重组人胸腺素alpha原蛋白在制备伤口愈合药物中的应用

摘要

重组人胸腺素alpha原蛋白在制备伤口愈合药物中的应用，涉及重组人胸腺素alpha原蛋白。将重组胸腺素alpha原应用于伤口创面，动物和体外实验结果显示，胸腺素alpha原能够促进正常小鼠伤口愈合，糖尿病小鼠伤口愈合。体外培养人脐带静脉血管内皮细胞划线后，添加胸腺素alpha原能够显著促进划线的愈合。胸腺素alpha原应用于伤口愈合尤其是糖尿病伤口愈合药物用途有重要意义。胸腺素α原为重组人胸腺素α原和提取的胸腺素α原。胸腺素α原通过降低MMP-9和TIMP-1水平，从而降低MMP-9/TIMP-1比值。胸腺素α原通过增加胶原纤维表达水平达到促进伤口愈合作用。

说明书

技术领域

本发明涉及重组人胸腺素alpha原蛋白，尤其是涉及重组人胸腺素alpha原蛋白在制备 伤口愈合药物中的应用。

技术背景

1984年，Haritos等从大鼠胸腺分离出一种含有111个氨基酸残基的多肽，由于其N端 含已发现的所有胸腺素α原家族成员的序列，因此命名为胸腺素α原。胸腺素alpha原有 明显的中心酸性区和亲核序列。胸腺素alpha原具有广泛的生物学活性，在细胞增殖、免疫 调控和生殖活性等多方面起重要作用[1.曹俊霞，金礼吉，王梅，等.胸腺素α原研究进展[J]. 细胞生物学杂志2003，25(1):21-25.]。作为一类有效的免疫增强药物，胸腺素alpha原对 各种免疫缺陷病毒、病毒感染以及肿瘤都具有一定的作用，可用于治疗乙型、丙型肝炎和其 他病毒性疾病，并可作一些肿瘤早期诊断的生物标签用于辅助治疗[2.张俊彦，龚兴国.胸腺 素原α的分子结构与作用机制研究进展[J].医学分子生物学杂志2004，1(3):186-189.]。有 文献报道，应用胸腺素alpha原治疗乙肝的疗效比IFN更具耐受性[3.Andreone， P.A.randomized controlled trial of thymosin-alpha1versus interferon alfa treatment  in patients with hepatitis B eantigen antibody--and hepatitis B virus DNA-positive  chronichepatitis B[J].Hepatology，1996，24(4):774-777.]；对于慢性丙型肝炎患者， 联合应用胸腺素alpha原和IFN-α疗效优于单独应用IFN[4.Sherman，K.E.Combination  therapy with thymosin alpha1and in-terferon for the treatment of chronic hepatitis  C infection:arandomized，placebo-controlled double-blind trial[J].Hepatology， 1998，27(4):1128-1135.]。

细胞外基质(extracellμlar matrixc，ECM)的过度沉积或降解将导致创面修复异常，在 ECM合成和降解的代谢平衡中MMPs／TIMPs两个酶系统起着重要作用。两者的平衡对伤口的 愈合起至关重要的作用。

本申请人在中国专利200810072084.4中公开一种重组蛋白在制备预防糖尿病口服药物 中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供重组人胸腺素alpha原蛋白在制备伤口愈合药物中的应用。

本发明将重组胸腺素alpha原应用于伤口创面，动物和体外实验结果显示，胸腺素alpha 原能够促进正常小鼠伤口愈合，糖尿病小鼠伤口愈合。体外培养人脐带静脉血管内皮细胞划 线后，添加胸腺素alpha原能够显著促进划线的愈合。实验结果为胸腺素alpha原应用于伤 口愈合尤其是糖尿病伤口愈合药物用途有重要意义。

所述胸腺素α原为重组人胸腺素α原和提取的胸腺素α原。

所述胸腺素α原通过降低MMP-9和TIMP-1水平，从而降低MMP-9/TIMP-1比值。

所述胸腺素α原通过增加胶原纤维表达水平达到促进伤口愈合作用。

所述胸腺素α原体外对正常细胞的生长有促进作用。

药效学动物实验：

1.病理切片结果：

1）．对正常小鼠伤口愈合作用：用自制圆形模具制作直径为1.2cm的圆形伤口（深及浅 筋膜），随机将正常27只小鼠分为两个ProTa处理组和一个对照组。处理组分别用60μg/ml、 120μg/ml的ProTa滴入伤口区，对照组用灭菌过的PBS滴入，每只25μl/次/天。每组分别 于用药3、6、9d后测量伤口大小并颈椎脱臼处死3只，取伤口处皮肤用于RNA提取及后续半 定量PCR检测。

