行PCR扩增，得到1314bp的PCR 产物。

将PCR产物用Kpn I和Pst I双酶切，回收1312bp的酶切产物；pWM101质粒（参 见赵燕等《荠菜CRABS CLAW的克隆与拟南芥遗传转化》，《西北植物学报》2009年第11 期第2162页，公众可从北京大学获得）用Kpn I和Pst I双酶切，回收9923bp的载体 骨架；将1321bp的酶切产物和9923bp的载体骨架用T4DNA连接酶进行连接，得到重组 质粒pWM101-FLAGHPR1（含有序列2所示的RING1和FLAG标签）。

pCambia1301-HAS2（记载该载体的非专利文献为：Zhu et al.,2005.The Rice  Dwarf Virus P2Protein interacts with ent-Kaurene Oxidases in vivo,leading  to reduced biosynthesis of Gibberellins and rice dwarf symptoms.Plant  Physiology.139:1935-1945；公众可从北京大学获得），其为将HAS2（HAP2是在P2蛋 白上带了HA标签）构建入pCambia1301。

pWM101-FLAGRING1和pCambia1301-HAS2分别转化农杆菌EHA105，转化方法为公知 的电击转化方法，得到EHA105/pWM101-FLAGRING1和EHA105/pCambia1301-HAS2。

2、HAP2和FLAGRING1在烟草中的表达

分别挑取EHA105/pWM101-FLAGRING1和EHA105/pCambia1301-HAS2单菌落，接入 2ml LB液体培养基（含有Kanamycin100mg/L，Rifampicin50mg/L），28℃振荡培养 16hr（hr为小时hour的简写）。1:50转接入10ml LB液体培养基（含有Kanamycin 100mg/L，Rifampicin50mg/L），继续培养至OD₆₀₀约为0.8。4000rpm（rpm为每分钟转 速）离心5min（min为分钟）收菌。AS buffer（10mM MES，150μM AS，10mM MgCl₂） 重悬，调OD₆₀₀至1.0。

将两种菌液以1:1（体积）混合，通过压力注射方法注射烟草N.benthamiana(记载 该烟草的非专利文献为Zhu et al.,2005.The Rice Dwarf Virus P2Protein interacts  with ent-Kaurene Oxidases in vivo,leading to reduced biosynthesis of  Gibberellins and rice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945.公众 可从北京大学获得)并分别单独取两种菌悬液通过压力注射方法注射烟草作为负对照。 烟草继续生长3天后，将注射的叶片置于液氮中研磨成粉末。

3、免疫共沉淀实验

取约500mg上述叶片粉末加入1.5ml离心管中，加入1ml IP Buffer（150mM NaCl， 50mM Tris-Cl（pH7.5），0.1%NP-40，5mM DTT，每50ml加1片蛋白酶抑制剂（Protease  Inhibitor Cocktail Tablets,EDTA-free；Roche），混匀后4℃，12000rpm离心10min， 将上清吸出转移至新的离心管中。再次以上面条件离心5min，将上清吸出转移至新的 离心管中，防止吸到沉淀，得到烟草蛋白提取物。

在上述步骤中得到的烟草蛋白提取物中加入20μl protein G beads（GE  healthcare，17-0618-06），同时加入0.2μl FLAG抗体（Sigma，F3165），4℃温育 1.5hr。4℃，1000rpm离心1min，吸掉上清。用IP Buffer洗beads3次。加入50μl 3×protein sample buffer（125mM Tris-Cl（pH6.8），20%甘油，6%SDS，0.004%溴 酚蓝，30mM DTT），95℃加热5min，吸取上清进行SDS-PAGE。

SDS-PAGE及Western Blot依照公知方法及产品说明书进行。所用抗体为 anti-FLAG-HRP（sigma）和anti-HA-Peroxidase（Roche）。

