水稻条纹病毒病程相关蛋白SP寄主互作因子的分离鉴定及水稻齿轮叶矮缩病毒单克隆抗体的制备和应用

摘要

水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）近年来严重影响了我国水稻的产量。该病毒是纤细病毒属(Tenuivirus)的典型成员，病毒粒子为丝状体，介体昆虫为灰飞虱(Laodelphax Striatellus Fallen)，以持久循回增殖型的方式进行传播。为了分析水稻条纹病毒的致病机理，本文对与水稻条纹病毒病程相关蛋白SP互作的寄主因子进行分离、鉴定。
　　 用酵母双杂交的方法分离寄主互作因子，即诱饵质粒pGBKT7-SP和水稻cDNA文库的质粒pGADT7-Rec-cDNA共转化酵母菌株Y2H Gold，通过三缺和四缺营养缺陷型培养基上的生长情况，初步选定寄主互作因子基因片段。寄主因子基因片段经测序分析，并进一步进行回转验证，鉴定了与SP互作的R3H domain蛋白为候选水稻寄主因子。从健康水稻叶片中克隆了这个基因的全长序列后，构建酵母双杂交载体pGBKT7-SP与pGADT7-R3H，将两个质粒共转化酵母菌株Y2H Gold后，发现R3H domain蛋白能在酵母营养缺陷培养基上生长，说明SP蛋白和R3H domain蛋白之间互作。同时构建了双分子荧光互补实验(Bimolecularfluorescence complementation，BiFC)的重组质粒YFPN-SP和YFPC-R3H，转化农杆菌C58C1后，浸润本氏烟叶片后，共聚焦显微镜下有明显的黄色荧光，证实SP和R3H domain蛋白可以在烟草细胞中互作。R3H dmain蛋白的分离、鉴定为弄清RSV的致病机理打下基础。
　　 水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus，RRSV)是呼肠弧病毒科(Reoviridae)水稻病毒属(Oryzavirus)的成员，引起水稻齿叶矮缩病，目前严重影响我国的水稻生产。该病毒的传播介体是褐飞虱(Nilaparvata lugens)，其以持久方式进行传播。
　　 从感染RRSV的水稻叶片中提取水稻总RNA，用RT-PCR方法克隆了RRSV的衣壳蛋白基因(CP)后构建到原核表达载体pMAL-C2X上，构建成重组表达载体pMAL-C2X-CP，pMAL-C2X-CP转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，经0.5mM IPTG37℃诱导3小时表达重组蛋白。表达的重组融合蛋白经AmyloseResin亲和层析柱纯化后，获得RRSV的80KD左右的重组融合外壳蛋白。用得到的重组蛋白免疫老鼠，取免疫老鼠的脾脏细胞和SP2/0细胞融合，经过细胞筛选、克隆后得到1株能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株4H5，扩大培养后制备腹水。利用4H5单抗建立了检测RRSV的dot-ELISA方法，该dot-ELISA方法检测田间水稻和褐飞虱样品的检测灵敏度分别为1∶320（w/v，g/mL）和1∶400（头/μL）。水稻齿叶矮缩病毒特异性单抗的制备及dot-ELISA高通量血清学检测方法的建立，为水稻齿叶矮缩病毒的预警预报及建立科学的防控体系具有重要的意义。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 文献综述

第一节 水稻条纹病毒分子生物学研究进展

1 水稻条纹病毒的基因组结构和功能

第二节 植物病毒与寄主互作的研究现状及其研究方法

1 病毒与寄主互作因子研究现状

2 病毒与寄主互作因子研究的研究方法

第三节 水稻齿叶矮缩病毒研究进展

1 RRSV的基因组结构及编码的蛋白功能

2 病毒形状及其传播

3 植物病毒常用的鉴定方法

第二章 研究内容

第一节 水稻条纹病毒病程相关蛋白SP与寄主互作因子研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二节 水稻齿叶矮缩病毒单克隆抗体的制备

1 材料

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

附录A 常用生化及分子生物学试剂与仪器

附录B 常用缓冲液及培养基配方

在校期间科研成果