HE结果证明，ProTa能够明显促进正常小鼠伤口愈合率，并且具有量效关系，其中120 μg/ml剂量效果最明显。差异显著（P＜0.05）

2）.对糖尿病小鼠伤口愈合作用：应用STZ诱导的糖尿病小鼠模型成功后按以上制备伤 口模型和药物处理，其中药物只用效果最佳的120μg/ml组。HE实验结果同样证明ProTa能 够明显促进正常小鼠伤口愈合率。差异显著（P＜0.05）。Masson染色还发现ProTa能够明显 提高伤口处新生胶原纤维的含量，从另一个途径证明ProTa对伤口愈合有作用的机制。

2.ProTa对MMP9/TIMP-1表达水平的影响：对正常小鼠和糖尿病小鼠伤口皮肤材料的半 定量PCR分析。结果显示，ProTa能够降低MMP9的表达量，同时升高TIMP-1的表达水平。 总体降低了MMP9/TIMP-1的比值，从基因水平进一步揭示了ProTa促进伤口愈合的重要作用 机理。

3.ProTa体外对人脐带静脉内皮细胞划线愈合速度的影响：通过原代培养的第三代人脐 带静脉内皮细胞划线实验证明，ProTa能够明显促进划线部位两倍细胞的增长，显著缩短划 线部位细胞愈合的时间。以胸腺素a1和重组人表皮因子（rh-EGF）作为比较发现，ProTa效 果最明显。

以上实验结果证明，ProTa能够通过降低MMP9水平，提高TIMP-1水平，总体降低了 MMP9/TIMP-1的比值的途径，在促进伤口愈合，减少感染，促进损伤组织的修复方面具有重 要的生物学功能。因此，ProTa能够用于制备各种伤口，包括正常人伤口（皮肤伤口和眼睛 伤口）和糖尿病病人伤口的药物。

附图说明

图1为不同浓度的胸腺素alpha原对小鼠皮肤伤口愈合效果的影响。在图1中，横坐标 代表时间（天）；纵坐标代表愈合率（%）；60μg/ml胸腺素alpha原，120μg/ml胸腺素alpha 原，PBS treated分别代表不同浓度胸腺素alpha原处理组和PBS处理组；*，**，分别代 表差异显著和极显著，a为120ug/ml ProTa Treated,b为60ug/ml ProTa Treated,c为PBC  Control。

图2为不同组伤口处理后皮肤组织切片情况（HE染色）（E代表实验用药组；F代表对照 组）。图中英文reconstitute epidermis重建的上皮；subsidiary organs附属器官。

图3为胸腺素alpha原对MMP-9/TIMP-1比值的影响。横坐标代表损伤时间（天），纵坐 标代表MMP9/TIMP1比值。

图4为胸腺素alpha原对糖尿病小鼠伤口愈合作用（伤口照片）。第一排代表正常小鼠皮 肤伤口愈合情况；第二排代表糖尿病小鼠伤口经过胸腺素alpha原处理后愈合情况；第三排 代表糖尿病小鼠伤口非处理组愈合情况。A，0天；B，2天；C，4天；D，6天；E，8天；F， 10天。

图5为胸腺素alpha原对糖尿病小鼠伤口愈合作用组织切片图（HE染色）。C，实验用药 组；D，对照组。

图6为胸腺素alpha原对糖尿病小鼠伤口组织的胶原纤维水平的影响（Masson染色结果）。 G，实验用药组；H，对照组。

图7为胸腺素alpha原体外对人脐带内皮细胞增殖的影响。第一排为0h划线细胞生长情 况图；第二排5h划线细胞生长情况图；第三排10h划线细胞生长情况图；第四排为20h划线 细胞生长情况图；A代表PBS对照组，B代表30用药组；C代表90用药组；D代表120用药 组。