结果如图2所示，表明用FLAG抗体能够将FLAGRING1和HAP2同时沉淀下来，说明这 两种蛋白之间相互作用。

三、RING1具有E3蛋白-泛素连接酶（E3Protein-Ubiquitine Ligase）活性

1、表达克隆构建及蛋白的表达

以pGAD-RING1质粒为模板，用RING1-5'EcoRI（序列为： 5’-GAATTCATGGATCTGGAGAGGTCG-3’和RING1-3'SalI（序列为： 5’-GTCGACTTACAAGAATGGCGGCATCC-3’）进行PCR扩增，得到1314bp的PCR产物。

1314bp的PCR产物以EcoR I和Sal I双酶切后，凝胶电泳回收1312bp的酶切产物； 将pMAL-p2x质粒（New England Biolabs，E8000S，本身表达MBP蛋白）EcoR I和Sal  I双酶切，凝胶电泳回收6703bp的载体骨架；将1312bp的酶切产物和6703bp的载体骨 架以T4DNA连接酶连接，得到重组载体pMAL-p2x-RING1，经过测序，该重组载体为将 序列表中序列2所示的DNA分子插入pMAL-p2x的EcoR I和Sal I酶切位点间得到的载体， 命名为pMAL-p2x-RING1。

将pMAL-p2x-RING1和pMAL-p2x质粒分别转化原核表达菌株Rosetta（DE3）：取 0.5μl质粒，加入50μl感受态细胞中，混匀后冰上静置30min；42℃热激90sec，加 入1ml新鲜LB培养基，37℃振荡培养1hr；3000rpm离心2min收集菌体，涂布LB平 板（含100mg/L Ampicillin），得到Rosetta（DE3）/pMAL-p2x-RING1（EcoR I和Sal  I双酶切鉴定，得到1312bp的酶切产物的为阳性）和Rosetta（DE3）/pMAL-p2x。

分别挑Rosetta（DE3）/pMAL-p2x-RING1和Rosetta（DE3）/pMAL-p2x单菌落接 于5ml LB培养基中（含100mg/L Ampicillin），37℃过夜培养。1:200转接于300ml LB 培养基中（含100mg/L Ampicillin）培养至OD600约为0.6。加入IPTG至终浓度1mM， 诱导表达4hr，得到Rosetta（DE3）/pMAL-p2x-RING1菌液和Rosetta（DE3）/pMAL-p2x 菌液。

2、体外泛素化实验检测E3活性

分别取100ml Rosetta（DE3）/pMAL-p2x-RING1菌液和Rosetta（DE3）/pMAL-p2x 菌液，5000rpm离心10min收集菌体。加入5ml破菌缓冲液（20mM Tris-Cl pH7.5， 100mM NaCl，0.1%NP-40，1mM DTT，0.01M PMSF），超声破碎。4℃，12000rpm,离心20min 取上清液，即得到Rosetta（DE3）/pMAL-p2x-RING1菌体蛋白（MBP-RING1）和Rosetta （DE3）/pMAL-p2x菌体蛋白（MBP）。

吸取40μl Amylose resin（NEB），用1ml破菌缓冲液洗，6000rpm，离心15sec， 吸去上清；重复洗一次。加入500μl破菌缓冲液，1μl Rosetta（DE3）/pMAL-p2x-RING1 菌体蛋白或Rosetta（DE3）/pMAL-p2x菌体蛋白，室温结合1.5hr(用静音混合器)，用 20mM Tris-Cl(pH7.5)洗涤4次，吸净液体，得到结合后Amylose resin。

在结合后Amylose resin中加入：

20×buffer1.5μl

E1（recombinant wheat(Triticum aestivum)E1(GI:136632)）3μl

E2（产品名称：Recombinant Human UBCh5b，出售公司：R&D，货号：E2-622-100） 3μl

His-Ub（UBQ14,At4g02890）6μl

加双蒸水至总体积为30μl。

30℃950rpm反应2.5hr。

加入15μl3×protein loading buffer，100℃加热5min，取上清进行SDS-PAGE。 用anti-His抗体（KPL，24-01-01），依据产品说明书进行Western Blot。20×buffer 含1M Tris-Cl pH7.5，40mM ATP，100mM MgCl₂，40mM DTT。所用其余均为商品化试剂， 可从试剂公司购得，并依照说明书进行实验操作。

