来源于牡丹的抗逆转录因子PsDREB1及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种抗逆转录因子PsDREB1及其编码基因、载体、工程菌与应用，所述抗逆转录因子PsDREB1具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列90%以上同源性；本发明首次从牡丹中克隆DREB类抗逆转录因子，即抗逆转录因子PsDREB1；本发明通过与拟南芥6类DREB转录因子同源比对，发现其属于第6类DREB；通过转基因实验，发现该基因具有明显的提高植物抗旱、抗高盐的能力，证明其是一个非常有应用价值的转录因子。

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种来源于牡丹的抗逆转录因子PsDREB1及其编码基 因、载体、工程菌与应用方法。

（二）背景技术

牡丹（Paeonia suffruticosa）是原产中国的著名花灌木，更是具有深 厚文化内涵的中国传统名花。近年民间有关“国花”的网络评比中，牡丹 屡夺“花魁”之美誉。随着我国园林花卉产业的发展，牡丹在城乡绿化和 药材种植中的应用大幅提升，然而，千百年的人工驯化使得牡丹抗逆能力 较差，其研究、应用集中分布于黄河流域，广袤的国土依然有大片的牡丹 种植“禁区”，这大大限制了“花魁”在花卉产业中的发展。

牡丹在长江以南地区难以广泛种植的根本原因是其对环境的适应能 力比较差，提高其抗逆性能是使牡丹花开全国的主要任务。DREB类转录 因子是一类普遍存在于高等植物体内的抗逆转录因子，该类基因的表达可 以启动一系列抗逆反应的发生，从而大大提高植株本身的抗逆性能。克隆 并研究该类转录因子，将利用价值高的成员导入到植物体内，是通过转基 因手段定向培育高抗植物的有效手段。本发明就是利用同源克隆法，首先 获取牡丹PsDREB1的部分片段，然后通过RACE技术获取全部编码区段， 进而通过转基因手段发现其具有显著提高植物抗性的例证。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种牡丹DREB类转录因子，通过超量表达证明 其具有提高植物抗旱、抗高盐的能力。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种来源于牡丹的抗逆转录因子PsDREB1，所述抗逆转 录因子PsDREB1具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列90%以上同源性， 优选所述抗逆转录因子PsDREB1的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。由 于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID No.1所示氨基酸序列的肽蛋 白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽 蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90%以上，均属于 本发明保护范围之列。具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺 失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与 原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具 有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

本发明还涉及所述来源于牡丹的抗逆转录因子PsDREB1的编码基 因，所述抗逆转录因子PsDREB1的编码基因具有SEQ ID NO.2所示核苷 酸序列90%以上同源性，优选所述抗逆转录因子PsDREB1的编码基因的 核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO：2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90%以上同源 性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个 或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的变位变 异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本 领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核 苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。

本发明涉及含有所述抗逆转录因子PsDREB1的编码基因的载体。

本发明还涉及一种含有所述抗逆转录因子PsDREB1的编码基因载体 的重组基因工程菌。所述重组基因工程菌的构建方法为：构建含有抗逆转 录因子PsDREB1的编码基因的重组载体，将所述重组载体转化至农杆菌 菌株EHA105中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯 化获得含有抗逆转录因子PsDREB1的编码基因的重组基因工程菌的菌体 细胞。

本发明还提供所述抗逆转录因子PsDREB1的编码基因在培育抗旱、 抗高盐植物中的应用。如本发明所述的转基因植株（PsDREB1）的较野 生型烟草生长表现出显著的耐旱特性。并且转基因烟草显示抗高盐胁迫能 力明显高于野生型材料。

本发明的要点在于提供了SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，在已知该氨基酸序列和核苷酸序列的情况下， 该氨基酸序列和核苷酸序列的获得，以及相关载体、宿主细胞的获得，对 于本领域技术人员来说均是显而易见的。

本发明所提供的抗逆转录因子PsDREB1是从牡丹中获得的，它属于 具有显著抗逆功能的众多DREB转录因子家族中的一员。该转录因子同 其他物种的DREB基因一样，不含有内含子，方便采用基因组DNA为模 板克隆获得。通过构建超量表达载体并异源转化烟草，发现该转录因子具 有明显的提高烟草抗旱和抗高盐的能力。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明首次从牡丹 中克隆DREB类抗逆转录因子，即抗逆转录因子PsDREB1；本发明通过 与拟南芥6类DREB转录因子同源比对，发现其属于第6类DREB；通 过转基因实验，发现该基因具有明显的提高植物抗旱、抗高盐的能力，证 明其是一个非常有应用价值的转录因子。