图8为胸腺素alpha原与Tα1及rh-EGF体外对人脐带内皮细胞增殖效果比较。第一排 为0h划线细胞生长情况图；第二排10h划线细胞生长情况图；第三排15h划线细胞生长情况 图.A代表胸腺素alpha原，B代表rh-EGF，C代表Tα1.A+B代表胸腺素alpha原+rh-EGF； A+C代表胸腺素alpha原+Tα1。

具体实施方式

具体步骤如下：

1.动物伤口模型制备：昆明小鼠动物房内适应性饲养一周后开始进行实验。小鼠脱毛后 用75%酒精对欲制作伤口区进行消毒处理。用自制圆形模具制作直径为1.2cm的圆形伤口（深 及浅筋膜），创面自然止血。伤口制作后将小鼠放于无垫料的鼠笼中，每笼单只饲养，禁食禁 水过夜，于第二天才给予标准饲料和饮水。随机将27只小鼠分为两个ProTa处理组和一个对 照组。处理组分别用60μg/ml、120μg/ml的ProTa滴入伤口区，对照组用灭菌过的PBS滴 入，每只25μl/次/天。每组分别于用药3、6、9d后测量伤口大小并颈椎脱臼处死3只，取 伤口处皮肤用于下一步RNA的提取及RT-PCR实验，分析转录水平的差异。结果见图1，图2， 图3.从图1中可以看出，用药组小鼠伤口愈合率明显比PBS对照组伤口愈合率高，差异显著 （P＜0.05）。从图2的HE染色结果同样可以看出，用药组伤口组织生长情况，附属组织包括 毛囊血管等数量明显比PBS对照组好。从图3可以看出，用药组对MMP9/TIMP1比值有明显影 响，能够明显降低这一比值，从转录水平揭示ProTa对伤口愈合的作用机理。

2.伤口愈合率测量及数据处理：分别于小鼠伤口制作后（即0d）到处死前隔天观察伤口 的形态变化，同时于0，3，6，9d测量小鼠的伤口面积。本实验采用数码相机联合计算机软 件分析法测量伤口面积。所得图片用Image J医学图像分析软件结合Excel2000按照以下公 式计算伤口愈合率：（初始面积－残留面积）/初始面积×100%。每个伤口重复测量三次，其 平均值作为最终的伤口面积。将实验所得到的数据用Excel、Graphpad Prim5软件进行统计 学分析并作图。实验数据符合正态分布者用均数±标准差表示，正态数据两组间比较采用 Student’s T检验；P<0.05为显著性差异，P<0.01，P<0.0001为极显著性差异。

3.ProTa促进糖尿病小鼠皮肤愈合的实验：应用Streptozotoxin(STZ)制备糖尿病小鼠， 糖尿病小鼠模型的建立：选用25g左右清洁级昆明小鼠随机分为PBS对照组、120μg/ml ProTa 处理组。STZ（以无菌0.01mol／L枸橼酸一枸橼酸钠缓冲液在冰浴中新鲜配制，PH4．5）注 射前基础随机血糖小于6.7mmol/L，适应性饲养1周后，小鼠禁食24h后再给予40mg/kg腹 腔注射STZ，连续5d注射以诱导糖尿病，注射5d后尾静脉采血检测随机血糖水平，注射后 随机血糖水平≥11.0mmol/L，视为糖尿病模型建立成功。两组小鼠实验期间自由进食、饮水， 每隔5天监测体重和血糖，重复6次，如果血糖值≥11.0mmol/L即说明糖尿病模型制作成功。

用自制圆形模具制作直径为1.2cm的圆形伤口（深及浅筋膜），创面自然止血。伤口制作 后将小鼠放于无垫料的鼠笼中，每笼单只饲养，禁食禁水过夜，于第二天才给予标准饲料和 饮水。120μg/ml ProTa处理组用120μg/ml的ProTa滴入伤口区，PBS对照组用灭菌过的 PBS滴入，每只25μl/次/天。每组分别于用药2、4、6、8、10d后测量伤口大小，实验结束， 颈椎脱臼处死动物。皮肤伤口用于HE染色。结果见图4，图5.从图4可以看出，正常小鼠伤 口愈合速度最快，好于糖尿病小鼠伤口；而糖尿病小鼠的两组中用药组，即120μg/ml ProTa 处理组明显比PBS对照组愈合效果好。图5的HE切片结果同样可以发现，用药组伤口填补的 速度明显比对照组要好。