结果如图3所示，与Rosetta（DE3）/pMAL-p2x菌体蛋白（MBP）相比，在RING1存 在时Rosetta（DE3）/pMAL-p2x-RING1菌体蛋白（MBP-RING1）能够检测到蛋白泛素 化产生的大分子量蛋白条带，表明RING1具有E3蛋白-泛素连接酶活性。

四、RING1与RDV P2在293T细胞中的共表达

1、表达载体的构建

1）重组质粒pRK-FLAGRING1

pGAD-RING1为模板，以引物RKRING1-5’SalI（序列为： 5’-TATTGTCGACGATGGATCTGGAGAGGTCG-3’）和RKRING1-3’XhoI（序列为： 5’-GGCCTCGAGTTACAAGAATGGCGGCATC-3’）进行PCR扩增，得到1329bp的PCR产物。

将上述PCR产物用Sal I和Xho I双酶切，回收酶切产物，与经过同样酶切pRK-FLAG 质粒（参见Min Lian and Xiaofeng Zheng，HSCARG Regulates NF-κB Activation by  Promoting the Ubiquitination of RelA or COMMD1，J Biol Chem.2009July3;284(27): 17998–18006.公众可从北京大学获得；）得到的6300bp的载体骨架连接，得到重组质 粒pRK-FLAGRING1，经过测序，重组质粒pRK-FLAGRING1为将序列表中序列2所示的DNA 分子插入pRK-FLAG质粒的Sal I和Xho I酶切位点间得到的载体。

2）重组质粒pRK-HAS2

pGBK-S2（参见Zhu et al.,2005.The Rice Dwarf Virus P2Protein interacts  with ent-Kaurene Oxidases in vivo,leading to reduced biosynthesis of  Gibberellins and rice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945..公 众可从北京大学获得；）为模板，以引物RKS2-5'SalI（序列为： 5’-CACCGTCGACCGCTTATCCTAATGACGTCAG-3’）和RKS2-3'Not I（序列为： 5’-ATTGCGGCCGCTCACAATGCATCATAGATAGATTG-3’）进行PCR扩增，得到3483bp的PCR 产物。

将上述PCR产物用Sal I和Not I双酶切，回收酶切产物，与经过同样酶切pRK-HA 质粒（参见Min Lian and Xiaofeng Zheng，HSCARG Regulates NF-κB Activation by  Promoting the Ubiquitination of RelA or COMMD1，J Biol Chem.2009July3;284(27): 17998–18006.公众可从北京大学获得；）得到的6300bp的载体骨架连接，得到连接产 物。取5μl连接产物，转化DH5α，涂布含有100mg/L Ampicillin的LB平板，37℃ 倒置培养16hr。挑取单菌落进行PCR鉴定，阳性克隆进行测序。所得质粒为pRK-HAS2， 是用于表达RDV P2的质粒。