（四）附图说明

图1来源于牡丹的抗逆转录因子PsDREB1与其他物种同源基因的多 序列比对结果图；

图2超量表达来源于牡丹的抗逆转录因子PsDREB1导致转基因烟草 抗旱能力提升照片；

图3超量表达来源于牡丹的抗逆转录因子PsDREB1导致转基因烟草 抗高盐能力提升照片。

图4来源于牡丹的抗逆转录因子PsDREB1的核苷酸序列（SEQ ID NO.2所示），氨基酸序列（SEQ ID NO.1所示）。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：

实施例1来源于牡丹的抗逆转录因子PsDREB1的获得

于2010年5月取6年生牡丹品种“乌龙捧盛”的幼嫩叶片为材料，采用 普通CTAB法（植物基因工程，王关林，2002版）提取总DNA，以总DNA 为模板，用兼并引物对：GPF-AARCCRTNACHGATDAARMAA， GPR-CCANGC TRSRTCNGCRAARTT对其进行PCR扩增。反应程序为 95℃1min，94℃50s，56℃1min，72℃1min，36个循环，72℃5min，所用 试剂（LATaq酶）均购自大连宝生物公司，扩增体系：LAtaq酶（5U/μl） 0.5μl，10×LAtaq bufferⅡ5μl，Dtnp mixture8μl，template1μl，引物11μl， 引物21μl，灭菌蒸馏水32.5μl。经过PCR扩增获得226bp的中间片段。

以上述PCR扩增获得226bp的中间片段为参考，设计3’RACE和 5’RACE引物，以获取中间序列两端的序列。具体是，3’RACE用到的引物 对：3’f-GAGAAGTCCGTGCGCCTGG，3’r-CT ACTTCA TTACCCCCTTCT，扩增程序为95℃1min，94℃50s，68℃1min， 72℃1.5min，36个循环，72℃5min，扩增体系：LAtaq酶（5U/μl）0.5μl， 10×LAtaq bufferⅡ5μl，Dtnp mixture8μl，template1μl，引物11μl，引物 21μl，灭菌蒸馏水32.5μl。通过PCR扩增获得中间序列及下游片段。

5’RACE用到的引物对：5’f-TGCATCTGGC TGTCGACTG， 5’r-CACA TTGCAGGTGACTTTG，扩增程序为95℃1min，94℃50s， 66℃1min，72℃1min，36个循环，72℃5min，扩增体系：LAtaq酶（5U/μl） 0.5μl，10×LAtaq bufferⅡ5μl，Dtnp mixture8μl，template1μl，引物11μl， 引物21μl，灭菌蒸馏水32.5μl。经过PCR扩增获得中间序列及上游片段。

将PsDREB1基因的上游片段和下游片段进行序列拼接，获得了完整 编码框（CDS），经过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html网站分析， 该编码框有363个氨基酸，具有明显的起始和终止密码子，说明该基因的 完整性。分析推测的氨基酸序列，该基因含有一个保守的AP2结构域，共 计59个氨基酸残基，分离得到的转录因子在其AP2保守区域中其第14和19 位氨基酸分别是缬氨酸（V14）和亮氨酸（L19），与所有分离得到的其他 物种的DREB类转录因子相符，也再次证明该转录因子为DREB类转录因 子。虽然该基因未发现有明显的核定位信号，但是作为转录因子，一般发 挥功能都是在细胞核内，具体的定位信息有待实验进一步验证。

因此，将获得的编码框（CDS）命名为抗逆转录因子PsDREB1。通 过公共平台NCBI网站中ORFinder软件的应用，获得了抗逆转录因子

PsDREB1的编码框区域，并得到了预测的氨基酸组成信息。该基因编码 区的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

