一种快速鉴定鸭甲肝病毒血清型的双重RT-PCR方法

摘要

本发明涉及一种快速鉴定鸭甲肝病毒血清型的双重RT-PCR方法，是分别合成针对鸭甲肝病毒1型特异性引物SEQ1和SEQ2和针对鸭甲肝病毒3型特异性引物SEQ3和SEQ4，以待检样品RNA为模板，以SEQ1和SEQ3为引物反转录获得病毒cDNA，以上述两对引物为双重引物，以病毒cDNA为模板，在同一反应体系中进行PCR反应，可同时完成对鸭甲肝病毒1型和鸭甲肝病毒3型的快速鉴定。本发明根据RT-PCR技术原理，根据鸭甲肝病毒基因型与血清型相对应以及我国大陆地区只有两种血清型鸭甲肝病毒的特点，建立了双重RT-PCR检测方法，其简单、快速、特异性好、灵敏度高，可以用于1型和3型鸭甲肝病毒的快速血清型鉴定。

说明书

（一）技术领域

本发明所涉及一种用于快速鉴定鸭甲肝病毒血清型的双重RT-PCR方法，属于病毒分子生物学领域。

（二）背景技术

鸭甲型肝炎病毒(DuckhepatitisAvirus,DHAV)包括三个基因型和血清型：鸭甲肝病毒1型（DHAV-1）、 鸭甲肝病毒2型（DHAV-2）和鸭甲肝病毒3型（DHAV-3），三个血清型之间几乎无交叉保护。近年来，我 国鸭病毒性肝炎的病原日趋复杂化，研究表明目前大陆地区未检测到DHAV-2，但普遍存在DHAV-1和 DHAV-3的混合感染，给养鸭业生产造成严重的经济损失。

目前鸭病毒性肝炎的鉴定主要依靠流行病学调查、临床症状和病理变化，但不同鸭甲肝病毒引起的鸭 病毒性肝炎在流行病学、临床症状和病理变化方面极为相似，特别是两种或多种病毒混合感染时，依靠上 述方法和手段难以确定病毒类型。有效控制鸭病毒性肝炎的关键是要明确鸭肝炎病毒的血清型，因此，加 强鸭甲肝病毒不同血清型鉴定技术的研究对预防和控制鸭病毒性肝炎具有重要的现实意义。传统的病毒血 清型鉴定需要分离培养获得纯化的病毒，通过单因子血清进行鉴定，这种方法费事费力，对于多重感染的 鉴定难以进行。多重PCR方法在检测多种病原微生物感染时具有省时省力、简单快速、敏感、特异的优点， 已在多种病毒的鉴定与检测中得到了广泛应用，但PCR方法鉴定的基础是依据病原的基因型来进行的。目 前的研究表明，不同鸭甲肝病毒的基因型与血清型相对应，因此可以通过基因型的检测来完成对鸭甲肝病 毒血清型的鉴定。目前我国鸭群中以DHAV-1和DHAV-3的单重及混合感染最为常见，应用多重RT-PCR方法 检测鸭甲肝病毒的方法已有建立，但这些方法存在敏感性低（黄秋雪等，鸭甲肝病毒基因A型和C型双重 RT-PCR检测方法的建立，2012，34（2）：120-123，最低检测灵敏度：DHAV-A为4.98×10⁴拷贝/μl和DHAV-C 为1.68×104拷贝/μl；何冉娅等，Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒鉴别RT-PCR检测方法的建立，黑 龙江畜牧兽医，2009，3:14-16，最低检测灵敏度：DHAV-A为0.8ng/μl和DHAV-C为1.0ng/μl），或者不能适 用于目前生产中所有流行毒株的检测的缺点（Kim等，2008，Differential diagnosis between type-specific duck  hepatitis virus type1(DHV-1)and recent Korean DHV-1-like isolates using a multiplex polymerase chain  reaction，2008，Avian Pathology,37:171-177）。

（三）发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种快速鉴定鸭甲肝病毒血清型的双重RT-PCR方法，本发明设计 并筛选了新的特异性引物，优化了反应过程中的各种参数，建立的针对鸭甲肝病毒的双重RT-PCR分型方 法特异性强、敏感性更高，可以快速准确地进行DHAV-1和DHAV-3的鉴定。

一种快速鉴定鸭甲肝病毒血清型的双重RT-PCR方法，包括以下步骤：

A、通过对参考GenBank上已发表的DHAV-1和DHAV-3的序列进行比对，选择在DHAV-1和DHAV-3 的多聚蛋白基因（polyprotein gene）的保守区分别设计一对针对DHAV-1的特异性引物SEQ1/SEQ2和一 对针对DHAV-3的特异性引物SEQ3/SEQ4。