3）共表达

pRK-FLAGRING1和pRK-HAS2共转染HEK293T细胞（参见Min Lian and Xiaofeng  Zheng，HSCARG Regulates NF-κB Activation by Promoting the Ubiquitination of  RelA or COMMD1，J Biol Chem.2009July3;284(27):17998–18006.公众可从北 京大学获得；），单独用pRK-HAS2转染细胞作为对照。通过胰酶消化收集293T细胞， 用完全培养基（高糖DMEM，10%胎牛血清）以1×10⁵至4×10⁵细胞/cm²的密度平 铺细胞于组织培养皿上（使细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的40－70％）。将细 胞置于含5％CO₂的37℃温箱中孵育8-24hr,当细胞贴壁完全后即可开始转染。转染前2 hr换液（用4ml新鲜的完全培养基置换旧的培养基）。制备磷酸钙－DNA沉淀（500μl 反应总体积）：在灭菌水中加入5μg质粒DNA，再加入31μl2M CaCl₂，使三者总体 积达到250μl，混匀。将等体积2×HBS盐溶液（NaCl16.3g/L，KCl0.74g/L，Na₂HPO₄0.214g/L，Glucose2.4g/L，HEPES10g/L，调pH值至7.05）逐滴加入，同时轻弹管 壁，使每滴加入后及时混匀。静置2min后，立即将这500μl的磷酸钙－DNA悬液逐 滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀。转染的细胞置于含5％CO₂的 37℃温箱孵育。8hr后吸去培养基与DNA沉淀，加入5ml37℃预热的完全培养基，继 续将细胞置于温箱内孵育。转染后的293T细胞，培养20小时后用1ml细胞裂解液裂 解细胞（若需用MG132处理，则在收集细胞前8hr在培养基中加入MG132至终浓度 25μM），进行SDS-PAGE和Western blot检测。

结果如图4所示，与RING1共表达时，P2的累积量明显降低。当用26S蛋白酶体抑制 剂MG132对细胞进行处理后，P2的累积量增加，且是否与RING1共表达差别不大。说明 RING1能够促进P2的降解，且该过程是通过26S蛋白酶体进行的。

实施例2、RING1在提高水稻对RDV的抗性中的应用

一、表达载体的构建

pRTL2-Flag载体构建：在invitrogen公司合成Flag-F(序列为： CATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGG)和Flag-R（序列为: 5’-TCGACCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTC-3’）两条序列，按照说明稀释成100μM，各取 10μl混匀，65℃退火10min后降到室温后形成双链，与用NcoI和SalI酶切过的pRTL2 （参见Zhu et al.,2005.The Rice Dwarf Virus P2Protein interacts with  ent-Kaurene Oxidases in vivo,leading to reduced biosynthesis of Gibberellins  and rice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945.公众可从北京大学获 得）质粒的3812bp载体骨架连接，得到pRTL2-Flag载体。

pCambia1301-FlagRING1载体的构建：以pGAD-RING1为模板，以引物RING1-5’SalI （序列为：5’-TATTGTCGACGATGGATCTGGAGAGGTCG-3’）和RING1-3’KpnI（序列为： 5’-GGCGGTACCTTACAAGAATGGCGGCATC-3’）进行PCR扩增，得到1329bp的PCR产物。

将上述PCR产物用Sal I和KpnI双酶切，回收酶切产物，与经过同样酶切pRTL2-FLAG 质粒的3836bp的载体骨架连接，得到重组质粒pRTL2-FLAGRING1，经过测序，重组质粒 pRTL2-FLAGRING1为将序列表中序列2所示的DNA分子插入pRTL2-FLAG质粒的Sal I和 Kpn I酶切位点间得到的载体。

然后将pRTL2-FLAGRING1用PstI单酶切，得到2398bp的酶切产物，回收酶切产物， 与用同样酶酶切的pCambia1301质粒（参见Zhu et al.,2005.The Rice Dwarf Virus  P2Protein interacts with ent-Kaurene Oxidases in vivo,leading to reduced  biosynthesis of Gibberellins and rice dwarf symptoms.Plant Physiology. 139:1935-1945.公众可从北京大学获得），得到11837bp的载体骨架连接，得到重组载 体pCambia1301-FlagRING1（PstI单酶切，得到2398bp的酶切产物为阳性）。

空载体对照pCambia1301-Flag载体构建：将pRTL2-Flag质粒用PstI单酶切，跑琼 脂糖凝胶，切胶回收1123bp的片段，与用同样酶酶切的pCambia1301质粒11837bp的载 体骨架连接，得到载体pCambia1301-Flag载体，与pCambia1301-FlagRING1唯一的区别 在于少了目的基因RING1。