实施例2含抗逆转录因子PsDREB1编码基因的重组基因工程菌的制备 利用特异引物对：sppf--ga(GAGCTC)atgtggctcggcacatttg(含sac1酶切位 点)，sppr—gc(gtcgac)ttagatagcctcttttactcg（含sal1酶切位点），以实施例 1中获得的高质量总DNA（即氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的抗逆转 录因子PsDREB1）为模板进行PCR反应，反应程序为：95℃1min，94℃50s， 66℃1min，72℃1.5min，36个循环，72℃5min，反应体系：LAtaq酶（5U/μl） 0.5μl，10×LAtaq bufferⅡ5μl，Dtnp mixture8μl，template1μl，引物11μl， 引物21μl，灭菌蒸馏水32.5μl。将获得的PCR产物回收后进行sac1、sal1 双酶切，酶切体系按照TAKARA公司产品说明书进行。酶切后的基因片 段与同样酶切回收的表达载体Pcambia2300（M）中，测序验证，测序结 果与原始数据一致。然后将阳性质粒电击导入农杆菌菌株EHA105中， 获得含抗逆转录因子PsDREB1编码基因的重组基因工程菌，即含有超量 表达载体的农杆菌菌株EHA105。

实施例3含抗逆转录因子PsDREB1编码基因在制备抗逆植物中的应用 用实施例2制备的含有超量表达载体的农杆菌菌株EHA105侵染普通烟草 无菌苗叶片，采用通用叶盘法转化（材料与方法严格参照Horsch RB,Fry  JE,Hoffman NL,Eicholtz D,Rogers SG,Fraley RT(1985)A simple and general method for transferring genes into plants.Science227:1229–1231.）。 获得含有抗逆转录因子PsDREB1编码基因的抗性烟草植株。经过后代分 离筛选和southern杂交确定单克隆株系后自交纯化，获得T3代株系，用于 后续试验分析。

耐旱试验始自2012年6月5号，T2代种子播种后与野生型（WT） 对照同时同条件培养，30天后开始耐旱试验。处理第3天和第6天分别 拍照观察，耐旱表现如图2所示。结果显示野生型烟草在干旱处理第3 天后开始出现萎蔫现象，第6天萎蔫明显，较转基因植株（PsDREB1） 的生长表现明显衰弱，而转基因植株则表现出较为显著的耐旱特性。

在耐高盐胁迫中，材料准备同耐旱试验。使用300mmol/L浓度的氯 化钠水溶液浸泡同样条件的穴盘苗，1小时后取出计时。观察处理后1天、 3天、6天的抗逆表现。结果发现，野生型烟草在高盐处理1天后，与转 基因烟草一样表现出较为明显的萎蔫现象，但是在第3天和第6天，野生 型烟草的萎蔫程度显著大于转基因烟草，叶片干枯黄化数量明显多于转基 因烟草，显示转基因烟草抗高盐胁迫能力明显高于野生型材料，如图3 所示。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  浙江省萧山棉麻研究所

 

<120>  来源于牡丹的抗逆转录因子PsDREB1及其编码基因与应用

 

<130> 

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  363

<212>  PRT

<213>  Paeonia suffruticosa

 

<400>  1

 

Met Thr Thr Ala Ile Asp Ile Tyr Asn Ser Ala Ser Val Phe Ser Asp

1               5                   10                  15     

 

 

Pro Glu Glu Leu Met Lys Ala Leu Glu Pro Phe Met Lys Gly Ala Ser

            20                  25                  30         

 

 

Ser Ser Phe Ser Leu Pro Ser Leu Ser Ser Phe Ser Leu Ser Pro Ser

        35                  40                  45             

 

 

Thr Ser Leu Pro Pro Ser His Phe Ser Pro Ile Ser Ser Gln Pro Asn

    50                  55                  60                 

 

 

Leu Tyr Ser Asp Phe Cys Ser Pro Ser Thr Thr His Met Phe Ser Gln

65                  70                  75                  80 

 

 

Gly Cys Ser Ser Phe Asp Gln Met Gly Phe Glu Gln Ser Gly Ser Leu

                85                  90                  95     

 

 

Gly Leu Ser His Leu Thr Pro Ser Gln Ile Leu Gln Ile Gln Ala Gln

            100                 105                 110        

 

 

Met His Ile Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ile

        115                 120                 125            

 

 

Ala Ala Met Ala Val Ala Ser Ile Gln Asn Arg Arg Leu Asn Gln Trp

    130                 135                 140                

 