SEQ1：5’-CAA CTC GAC CAA TH(T/C/A)C CTG G-3’，

SEQ2：5’-CCT GR(A/G)T GR(A/G)A CCA TTG TR(A/G)A CTG-3’，

SEQ3：5’-GAAATC TGCACT CAATGGAGAG-3’，

SEQ4：5’-CCC AGG AAA TGA TTG GTC AG-3’。

所有引物以无菌ddH2O（Rnase free）配成25pmol/μl的浓度备用。

B、常规方法提取待测鸭肝组织总RNA作为模板，进行反转录反应。反应体系为：模板RNA4μl，SEQ 1和SEQ3引物各1μl，5×M-MLVBuffer2μl，dNTPs（10.0mM）0.5μl，RnaseInhibition0.25μl，RTaseM-MLV (5U/μl)0.5μl，ddH₂O（Rnase free）0.75μl。反应程序为：42℃保存60min，70℃15min，获得病毒cDNA。

C、以病毒cDNA为模板进行PCR反应。反应体系为：35.1μl ddH₂O（Rnase free），5μl Buffer，3μl dNTPs （10.0mM），SEQ1和SEQ2各1.2μl，SEQ3和SEQ4各1.0μl，2μl cDNA模板，0.5μl Taq酶。PCR反应 条件为：95°C5min；95°C50s，60°C50s，72°C40s，30个循环；72°C10min。

D、对步骤C得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测：

如果从样品中只扩增出了492bp的产物，则该样品为DHAV-1阳性，DHAV-3阴性；如果从样品中只 扩增出了286bp的产物，则该样品为DHAV-3阳性，DHAV-1阴性；如果同时扩增出了286bp和492bp的 产物，则该样品为DHAV-1和DHAV-3亚型同时存在；如果未扩增出了286bp和492bp的产物，则该样品 不含有DHAV-1和DHAV-3。

本发明的双重RT-PCR方法最低可检测到10pg的组织总RNA和102个拷贝DHAV-1和DHAV-3的病 毒RNA，表明本方法具有很高的灵敏性。

用建立的双重RT-PCR方法对山东、河南、河北、四川、广东、江苏六个省24个鸭场送检的52只分 离到DHAV-1或/和DHAV-3的雏鸭肝组织进行检测，结果发现所有样品的检测结果与病毒分离培养检测结 果符合率为100%，说明本发明建立的双重RT-PCR方法适合于1型和3型鸭甲肝病毒的快速鉴定。由于 本方法可以通过一次RT-PCR完成对DHAV-1和DHAV-3的鉴定，可快速鉴定鸭甲肝病毒血清型。

（四）附图说明

附图1单重RT-PCR的特异性检测结果

M,DL5000；1-3,用引物SEQ1/SEQ2分别扩增DHAV-1感染鸭，DHAV-3感染鸭，健康鸭肝组织RNA； 4-6,用引物SEQ3/SEQ4分别扩增DHAV-3感染鸭，DHAV-1感染鸭，健康鸭肝组织RNA

附图2双重RT-PCR的特异性检测结果

M,DL5000；1,DHAV-1,DHAV-3；2,DHAV-1；3,DHAV-3；4,AIV；5,NDV；6,DEV；7,DuCV；8,RA； 9,E.coli；10,阴性对照

附图3双重RT-PCR针对DHAV感染鸭肝脏总RNA的敏感性检测结果

M,DL5000；1-7,分别为1μg-1pg DHAV-1和DHAV-3混合感染鸭肝组织RNA

附图4双重RT-PCR针对DHAV模板RNA的敏感性检测结果

M,DL2000；1-10,分别为10¹⁰-10¹拷贝的DHAV-1和DHAV-3模板RNA

（五）具体实施方式

1引物设计

通过对参考GenBank上已发表的DHAV-1和DHAV-3的序列进行比对，选择在DHAV-1和DHAV-3 的多聚蛋白基因（polyprotein gene）的保守区分别设计一对针对DHAV-1的特异性引物SEQ1/SEQ2和一 对针对DHAV-3的特异性引物SEQ3/SEQ4，利用常规方法对两种病毒样品进行扩增。

SEQ1：5’-CAA CTC GAC CAA TH(T/C/A)C CTG G-3’，

SEQ2：5’-CCT GR(A/G)T GR(A/G)A CCA TTG TR(A/G)A CTG-3’，

SEQ3：5’-GAAATC TGCACT CAATGGAGAG-3’，

SEQ4：5’-CCC AGG AAA TGA TTG GTC AG-3’。

DHAV-1引物扩增片段大小为492bp，DHAV-3引物扩增片段大小为286bp。所有引物以无菌ddH₂O （Rnase free）配成25pmol/μl的浓度备用。