二、过量表达转RING1水稻的获得

（1）愈伤组织的诱导培养

中花11水稻（以下也称为野生型水稻）种子去壳，先用70%乙醇浸泡10min，再 用0.1%升汞浸泡30min；进行表面除菌。用大量无菌水洗去种子表面的溶液，用无菌 滤纸吸去种子表面的水分。将种子置于成熟胚愈伤诱导培养基平板上，用Parafilm膜 封闭平皿边缘，于26℃温箱内避光培养。大约15天后，小心取下长出的愈伤组织， 转移到成熟胚继代培养基上，同样条件继续进行培养。每两周需进行一次继代培养。 用于转化时，需挑选继代培养5天左右、呈淡黄色的颗粒状愈伤组织。

（2）农杆菌的培养

将pCambia1301-FLAGRING1电转入农杆菌EHA105（参见Zhu et al.,2005.The Rice  Dwarf Virus P2Protein interacts with ent-Kaurene Oxidases in vivo,leading  to reduced biosynthesis of Gibberellins and rice dwarf symptoms.Plant  Physiology.139:1935-1945.公众可从北京大学获得)中，得到重组菌EHA105/ pCambia1301-FLAGRING1。

重组菌EHA105/pCambia1301-FLAGRING1能够在加了抗生素利福平和卡那霉素的LB 平板上生长，而且以引物RING1-5’SalI（序列为： 5’-TATTGTCGACGATGGATCTGGAGAGGTCG-3’）和RING1-3’KpnI（序列为： 5’-GGCGGTACCTTACAAGAATGGCGGCATC-3’）进行PCR扩增，得到1329bp的PCR产物的为 阳性菌。

将EHA105/pCambia1301-FLAGRING1在含有抗生素（50mg/L Kanamycin，50mg/L  Rifampicin）的LB平板上划线，28℃培养2天。挑取单菌落接入液体LB培养基中， 28℃振荡培养至OD₆₀₀约为0.5，加入乙酰丁香酮至终浓度100mM，得到用于转化水稻 愈伤组织的农杆菌悬液。

（3）水稻愈伤组织与农杆菌的共培养

将继代愈伤组织放入灭过菌的锥形瓶中，倒入农杆菌悬液使之浸没愈伤组织。室 温放置20min，并不时轻轻晃动使愈伤组织与菌液充分接触。用无菌的镊子轻轻取出 愈伤组织，放于无菌滤纸上吸去多余的菌液，转移到铺有一层无菌滤纸的共培养培养 基平板上。28℃暗培养3天，得到经过共培养的愈伤组织。

（4）抗性愈伤组织的筛选与分化

将经过共培养的愈伤组织用适量无菌水清洗，除去表面残余的农杆菌，放在筛选 培养基上，26℃避光培养进行筛选，两周后转移到新的筛选培养基上继续筛选两周。 挑选经过两轮筛选后状态较好的愈伤组织，将其转移到分化培养基平板上，先避光培 养3天，然后再转至光照培养箱中（15hr/day）进行光照培养。一个月后可见分化出 的小苗。当分化的小苗长至约2cm时，将其转移到锥形瓶中的生根培养基上，继续培 养两周左右。选择长势较好、根系发达的小苗，用自来水洗去根部的培养基后移栽入 土壤中，收取种子，得到T₁代转RING1水稻种子，播种得到T₁代转RING1水稻。

T₁代的水稻种子通过潮霉素初步筛选（pCambia1301载体带有潮霉素抗性筛选基 因），发芽的种子，表明载体转入水稻。将发芽的种子种入土中，生长2周后，取0.1g 叶片，用液氮磨成粉末，加入蛋白提取缓冲液（0.25M Tris-Hcl，pH6.8，8%SDS，8% β-巯基乙醇，20%甘油）200μl,冰上孵育10min，100℃煮沸10min，4℃，12000rpm 离心10min后取上清，进行SDS-PAGE，转膜之后用Western检测。SDS-PAGE及Western  Blot依照公知方法及产品说明书进行。所用抗体为anti-FLAG-HRP（sigma）。如图5， 在46KDa处出现条带者为阳性，表明基因转入且蛋白表达，用于之后的抗病分析实验。