 

Gln His Gln Thr Gln Asn Ser Leu Ser Pro Lys Thr Val Pro Met Lys

145                 150                 155                 160

 

 

His Ala Gly Thr Pro Pro Lys Pro Thr Lys Leu Tyr Arg Gly Val Arg

                165                 170                 175    

 

 

Gln Arg His Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Leu Pro Lys Asn

            180                 185                 190        

 

 

Arg Thr Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Asp Thr Ala Glu Glu Ala Ala

        195                 200                 205            

 

 

Leu Ala Tyr Asp Arg Ala Ala Tyr Lys Leu Arg Gly Asp Tyr Ala Arg

    210                 215                 220                

 

 

Leu Asn Phe Pro His Leu Arg Ser His Ile Ala Gly Asp Phe Gly Gly

225                 230                 235                 240

 

 

Asp Tyr Lys Pro Leu His Ser Ser Val Asp Ala Lys Leu Gln Ala Ile

                245                 250                 255     

 

 

Cys Gln Ser Met Ala Ile Ser Gln Lys Gln Gly Ser Ser Glu Arg Pro

            260                 265                 270        

 

 

Gly Phe Val Ser Asp Thr Lys Ser Ile Ala Pro Leu Val Pro Ser Gln

        275                 280                 285             

 

 

Ala Lys Met Val Ser Glu Val Glu Leu Gln Arg Pro Lys Leu Glu Asp

    290                 295                 300                

 

 

Cys Lys Val Glu Pro Glu Thr Phe Ser Ser Pro Ser Val Ser Asp Glu

305                 310                 315                 320

 

 

Ser Ala Gly Ser Ser Pro Gln Ser Asp Ile Thr Phe Phe Asp Phe Thr

                325                 330                 335    

 

 

Glu Ser Ser Gln Leu Gly Asp Glu Cys Asp Asn Leu Met Leu Gln Lys

            340                 345                 350        

 

 

Phe Pro Ser Val Glu Ile Asp Trp Glu Ala Ile

        355                 360            

 

 

<210>  2

<211>  1092

<212>  DNA

<213>  Paeonia suffruticosa

 

<400>  2

atgtggctcg gcacatttga tacggctgaa gcatcagttt tctcagatcc cgaagagctc       60

 

atgaaagcac ttgaaccttt tatgaagggt gcttcttcat ccttttccct gccttctctt      120

 

tcttcttttt cactatctcc ctctacttca ttaccccctt ctcatttctc tcctatctct      180

 

tctcagccca acttgtattc tgatttttgc tcaccatcga ccacccatat gttttctcaa      240

 

gggtgttcga gctttgacca aatgggtttt gagcaatcag gttcattagg gctaagccac      300

 

cttaccccat ctcagatctt gcaaattcaa gcccaaatgc acatccaaca acaacaacag      360

 

cagcagcaac agcaacagca gatagctgcc atggctgtag catcaattca gaaccggagg      420

 

ctaaaccaat ggcaacacca aacccagaat tctctcagcc ccaaaactgt tcctatgaag      480

 

catgctggaa ctcctccaaa gcccacaaag ctttacagag gagtgaggca gaggcattgg      540

 

ggaaaatggg ttgcagagat cagactccca aagaaccgta ctcgtctttg gctcggcaca      600

 

tttgatacgg ctgaagaagc agccctggct tatgacaggg ctgcttataa gcttagagga      660

 

gactatgcca gattgaactt cccacacctc cgatctcaca ttgcaggtga ctttggcggc      720

 

gattacaagc ctcttcattc ctcagtcgac gccaagcttc aagcgatttg ccagagcatg      780

 

gctatttcgc agaaacaggg gagttcggag aggcctggtt ttgtatctga taccaagtca      840

 

attgcgccac ttgttccttc tcaggcgaag atggtgtcgg aagttgaatt gcagcgtcca      900

 

aaattagagg attgtaaggt ggagccggag acattctcgt cgccgtctgt atctgacgaa      960

 

tcggcaggtt cttcgcctca atcggatatt acgttctttg atttcacgga gtcgtcgcag     1020

 

ttgggggatg agtgtgataa cttaatgctg cagaagtttc aggatattga gcgagtaaaa     1080

 

gaggctatct aa                                                         1092