2RNA提取

使用常规方法提取DHAV感染雏鸭肝组织的总RNA作为模板。

3单一RT-PCR

（1）反转录（RT）：反应总体积为10μl，其中包括上述模板RNA4μl，SEQ1和SEQ3各1μl，5×M-MLV Buffer2μl，dNTP Mixture（10.0mM）0.5μl，Rnase Inhibition0.25μl，RTase M-MLV(5U/μl)0.5μl，ddH₂O （Rnase free）0.75μl。

反应程序为：42℃保存60min，70℃15min，得到的cDNA4℃保存备用。

（2）单重PCR：反应总体系为50μl，包括37.5μl ddH₂O（Rnase free），5μl10×PCR Buffer，3μl dNTPs （10.0mM），DHAV-1或DHAV-3上下游引物各1.0μl，2μlcDNA模板，0.5μl Taq酶。PCR反应程序为： 95°C5min；95°C50s，60°C50s，72°C40s，30个循环；72°C10min。

（3）分别用设计的DHAV-1和DHAV-3引物对DHAV-1阳性、DHAV-3阳性和阴性病料进行单重PCR 扩增，以检测引物的特异性。对单重PCR产物进行电泳，结果表明，设计的两对引物只能分别针对DHAV-1 和DHAV-3进行特异性扩增（见图1）。

4双重RT-PCR条件的优化

在单重RT-PCR的基础上，对引物、dNTPs、Buffer的浓度，及退火温度等参数进行优化，得到双重 RT-PCR最佳反应体系和反应程序。

（1）反转录：反应总体积为10μl，其中包括待测样品组织RNA4μl，SEQ1和SEQ3各1μl，5×M-MLV Buffer2μl，dNTPs（10.0mM）0.5μl，Rnase Inhibition0.25μl，RTase M-MLV(5U/μl)0.5μl，ddH₂O（Rnase free） 0.75μl。反应程序为：42℃保存60min，70℃15min，得到病毒cDNA。

（2）双重PCR：以上述得到的病毒cDNA为模板，反应总体积为50μl，最佳反应体系为：35.1μl ddH₂O （Rnase free），5μl10×PCRBuffer，3μl dNTPMixture（10.0mM），DHAV-1引物各1.2μl，DHAV-3引物各 1.0μl，2μl cDNA模板，0.5μl Taq酶。

PCR反应程序为：95°C5min；95°C50s，60°C50s，72°C1min10s，30个循环；72°C10min。

5特异性试验

以DHAV-1、HAV-3、新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV/H9）的cDNA，鸭瘟病毒(DVE)、鸭圆 环病毒（DucV）的病毒DNA，鸭疫里默是杆菌（Ra）、大肠杆菌（E.coli）的菌株为模板分别用上述优化 的条件进行双重PCR反应，同时用DHAV-1、DHAV-3混合感染的cDNA做阳性对照，用健康鸭肝提取的 cDNA做阴性对照进行特异性试验。对多重PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果可知，建立的双重PCR 方法只能特异性的针对DHAV-1、DHAV-3的单独或混合感染进行扩增，对其他家禽常发病的病原扩增为 阴性，可作为特异性鉴定DHAV-1和DHAV-3的快速方法（见图2）。

6敏感性试验

以提取组织病料的总RNA为模板进行单重和双重PCR对每种病毒的检测灵敏度测定。用紫外分光光 度计对含有DHAV-1,DHAV-3目的片段的RNA模板进行260nm/280nmOD值的测定，计算出纯度和含量， 将模板10倍梯度稀释，取每个稀释度的模板分别进行单重或多重RT-PCR反应。结果可知，该多重RT-PCR 方法最低可检测到10pg的组织总RNA，与单重RT-PCR方法的检测灵敏度一致（见图3）。

应用SP6启动子对扩增片段进行体外转录的方法获得纯RNA片段后，对RNA片段进行定量，计算 出纯度和含量，将模板10倍梯度稀释，取每个稀释度分别进行多重RT-PCR反应。结果可知该RT-PCR方 法最低可检测到102个拷贝的病毒RNA（见图4）。

7临床样本检测

用建立的双重RT-PCR方法对山东、河南、河北、四川、广东、江苏六个省24个鸭场送检的52只分 离到DHAV-1或/和DHAV-3的雏鸭肝组织进行检测，结果发现所有样品的检测结果与病毒分离培养检测结 果符合率为100%，说明本发明建立的双重RT-PCR方法适合于DHAV-1和DHAV-3的快速鉴定。