采用同样的方法，将空载体pCambia1301-Flag转入野生型水稻中，得到转空载体 水稻。用潮霉素水浸泡种子进行阳性转化筛选。

三、转RING1水稻对RDV抗性增强

1、RT-PCR鉴定RDV P2部分蛋白的表达

用携带RDV（参见Zhu et al.,2005.The Rice Dwarf Virus P2Protein interacts  with ent-Kaurene Oxidases in vivo,leading to reduced biosynthesis of  Gibberellins and rice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945.公众 可从北京大学获得。）的叶蝉（病原菌为水稻矮缩病毒（Rice Dwarf Virus））接种T₁代转RING1水稻、转空载体水稻和野生型水稻中花11，每种水稻接种25株，白天30 度，晚上22度，湿度60%培养，每株接5头叶蝉，咬食三天后将叶蝉捉出，咬食过的 水稻在阳光温室种培养（自然光，温度。实验重复3次，结果取平均值）。

接毒2周后，提取25株T₁代转RING1水稻、25株转空载体水稻和25株野生型水 稻中花11总RNA，之后，按照下表1，用RQ1Dnase（Promega，货号：M610A）对RNA 中的基因组DNA进行消化：

表1为消化体系

然后取2ug消化后的RNA进行反转录和半定量PCR，具体方法参见invitrogen  M-MLV Reverse Transcriptase（货号：28025-021），扩增产物为RDV P2部分蛋白的 编码序列S2；其中使用的引物为：RDVS2F1946:CTATACCACGATGAAGGCCT和RDVS2R2446: TAATGGTACCGATGGTTACC。得到500bp大小条带的为感染RDV阳性，没有的为感染RDV 阴性。

以OsEF1a作为内参，内参的引物为R10：5’-CTTCCTCTGCGCTTGAGGTG-3’和F12： 5‘-ACATTGCCGTCAAGTTTGCTG-3’（参见Zhu et al.,2005.The Rice Dwarf Virus P2 Protein interacts with ent-Kaurene Oxidases in vivo,leading to reduced  biosynthesis of Gibberellins and rice dwarf symptoms.Plant Physiology. 139:1935-1945.)。

结果如图6所示，可以看出，25株T₁代转RING1水稻中有5株扩增得到500bp的 S2；25株野生型水稻中花11中有12株扩增得到500bp的S2；说明T₁代转RING1水 稻比野生型水稻对RDV抗性提高，感染的RDV病毒的植株数目减少。

根据上述是否扩增500bp的S2，计算带毒率=（扩增500bp的S2的株数/总株数） *%。

结果统计如下表1：

表1为转RING1水稻带毒率统计结果

转空载体水稻和野生型水稻结果无显著差异。

2、转RING1水稻对RDV抗性增强表型统计

接毒2周后，观察25株T₁代转RING1水稻、25株转空载体水稻和25株野生型水 稻中花11的表型，其中感染RDV病毒的为植株矮缩，叶色浓绿，叶片僵硬，在叶片或 叶鞘上出现白色斑点并与叶脉平行排列成虚线状，无感染RDV病毒的为叶片或叶鞘上 不出现白色斑点（如图7）。

结果如下：

25株T₁代转RING1水稻有5株为出现感病症状（与上述RT-PCR鉴定的株数一致）， 有20株为无感病症状；

25株野生型水稻有12株为出现感病症状（与上述RT-PCR鉴定的株数一致），有 13株为无感病症状；

转空载体水稻和野生型水稻结果无显著差异。

因此，可以看出，与野生型水稻相比，T0代转RING1水稻对RDV抗性增强。 上述结果表明，RING1及其编码的蛋白过表达可以提高水稻对RDV抗性。