4.皮肤组织HE染色，实验步骤为：

1）取将上述1，3实验处理的伤口切下后，放入4%多聚甲醛中固定约24h；

2）将皮肤组织依次放入70%、80%、95%、100%乙醇逐级脱水，每级45min；

3）置于二甲苯中，透明20min，并重复1次；

4）置于液体石蜡中，在60℃烘箱中透蜡1h，重复3次；

5）使用石蜡包埋机包埋；

6）使用石蜡切片机进行石蜡切片，切片厚度为5μm；

7）将石蜡切片依次放入二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、蒸馏水中各 5min，进行脱蜡复水；

8）将切片放入苏木精染液中，染色4min；

9）用自来水水冲洗切片1min；

10）将切片放入伊红染液中，染色3min；

11）用自来水水冲洗切片1min；

12）将切片依次放入70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、二甲苯中各1min，进行 脱水；

13）将切片从二甲苯中取出立即滴加适量中性树胶封片；

14）显微镜观察切片并拍照。

5.Masson三色染色法其实验步骤为：

1）将部分实验3的伤口组织通过常规HE染色的组织切片过程后，切片脱蜡经过系列酒 精复水。

2）Harris’s苏木素染胞核10min，水洗；

3）入Masson复合染色液染色10-20min，0.2%醋酸速洗1-2s两次，1%磷钼酸处理5-8min， 不用水洗直接染亮绿，1%亮绿SF染色2-4min；

4）用新鲜95%乙醇分化20-30s，脱水、透明、封片。

实验结果为：胶原纤维，粘液、软骨呈绿色或蓝色，胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质纤 维呈红色，胞核呈兰黑色，红细胞呈橘红色。结果见图6，从图6中可以看出，用药组蓝色 成分明显比对照组深，面积大，说明，用药组能够明显提高胶原纤维的含量，对伤口的有效 愈合有促进作用。

6.ProTa促进人脐带静脉内皮细胞增殖的实验：

通过原代培养的第三代人脐带静脉内皮细胞用灭菌枪头划线，形成一条无细胞的沟痕， 分成四组，A：空白对照组，加PBS；B:加ProTa30/mL；C:加ProTa90/mL；D:加ProTa 120/mL。第一排0h划线细胞生长情况;第二排5h划线细胞生长情况图；第三排10h划线细胞 生长情况图；第四排为20h划线细胞生长情况图。二氧化碳培养箱中培养，每两h在显微镜 观察细胞生长情况及划线位置细胞生长情况。显微拍照。结果见图7，从图7中可以看出， 第一排0h划线细胞生长情况各组没有明显差别；第二排，第三排高浓度的D组细胞明显增殖 快，而A和B，C差别不明显.第四排开始，高浓度的D组明显比其他三组细胞增殖快，并且 划线部位已经填忙满了细胞，C组与A，B组也有明显差别，划线部位只剩下小缝隙。而A，B 两组到20h仍然有明显的缝隙.说明ProTa能够促进细胞分裂和转移，并且有量效关系。

7.胸腺素alpha原与Tα1及rh-EGF体外对人脐带内皮细胞增殖效果比较实验:

通过原代培养的第三代人脐带静脉内皮细胞用灭菌枪头划线，形成一条无细胞的沟痕， 分成六组，对照组：空白对照组，加PBS；A:加ProTa120/mL；B:加rh-EGF120/mL；C: 加Tα1120/mL。A+B:胸腺素alpha原+rh-EGF(各120/mL)；A+C:胸腺素alpha原+Tα 1(120/mL).二氧化碳培养箱中培养，每两h在显微镜观察细胞生长情况及划线位置细胞生长 情况。显微拍照结果见图8，从图8中可以明显看出，实验开始后12hProTa120/mL组明显 划线部位比其他各组窄，ProTa+Ta1和ProTa+rh-EGF其次。而Ta1组和rh-EGF与空白组没 有明显差别。说明ProTa120/mL组细胞生长明显比其他各组快，15h后，ProTa120/mL高剂 量组的划线部位已经长满了细胞，而对照组划线部位还有一条明显的沟壑。以上实验从体外 证实ProTa能够明显加速细胞的增值生长。并且效果比EGF及Ta1效果明显好。而ProTa与 EGF及Ta1组合则明显比单独使用EGF及Ta1效果要好。